一种近平滑假丝酵母菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种近平滑假丝酵母菌株及其应用。


背景技术：

2.人体皮肤上栖息着各种细菌、真菌、病毒，还有螨虫等小型节肢动物，它们的集合形成皮肤微生物组或皮肤菌群。皮肤微生物组与皮肤表面的细胞、汗液、皮脂等物质，以及外界环境共同组成一个生态系统，对于维持宿主皮肤健康有重要作用。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖；还可分解角质细胞碎屑或脂质，辅助乳化皮脂膜，维持表皮酸性环境，以抵御外界病原菌定殖。
3.近年来研究发现，皮肤能分泌一些具有抗菌作用的蛋白和多肽，这些抗菌作用的多肽称为抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)，它是—类天然免疫系统的效应分子，能够接触微生物膜，溶解细胞，具有广谱抗微生物作用。此外，它们还参与干扰细胞增殖、免疫应答、伤口愈合、细胞因子释放、白细胞趋化、蛋白酶抗蛋白酶平衡等反应过程。
4.amps表达和分泌的调控：amps基因的表达受到细微调控，宿主防御反应引起amps在上皮组织或炎细胞表达增加。不同的微生物刺激机体的免疫系统产生不同的抗微生肽谱，这些肽类受toll信号等途径调节。宿主的天然免疫系统对抗病原微生物时能产生一个广泛防御动员机制，包括与病原体相关分子的识别、相适应的免疫性刺激和宿主防御物质的分泌。此外，amps在炎症损伤、维护细胞功能和血管增生等方面也起一定的作用。
5.皮肤微生物组在皮肤表面合成具有活性的代谢产物，如短链脂肪酸、b族维生素等，调节皮肤生理功能。越来越多的研究表明，皮肤微生态失衡(又称菌群失衡)会导致一系列皮肤疾病，如特应性皮炎、痤疮、脂溢性皮炎、银屑病、机会性感染等。当有益菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种近平滑假丝酵母菌株及其应用。
7.本发明提供了近平滑假丝酵母菌株(candida parapsilosis)，该菌株为近平滑假丝酵母菌株labofmic-310，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为cctcc no:m 20221393的近平滑假丝酵母菌株。
8.本发明的另一目的在于提供了上述近平滑假丝酵母菌株在制备改善肌肤状况的产品中的应用。
9.在一些实施方式中，所述改善皮肤状况为促进细胞增殖、修护皮肤屏障、抗衰老、提高细胞抗菌能力中的至少一种。
10.在一些实施方式中，所述促细胞增殖包括促进成纤维细胞增殖的作用。
11.在一些实施方式中，所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因的表达；所述
屏障修护相关基因为flg、ivl和ocln中的至少一种；
12.所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括col1a1、ln、col13a1、sptssa、mkx和col3a1中的至少一种；
13.所述抗衰老为上调抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达；
14.所述抗衰老为上调细胞自噬相关基因lc3b的表达；
15.所述抗衰老为上调细胞抗氧化相关基因nrf2、sirt1、sirt3的表达
16.所述抗衰老为上调免疫调节因子相关基因mor的表达
17.所述抗衰老为上调细胞生长因子相关基因vegf、fgf1、fgf2、fgf21、hgf的表达。
18.在一些实施方式中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因包括mmp家族中的至少一种；
19.所述抗衰老为下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括bax的表达。
20.在一些实施方式中，所述提高细胞抗菌能力为上调抗菌肽相关基因s100a7、s100a8、lcn-2的表达。
21.在一些实施方式中，所述产品为食品、药品或化妆品。
22.本发明的另一目的在于提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述的近平滑假丝酵母菌株的原料制成。
23.在一些实施方式中，所述产品中的近平滑假丝酵母菌株包括如下(1)或(2)所示的一种或两种：
24.(1)上述的近平滑假丝酵母菌株的菌群和/或菌剂；
25.(2)上述的近平滑假丝酵母菌株的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
26.本发明公开的近平滑假丝酵母菌株labofmic-310，其保藏编号为cctcc no:m 20221393。实验表明，labofmic-310具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、抗衰老、提高细胞抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。
27.生物保藏说明
28.近平滑假丝酵母菌株(candida parapsilosis)labofmic-310，于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为cctcc no:m 20221393。
具体实施方式
29.本发明提供了近平滑假丝酵母菌株及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
30.本发明的近平滑假丝酵母菌株labofmic-310，来源于山东莱杨秋月梨果皮，经真菌its基因序列鉴定为近平滑假丝酵母(candida parapsilosis)。该菌株在显微镜下呈单细胞个体，球形或椭圆形等，未见芽殖及假菌丝；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成粘稠、中央凸起的白色圆形菌落，质地均匀，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最
适生长温度28℃。
31.近平滑假丝酵母(candida parapsilosis)labofmic-310，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年9月9日，保藏编号为cctcc no:m 20221393。
32.进一步，本发明提供的近平滑假丝酵母labofmic-310在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为溶胞物和/或提取物的形式，或为酵母产物的形式或为发酵产物形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵产物、溶胞物。
33.本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
34.实施例1：labofmic-310的分离
35.于秋月梨果皮上采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁琼脂固体平板，28℃恒温培养12-16h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为labofmic-310。
36.革兰氏染色镜检：菌株labofmic-310在显微镜下呈单细胞个体，呈球形或椭圆形等，未见芽殖及假菌丝；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成粘稠、中央凸起的白色圆形菌落，质地均匀，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃。
37.实施例2：labofmic-310的核酸鉴定
38.1、真菌its基因序列分析：
39.挑取单菌落置麦芽汁液体培养基中，28℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照酵母基因组dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用酵母菌通用引物its1，its4，进行pcr扩增体系为15μl体系，95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延伸7min。
40.2、结果
41.pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出labofmic-310菌株为近平滑假丝酵母(candida parapsilosis)。
42.实施例3：labofmic-310促进hacat屏障修护相关基因表达实验
43.1、labofmic-310发酵产物的制备：
44.挑取近平滑假丝酵母labofmic-310单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16～18h，酶标仪检测并以pbs稀释调整od
600
＝0.2，12000转离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min高压灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。
45.2、促进hacat屏障修护相关基因表达实验
46.接种人永生化角质形成细胞hacat(2ml/孔，内含5
×
105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入发酵产物5％(v/v)，(对照组以等体积pbs替代发酵产物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测flg、ivl和ocln基因的表达。分别以添加等体积pbs处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。
47.公式：f＝2-δδct
，其中：
48.△
ct
实验
＝ct
实验-ct
内参(实验)
；
49.△
ct
对照
＝ct
对照-ct
内参(对照)
；
50.△△
ct＝
△
ct
实验
‑△
ct
对照
。
51.结果见下表：
52.labofmic-310发酵产物上调修复基因的表达
[0053][0054]
体外细胞实验表明，本发明的近平滑假丝酵母labofmic-310发酵产物具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因flg，内皮蛋白基因ivl和紧密连接蛋白基因ocln表达的作用，基因表达量上调1.13～1.85倍。表明labofmic-310具有促进皮肤屏障修护的作用。
[0055]
实施例4：labofmic-310调节光老化hacat细胞外基质/细胞自噬/抗氧化/生长因子相关基因表达实验
[0056]
1、labofmic-310发酵产物及溶胞物制备：
[0057]
挑取近平滑假丝酵母labofmic-310单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16～18h，酶标仪检测并以pbs稀释调整od
600
＝0.2，12000转离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min高压灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。离心沉淀菌体以pbs清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以pbs重悬至离心时体积，再以超声波破碎20分钟，121℃，30min高压灭活，即得溶胞物。
[0058]
2、hacat细胞制备及紫外线损伤
[0059]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb照射损伤。
[0060]
3、labofmic-310添加
[0061]
将发酵产物5％(v/v)、溶胞物10％(v/v)分别加入刺激过的hacat细胞(对照组分别以等体积pbs替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0062]
4、qpcr法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化/生长因子相关基因相对表达倍数
[0063]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因col1a1，细胞自噬相关基因lc3b，抗氧化相关基因nrf2以及生长因子vegf的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0064]
发酵产物上调细胞外基质相关基因col1a1，细胞自噬相关基因lc3b和抗氧化相关基因nrf2。结果见下表：
[0065][0066]
溶胞物上调细胞自噬相关基因lc3b，抗氧化相关基因nrf2以及细胞生长因子vegf。结果见下表：
[0067][0068]
体外细胞实验表明，本发明的近平滑假丝酵母labofmic-310具有上调hacat细胞外基质相关的i型胶原α1链基因col1a1，细胞自噬相关微管相关蛋白1轻链3β基因lc3b，抗氧化相关核因子e2相关因子2基因nrf2以及细胞生长因子相关血管内皮生长因子基因vegf表达的作用，基因相对表达倍数1.15～1.76。
[0069]
实施例5：labofmic-310促进人成纤维细胞hff的增殖
[0070]
1、labofmic-310溶胞物制备：
[0071]
制备方法参照实施例4。
[0072]
2、hff细胞制备及labofmic-310添加
[0073]
接种以dmem培养的hff细胞，以100ul/孔(每孔含3
×
104细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μm h2o2，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，pbs清洗两次，加入100μl新培养基，各孔添加溶胞物10％(v/v)，(对照组以等体积pbs替代溶胞物)。培养24h。向每孔加入10μl的cck-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度a。
[0074]
计算公式及结果如下表：
[0075]
labofmic-310促进hff细胞增殖
[0076][0077]
体外细胞实验表明，本发明的近平滑假丝酵母labofmic-310具有促进人成纤维细胞hff增殖的作用，增殖率25.17％～32.43％。
[0078]
实施例6：labofmic-310调节氧化损伤hff细胞外基质/免疫调节因子/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因表达实验
[0079]
1、labofmic-310发酵产物及溶胞物制备：
[0080]
制备方法参照实施例4。
[0081]
2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
[0082]
将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
[0083]
3、labofmic-310添加
[0084]
将发酵产物5％(v/v)、溶胞物10％(v/v)分别加入刺激过的hff细胞(对照组分别以等体积pbs替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0085]
4、qpcr法检测细胞外基质/免疫调节因子/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因相对表达倍数
[0086]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因ln、sptssa、col13a1、mkx和col3a1，抑制细胞凋亡相关基因bcl-2，抗氧化相关基因sirt-1和sirt-3，免疫调节因子相关基因mor，细胞生长因子相关基因fgf1、fgf2、fgf21、hgf，以及降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因bax的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0087]
发酵产物上调细胞外基质相关基因ln、col13a1和sptssa，抑制细胞凋亡基因bcl-2，抗氧化相关基因sirt-1，免疫调节因子相关基因mor，细胞生长因子相关基因fgf21；下调降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因bax，结果见下表：
[0088][0089]
溶胞物上调细胞外基质相关基因sptssa、mkx和col3a1，免疫调节因子相关基因mor，抗氧化相关基因sirt-3，抑制细胞凋亡基因bcl-2，细胞生长因子相关基因hgf、fgf1、fgf2；下调降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因bax，结果见下表：
[0090][0091]
体外细胞实验表明，本发明的近平滑假丝酵母labofmic-310具有上调hff细胞外基质相关的层粘连蛋白ln、xiii型胶原α1链基因col13a1、丝氨酸棕榈酰转移酶基因sptssa、莫霍克蛋白基因mkx，和iii型胶原α1链基因col3a1，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因mor，抑制细胞凋亡相关的b淋巴细胞瘤-2基因bcl-2、抗氧化相关的sirtuins蛋白家族基因sirt-1和sirt-3以及细胞生长因子相关成纤维细胞生长因子基因fgf1、fgf2、fgf21、肝细胞生长因子基因hgf表达的作用，基因相对表达倍数1.15～2.49倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp，细胞凋亡相关的bcl2-associated x蛋白基因bax，基因相对表达倍数0.43～0.80。
[0092]
实施例7：labofmic-310上调hacat抗菌肽相关基因表达实验
[0093]
1、labofmic-310发酵产物及溶胞物制备：
[0094]
制备方法参照实施例4。
[0095]
2、hacat细胞制备
[0096]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0097]
3、labofmic-310添加及lps刺激
[0098]
将发酵产物5％(v/v)、溶胞物10％(v/v)分别加入培养过夜的hacat细胞(对照组分别以等体积pbs替代发酵产物/溶胞物)。2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
[0099]
4、qpcr法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
[0100]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测s100a7、s100a8、lcn-2基因的表达。以等体积pbs处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0101]
发酵产物上调抗菌肽相关基因s100a7、s100a8，结果见下表：
[0102][0103]
溶胞物上调抗菌肽相关基因s100a7、s100a8、lcn-2。结果见下表：
[0104][0105]
体外细胞实验表明，本发明的近平滑假丝酵母labofmic-310具有促进抗菌肽相关基因银屑病素s100a7、钙粒蛋白a s100a8、脂质运载蛋白-2lcn-2表达的作用，基因相对表达倍数1.18～1.53。表明labofmic-310具有提高细胞抗菌能力的作用。
[0106]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。