一种抗骨质疏松的含松脂醇二葡萄糖苷的组合物及其应用的制作方法

0.4∶0.05-0.25。
11.进一步优选地，所述松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、松脂醇的质量比为1∶0.2-0.4∶0.08-0.2。
12.本发明还提供了一种上述组合物的制备方法，所述的制备方法包括将松脂醇二葡萄糖苷松脂醇单葡萄糖苷、松脂醇组分混合，得到含松脂醇二葡萄糖苷的组合物。
13.本发明还提供了一种上述的组合物或上述的制备方法制备得到的组合物在制备预防或治疗骨质疏松症药物中的应用。
14.优选地，所述的骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症。
15.本发明还提供了一种抗骨质疏松的药物，包括上述的组合物和医药学上可接受的载体。
16.优选地，所述组合物占药物的重量百分比为0.1-70％。
17.进一步优选地，所述的组合物占药物的重量百分比为0.1-50％。
18.优选地，所述的组合物每天的使用剂量为1.0-10mg/kg体重。
19.其中，所述的使用剂量的对象为人的口服剂量。
20.进一步优选地，所述的组合物每天的使用剂量为2.0-8mg/kg体重。
21.优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、粉剂、糖浆、粘胶剂、悬浮剂、针剂、胶囊剂、颗粒剂。
22.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
23.本发明的含松脂醇二葡萄糖苷的组合物对老年性骨质疏松症和卵巢去势雌性大鼠骨质疏松症具有更显著的治疗效果，能够显著的提高骨密度，增强骨小梁的数量，降低骨小梁的分离度，该含松脂醇二葡萄糖苷的组合物安全性好、适合长期服用且组合物的成分明确、质量可控，能够满足临床应用的需要。
附图说明
24.图1为实施例1中骨质疏松大鼠模型μct扫描骨小梁结构图；其中，a：假手术组；b：模型对照组；c：阳性对照组；d：a组；e：b组；f：c组；g：d组；h：e组；i：f组；j：g组；k：h组；l：i组。
具体实施方式
25.以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本技术要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本技术的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本技术要求保护的范围之中。
26.值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。以下原料来源，为示例性说明：
27.阿仑膦酸钠的cas号为121268-17-5；
28.松脂醇二葡萄糖苷的cas号为63902-38-5；
29.松脂醇单葡萄糖苷的cas号为69251-96-3；
30.松脂醇的cas号为487-36-5。
31.本发明中所述的松脂醇二葡萄糖苷的结构式为：
[0032][0033]
所述的松脂醇单葡萄糖苷的结构式为：
[0034][0035]
所述的松脂醇的结构式为：
[0036][0037]
实施例1组合物的药效研究
[0038]
1、实验动物
[0039]
spf级雌性sd大鼠160只，鼠龄7-8周，体重200
±
20g。
[0040]
2、骨质疏松模型的建立
[0041]
选取spf级雌性sd大鼠，7-8周龄，随机抽取10只作为假手术组，通过腹腔注射4％水合氯醛麻醉，除假手术组仅腹部开口不摘除卵巢外，其余150只均进行双侧卵巢切除。术后腹腔注射80万iu/kg青霉素钾，1次/d连续给药7天，防止术后感染。于第5周以小动物双能x射线骨密度体成分分析仪(insight vet dx)测定各大鼠腰椎和股骨的骨密度(bone mineral density,bmd)，剔除骨密度未明显降低的40只大鼠，余下的110只sd大鼠(假手术组10只大鼠不计入内)随机分组，每组10只(n＝10)，普通全价饲料喂养。
[0042]
3、分组及给药剂量
[0043]
假手术组：给予正常饮食，n＝10；
[0044]
模型对照组：给予正常饮食，n＝10；
[0045]
阳性对照组：阿仑膦酸钠，每周服灌胃一次，剂量为6mg/kg,n＝10；
[0046]
a组(松脂醇二葡萄糖苷，70mg/kg,n＝10)
[0047]
b组(松脂醇单葡萄糖苷，70mg/kg,n＝10)
[0048]
c组(松脂醇，70mg/kg,n＝10)
[0049]
d组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.2∶0.25，63mg/kg,n＝10)
[0050]
e组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.4∶0.2，63mg/kg,n＝10)
[0051]
f组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.2∶0.08，63mg/kg,n＝10)
[0052]
g组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.25∶0.05，63mg/kg,n＝10)
[0053]
h组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.3∶0.5，63mg/kg,n＝10)
[0054]
i组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶1∶1，63mg/kg,n＝10)
[0055]
所有分组按各组比例混合，得到相应的组合物。口服灌胃各组药物，连续16周，一日一次，阳性对照组每周给药一次。
[0056]
4.骨密度、骨小梁结构等指标的评价：
[0057]
16周给药周期结束后，麻醉状态下测定大鼠股骨、腰椎骨密度；眼眶取血，测定血清生化指标；处死大鼠，取出股骨，采用micro-ct测定骨小梁结构。通过上述指标评价组合物抗骨质疏松的药效。
[0058]
测定大鼠股骨、腰椎骨密度的仪器为韩国osteosys公司生产的insight vet dxa型双能x射线骨密度仪；测定血清生化指标alp、血磷和血钙的试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，货号分别为a059-2-2、c006-1-1、c004-2-1；测定骨小梁结构的仪器名称为：skyscan1174 x-ray microtomograph(μct)，比利时bruker公司；检测条件为样本扫描参数如下：电压50kv，电流800μa，以12μm扫描分辨率、1304
×
1024视野大小对大鼠股骨进行扫描。
[0059]
5.结果
[0060]
表1给药16周后各组大鼠股骨与腰椎骨的骨密度测定结果(χ
±
sd，n＝10)
[0061]
组别腰椎骨密度(g/cm2)股骨骨密度(g/cm2)假手术组0.231
±
0.0140.282
±
0.014模型对照组0.163
±
0.015
##
0.253
±
0.012
##
阳性对照组0.198
±
0.011*0.272
±
0.010*a组0.196
±
0.010*0.273
±
0.011*b组0.201
±
0.010*0.269
±
0.012*c组0.205
±
0.012*0.271
±
0.013*d组0.232
±
0.008**
▲
0.285
±
0.010**
▲
e组0.231
±
0.011**
▲
0.288
±
0.009**
▲
f组0.229
±
0.012**
▲
0.286
±
0.013**
▲
g组0.230
±
0.012**
▲
0.284
±
0.015**
▲
h组0.198
±
0.015*0.272
±
0.019i组0.201
±
0.014*0.268
±
0.014*
[0062]
注：*表示与模型对照组比较p《0.05；**表示与模型对照组比较p《0.01；
##
表示与假手术组比较p《0.01
▲
表示与阳性对照组比较p《0.05。
[0063]
从表1中可以看出，经过去势手术，雌性大鼠的骨密度显著降低，模型对照组大鼠的腰椎骨和股骨的骨密度分别为0.163
±
0.015和0.253
±
0.012，分别显著低于假手术组的0.231
±
0.014和0.282
±
0.014，表明骨质疏松大鼠模型建立成功。
[0064]
经过16周的连续给药，阳性组阿仑膦酸钠显著提高大鼠腰椎骨和股骨的骨密度到
0.198
±
0.011和0.272
±
0.010，与模型对照组相应骨密度比较，差异有统计学意义(p《0.05)。a组、b组和c组分别为松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷和松脂醇的单一给药组，从骨密度测定结果看，该三个活性成分能显著提高受试大鼠的腰椎骨和股骨的骨密度，其中腰椎骨分别提高到0.196
±
0.010、0.201
±
0.010和0.205
±
0.012，该测定结果与阳性对照药阿仑膦酸钠相当，而股骨的骨密度提高到0.273
±
0.011、0.273
±
0.011和0.269
±
0.012，与模型对照组的股骨骨密度比较，差异有统计学意义(p《0.05)，表明该三个单体活性成分均具有一定的抗骨质疏松作用，活性强度与阳性对照药阿仑膦酸钠相当。进一步采用该三个成分按照一定质量比组成组合物，如d组、e组、f组和g组的受试药物，给药16周后，骨密度测定结果表明该4个组大鼠的腰椎骨骨密度分别为0.232
±
0.008、0.231
±
0.011、0.229
±
0.012和0.230
±
0.012，显著高于模型对照组(p《0.01)，且比阳性对照组高(p《0.05)；而股骨骨密度测定结果也明显提高，结果见表1，d组、e组、f组和g组的股骨骨密度分别为0.285
±
0.010、0.288
±
0.009、0.286
±
0.013和0.284
±
0.015，均高于模型对照组和阳性对照组的大鼠股骨骨密度，表明这四组具有良好的抗骨质疏松作用。本试验中h组和i组含松脂醇二葡萄糖苷的组合物的在松脂醇二葡萄糖苷∶松脂醇单葡萄糖苷∶松脂醇的比例分别为1∶0.3∶0.5和1∶1∶1，经过16周的给药，大鼠腰椎骨和股骨的骨密度较模型对照组对应的骨密度明显提高，统计学差异显著(p《0.05)，但h组和i组大鼠的腰椎骨骨密度0.198
±
0.015和0.201
±
0.014明显低于d组、e组、f组和g组，而h组和i组大鼠的股骨骨密度分别为0.272
±
0.019和0.268
±
0.014，也低于d组、e组、f组和g组大鼠的股骨骨密度，表明当该三个活性成分的组合比例在1∶0.3∶0.5或1∶1∶1时，抗骨质疏松疗效提高不明显。
[0065]
以上结果表明，含松脂醇二葡萄糖苷的组合物的在松脂醇二葡萄糖苷∶松脂醇单葡萄糖苷∶松脂醇＝1∶0.2-0.4∶0.05-0.25的比例范围内显著提高去势后的大鼠骨密度降低，尤其是d组、e组、f组和g组，与阳性药阿仑膦酸钠相比疗效更强。
[0066]
表2给药16周后各组大鼠股骨的骨小梁结构变化(χ
±
sd，n＝10)
[0067]
[0068][0069]
注：*与模型组相比，p＜0.05；**与模型组相比，p＜0.01；
##
与假手术组相比，p＜0.01；
★
与阳性对照组比较，p《0.05。
[0070]
经过去势处理，大鼠的股骨细微结构受到破坏，单位尺寸内骨小梁数量显著减少，骨小梁分离度增加，骨体积分数显著下降。如表2所示，模型对照组的骨体积分数bv/tv降低到17.8
±
2.4％，显著低于假手术组的35.6
±
6.8％，模型组的骨小梁数量tb.n降低到1.58
±
0.33(1/mm)，显著低于假手术组的4.64
±
0.57(1/mm)，而骨小梁分离度显著增加(0.81
±
0.11，与模型组0.34
±
0.04比较，p《0.01)，表明本实验中大鼠骨质疏松模型建立成功。
[0071]
经过16周的给药，阳性组大鼠给予阿仑膦酸钠干预，骨体积分数bv/tv和骨小梁数量tb.n(1/mm)分别提高到27.4
±
5.3％和2.64
±
0.42(1/mm)，二者与模型对照组对应值比较均达到统计学差异，p《0.05，表明阿仑膦酸钠能显著提高单位尺寸内骨小梁的数量；骨小梁分离度是衡量骨微观结构健康的重要参数，经阿仑膦酸钠给药16周，阳性对照组的tb.sp从模型对照组的0.81
±
0.11降低到0.52
±
0.12，差异有统计学意义(p《0.05)。本发明所提供的含松脂醇二葡萄糖苷的组合物为受试药物的给药组d组、e组、f组和g组给药16周后，大鼠股骨骨体积分数和骨小梁数量均显著高于模型对照组(p《0.01)，且高于该组合物中三个
活性成分单用的a组、b组和c组，差异有生物学意义；含松脂醇二葡萄糖苷组合物的d组、e组、f组和g组大鼠的骨小梁分离度显著低于模型对照组，差异有统计学意义。与阳性药阿仑膦酸钠比较，含松脂醇二葡萄糖苷组合物的d组、e组、f组和g组均优于阳性对照组，差异有统计学意义(p《0.05)。而采用松脂醇二葡萄糖苷︰松脂醇单葡萄糖苷︰松脂醇的质量比为1∶0.3∶0.5或1︰1︰1时，对应于本试验中h组和i组，可以看出经16周给药后的大鼠股骨骨体积分数和骨小梁数量及骨分离度均较模型对照组显著改善(p《0.01)，但药效与阳性对照药阿仑膦酸钠相当，且在等剂量下作用强度不及d组、e组、f组和g组，表明含松脂醇二葡萄糖苷组合物只能在一定组合比例下，能显著提升骨质疏松大鼠股骨的骨小梁体积分数和单位长度骨小梁数量，降低骨小梁分离度。
[0072]
表3给药16周后各组大鼠血清生化指标变化
[0073][0074]
[0075]
注：*与模型组相比较p＜0.05，
#
与假手术组相比，p＜0.05。
[0076]
如表3所示，给药16周后，与模型对照组比较，阳性对照组、含松脂醇二葡萄糖苷组合物的d、e、f、g组的大鼠碱性磷酸酶alp的活性均显著降低，表明受试药物与阳性药阿仑膦酸钠均能降低骨质疏松症大鼠的alp。而各试验组大鼠的血磷和血钙均未见明显差异。
[0077]
含松脂醇二葡萄糖苷的组合物具有显著的提高去势雌性大鼠骨密度的作用，显示其抗骨质疏松作用明显。增强骨小梁数量及厚度、降低分离度。显示其具有明显的治疗骨质疏松的作用。
[0078]
实施例2抗老年性雄性大鼠的骨密度降低药效试验
[0079]
1、实验动物
[0080]
spf级雄性sd大鼠180只，鼠龄7-8周，体重(200
±
20)g。
[0081]
2、骨质疏松模型的建立
[0082]
选取雄性sd大鼠，7-8周龄，正常饲料饲养至18个月。采用小动物双能x射线骨密度体成分分析仪(insight vet dx)测定大鼠腰椎和股骨的骨密度(bone mineral density,bmd)，剔除骨密度未明显降低的60只大鼠，余下的120只sd大鼠随机分组，每组10只，普通全价饲料喂养。于试验结束前另购10只雄性sd大鼠，8周龄，作为正常对照组。
[0083]
3、分组及给药剂量
[0084]
正常对照组：给予正常饮食，n＝10；
[0085]
模型对照组：给予正常饮食，n＝10；
[0086]
阳性对照组：阿仑膦酸钠，每周口服灌胃一次，剂量为6mg/kg,n＝10；
[0087]ⅰ组(松脂醇二葡萄糖苷，60mg/kg,n＝10)
[0088]ⅱ组(松脂醇单葡萄糖苷，60mg/kg,n＝10)
[0089]ⅲ组(松脂醇，60mg/kg,n＝10)
[0090]ⅳ组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.2∶0.25，50.4mg/kg,n＝10)
[0091]
ⅴ
组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.4∶0.2，50.4mg/kg,n＝10)
[0092]ⅵ组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.2∶0.08，50.4mg/kg,n＝10)
[0093]ⅶ组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.25∶0.05，50.4mg/kg,n＝10)
[0094]
ⅷ
组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶0.3∶0.5，50.4mg/kg,n＝10)
[0095]
ⅸ
组(松脂醇二葡萄糖苷 松脂醇单葡萄糖苷 松脂醇，1∶1∶1，50.4mg/kg,n＝10)
[0096]
ⅹ
组(cn111686147a中实施例1所述的杜仲石油醚提取物-杜仲乙醇提取物，2∶1，90mg/kg,n＝10)
[0097]
所有分组按各组比例混合，得到相应的组合物，口服灌胃各组药物，连续12个月。一日一次，每次给药时间相同。
[0098]
4.骨密度测定及结果
[0099]
给药12个月结束后，麻醉状态下测定大鼠股骨、腰椎骨密度，评价组合物抗骨质疏
松的药效。
[0100]
测定大鼠股骨、腰椎骨密度的仪器为韩国osteosys公司生产的insight vet dxa型双能x射线骨密度仪。
[0101]
表4给药12个月后各组大鼠股骨与腰椎骨的骨密度测定结果(χ
±
sd，n＝10)
[0102][0103][0104]
注：*表示与模型对照组比较p《0.05；**表示与模型对照组比较p《0.01；
#
表示与正常对照组比较p《0.05；
##
表示与正常对照组比较p《0.01。
[0105]
从表4中可以看出，经过去势，大鼠的腰椎骨密度和股骨骨密度，显著低于正常对照组(p《0.01)，表明大鼠骨质疏松模型建立成功。
[0106]
经过12个月的连续给药，阳性组大鼠给予阿仑膦酸钠干预，腰椎骨密度和股骨骨密度分别提高到0.235
±
0.015和0.288
±
0.014，均高于模型组的腰椎骨密度0.214
±
0.014和股骨骨密度0.254
±
0.018，差异具有统计学意义(p《0.05)，表明阿仑膦酸钠能逆转该模型大鼠的骨密度降低。ⅰ组、ⅱ组和ⅲ组中分别为松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷及松脂醇的单一给药组，给药12个月后，与模型对照组比较，其大鼠的腰椎和股骨骨密度均有一定程度的提高，表明该三个木脂素成分单用具有一定的抗骨质疏松的作用，与阳性药阿
仑膦酸钠比较，该三个化合物提高大鼠腰椎骨和股骨的骨密度程度稍弱，生物学上比阿仑膦酸钠药效低但统计学上未见显著性差异。ⅳ组、
ⅴ
组、ⅵ组和ⅶ组中给予的受试药物分别为松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷及松脂醇这三个成分按照一定比例形成组合物，组合比例分别为1∶0.2∶0.25、1∶0.4∶0.2、1∶0.2∶0.08、1∶0.25∶0.05，经过12个月的持续给药，该四组大鼠的腰椎骨密度分别为0.234
±
0.010、0.237
±
0.014、0.233
±
0.012和0.238
±
0.019，股骨骨密度分别为0.294
±
0.017、0.292
±
0.019、0.298
±
0.016及0.296
±
0.014，均显著高于模型对照组，与阳性对照组比较，抗骨质疏松作用强度相当，与ⅰ组、ⅱ组和ⅲ组的对应骨密度值比较，骨密度提高均达到10％左右，具有生物学意义。
[0107]
三个木脂素类成分按照一定比例组合能够形成更有效的抗骨质疏松协同作用，且松脂醇二葡萄糖苷︰松脂醇单葡萄糖苷︰松脂醇的质量比为1︰0.2-0.4︰0.05-0.25。为进一步验证该比例范围，本试验增加了
ⅷ
组和
ⅸ
组，其所给药物为该三个木脂素成分的比例分别为1∶0.3∶1和1∶0.5∶0.5，连续给药12个月后的大鼠腰椎骨密度和股骨骨密度数据见表4，可以看出，
ⅷ
组和
ⅸ
组的大鼠腰椎骨和股骨骨密度均明显高于模型对照组的对应骨密度(除
ⅷ
组的股骨骨密度与模型对照组比较未显示统计学差异)，表明该组合物有抗骨质疏松作用，但与阳性对照组比较，
ⅷ
组和
ⅸ
组的受试药物抗骨质疏松作用不及阿仑膦酸钠，虽无统计学差异，但生物学上较阳性对照组骨密度低，未显示出良好的治疗优势，且与ⅳ组、
ⅴ
组、ⅵ组和ⅶ组比较，
ⅷ
组和
ⅸ
组的抗骨密度降低作用明显减弱，表明在组合物中松脂醇单葡萄糖苷和松脂醇的质量占比显著增加对抗骨质疏松的活性无益。本研究还设置了x组，所采用的受试药物为杜仲石油醚提取物和杜仲乙醇提取物质量比为2∶1的组合物，结果表明x组大鼠在经过12个月的连续灌胃后，其腰椎骨和股骨的骨密度分别为0.220
±
0.016和0.257
±
0.013，二者虽比模型对照组的对应骨密度值明显提高，但不及本发明中所提供的含松脂醇二葡萄糖苷组合物的抗骨质疏松作用，即使在给药剂量显著提高的90mg/kg时，其疗效仍弱于本发明所提供的组合物。
[0108]
总之，本发明提供的组合物在松脂醇二葡萄糖苷∶松脂醇单葡萄糖苷∶松脂醇＝1∶0.2-0.4∶0.05-0.25的比例范围内显著提高去势后的大鼠骨密度降低，与阳性药阿仑膦酸钠相比疗效更显著。
[0109]
上述组合物可以制成片剂、胶囊剂或颗粒剂，具体方法为：称取含松脂醇二葡萄糖苷组合物10g，加入淀粉1.8g，硬脂酸镁0.2g，混合均匀，制粒后制成片剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0110]
上述组合物可以制成胶囊，具体方法为：称取含松脂醇二葡萄糖苷的组合物10g，加入预交化淀粉4g，混合均匀，制粒，过筛，填充胶囊。
[0111]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。