一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用

技术特征：
1.一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pgx-dsred-itrs-ttaa，其特征在于所述的pgx-dsred-itrs-ttaa含有3’itrs-dered-5’itrs元件，其中dsred基因不含有bbsi识别位点，dsred基因序列上、下游分别为pigggbac转座子3’和5'itrs，3’和5'itrs分别引入了bbsi内切酶位点和bsai内切酶位点，且紧邻ttaa序列。2.根据权利要求1所述的用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pgx-dsred-itrs-ttaa，其特征在于所述的pgx-dsred-itrs-ttaa的骨架载体pgx-attp-dsred为以m5-δuast-rpr-frt_dsred质粒为基础，同义突变消除ampr基因中含有的bsai内切酶识别位点所得，m5-δuast-rpr-frt_dsred质粒序列如seq id no.2所示。3.根据权利要求2所述的质粒载体pgx-dsred-itrs-ttaa，其特征在于所述的质粒载体pgx-dsred-itrs-ttaa序列如seq id no.1所示。4.权利要求1-3中任一项所述的质粒载体pgx-dsred-itrs-ttaa的构建方法，其特征在于包含以下步骤：(1)通过同义突变消除骨架载体m5-δuast-rpr-frt_dsred中ampr基因包含的bsai内切酶识别位点获得pgx-attp-dsred；(2)从载体pshd-dsred中扩增获得含3’tr-dered-5’tr序列的片段，含3’tr-dered-5’tr序列的片段中3’tr-dered-5’tr序列直接与ttaa相连接，并在上下游分别引入bsal和bbsl酶切位点以及骨架载体同源序列，3’tr-dered-5’tr序列中dsred基因上不存在bbsi识别位点；(3)步骤(1)获得的pgx-attp-dsred载体经kpni-hf spei双酶切，获得的片段与步骤(2)获得的3’tr-dered-5’tr序列通过多片段同源重组酶进行连接获得质粒载体pgx-dsred-itrs-ttaa。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤(1)通过overlap-pcr引入同义突变ggg
→
ggt，通过上下游hindiii和scai酶切位点切除原载体骨架m5-δuast-rpr-frt_dsred中包含bsai酶切位点的片段，将酶切后的线性片段和点突变的片段通过单片段同源重组酶进行连接。6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤(1)包含以下步骤：(i)hindiii-hf scai-hf双酶切m5-δuast-rpr-frt_dsred载体，回收长度为3318bp的长片段，命名为a；(ii)获得含同义点突变的ampr片段：以m5-δuast-rpr-frt_dsred载体为模板，分别以x33 x28和x29 x35为引物，使用q5高保真酶扩增获得长度为1220bp的片段b和长度为451bp的片段c；以等摩尔数混合的片段b和c为模板，以x33 x35为引物，使用q5高保真酶扩增获得长度为1634bp的片段d；其中引物x33序列为atttaagtgtatacttcggt，引物x28序列为tggagccggtgagcgtggttctcgcggtatcattgca，引物x29序列为tgcaatgataccgcgagaaccacgctcaccggctcca，引物x35序列为ttctcagaatgacttggttg；(iii)连接获得含同义点突变ampr序列的骨架载体pgx-attp-dsred：将片段a和d通过单片段同源重组酶连接，并验证获得载体pgx-attp-dsred。7.据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤(2)包含以下步骤：以pshd-dsred载体为模板，分别以x23 x26和x24 x25为引物，使用q5高保真酶扩增获得长度为926bp的片段f和长度为866bp的片段g；其中引物x23序列为ctagcacatatgcaggtaccggtctcattaaccctag
aaagataatcatat，引物x26序列为ctcccagcccatagtctttttctgcattacggggccg，引物x24序列为gcatggagatctttactagtgaagacggttaaccctagaaagatagtctgcg，引物x25序列为cggccccgtaatgcagaaaaagactatgggctgggag。8.据权利要求7所述的构建方法，其特征在于步骤(3)包含以下步骤：(i)将步骤1获得的新载体pgx-attp-dsred经kpni-hf spei双酶切，回收长度为3133bp的长片段，命名为e；(ii)将所述的片段f、g和e在多片段同源重组酶体系中连接获得含同义点突变dsred序列的载体pgx-dsred-itrs-ttaa。9.权利要求1-3中任一项所述的质粒载体pgx-dsred-itrs-ttaa在构建果蝇基因组无缝编辑所需同源臂供体质粒中的应用。10.一种构建果蝇基因组无缝编辑供体质粒的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)pcr扩增获得5’和3’同源臂，引物序列包含与骨架载体同源的互补序列-ttaa-与目的基因基本互补且引物同义突变的序列；5’和3’同源臂中至少有一条不含有限制性内切酶bbsi、bsai的酶切位点；(2)pgx-dsred-itrs-ttaa载体经bbsi xhoi双酶切，回收长度为4784bp的长片段；(3)将一侧同源臂和步骤(2)中获得的长度为4784bp的载体片段连接后再插入另一侧同源臂；当有一侧同源臂含有限制性内切酶bbsi或bsai的酶切位点时，首先插入不含此2种酶切位点的同源臂，成功以后插入另一侧同源臂；若上下游同源臂均不包含这2种酶切位点，则可任意插入一侧同源臂，成功以后插入另一侧同源臂；同源臂与载体片段连接的方式选自同源重组或t4连接酶连接；优选同源重组。

技术总结
本发明公开了一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体及其构建方法和应用。一种用于果蝇基因组无缝编辑的质粒载体pGX-DsRed-ITRs-TTAA，所述的pGX-DsRed-ITRs-TTAA含有3’ITRS-DeRed-5’ITRS元件，其中DsRed基因不含有BbsI识别位点，DsRed基因序列上、下游分别为pigggBac转座子3’和5'ITRS，3’和5'ITRS引入分别引入了BbsI和BsaI内切酶位点，且紧邻TTAA序列。利用本发明质粒构建果蝇基因组无缝编辑所需同源臂供体质粒，可以将质粒构建从多片段连接改为可以通过单酶切引入同源臂至载体，降低载体构建难度，提高成功率。提高成功率。提高成功率。


技术研发人员：许蕊 王小丽
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：2022.12.14
技术公布日：2023/3/10