一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff及其制备方法与其自组装结构的应用

一种基于fmoc基团诱导的自组装抗菌肽w7ff及其制备方法与其自组装结构的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于fmoc基团诱导的自组装抗菌肽w7ff及其制备方法与其自组装结构的应用。


背景技术：

2.传统抗生素的滥用导致耐药菌株的出现，细菌对抗生素产生耐药性的问题正对全球公共卫生安全造成越来越严重的威胁。因此，开发新型抗生素或抗生素替代品成为了解决细菌产生耐药性问题的首要选择。抗菌肽具有无毒副作用(仅小部分对细胞具有溶血性)、不易产生耐药性、使用无残留、对环境无污染等优点，这些优点使得抗菌肽成为一种非常有前途的抗生素替代物。但抗菌肽在畜牧业的实际应用中，存在着半衰期短、活性低、稳定性差、合成费用高的局限性，为解决这些问题，常用的抗菌肽类似物的设计策略有d型氨基酸的引用、环化及纳米结构的构建。
3.多肽与某些疏水性较高的基团连接获得自组装能力，通过分子间作用力形成稳定的纳米结构。自组装纳米肽的生物学活性较高，有很好的生物相容性和稳定性，在药物载体、抗菌等领域具有良好的应用前景。


技术实现要素：

4.鉴于以上背景，本发明的目的是提供一种基于fmoc基团诱导的自组装抗菌肽w7ff，fmoc基团与七肽重复序列连接，与序列中具有芳香性侧链的色氨酸共同诱导抗菌肽进行自组装形成纳米结构，赋予抗菌肽较好的抑菌活性。
5.本发明所采用的技术方案如下：一种基于fmoc基团诱导的自组装抗菌肽w7ff，其氨基酸序列如seq id no.1所示，分子式如式(i)所示：
[0006][0007][0008]
所述的fmoc基团为9-芴甲氧羰基，序列中苯丙氨酸为d型苯丙氨酸。
[0009]
本发明的另一目的是提供一种具有自组装能力的抗菌肽w7ff的制备方法，步骤如下：
[0010]
(1)fmoc基团连接七肽重复序列，该重复序列“abcdefg”，可形成α-螺旋线圈，其中“a”和“d”位置上的疏水残基选择色氨酸，而其它位置的氨基酸则选择带有正电荷的精氨酸，为多肽提供足够正电荷；引用d型苯丙氨酸进一步提高抗菌肽的稳定性，在保证正电荷和疏水性足够的前提下，fmoc基团与具有芳香性侧链的色氨酸能够共同诱导该序列自组装形成纳米结构；
[0011]
(2)采用固相化学合成法，使用多肽合成仪合成肽树脂，然后经过三氟乙酸切割；
[0012]
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备，命名为抗菌肽w7ff。
[0013]
本发明的另一目的是提供一种基于fmoc基团诱导的自组装抗菌肽w7ff的自组装纳米结构，采用如下方法制得：将如上所述的自组装抗菌肽w7ff置于pb缓冲液中，80℃下孵育1h，临界胶束浓度为70μm，获得自组装纳米结构。
[0014]
本发明的另一目的在于提供如上所述的自组装纳米结构在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
[0015]
进一步的，所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌；所述的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
[0016]
本发明具有如下优点：通过本方法制备的抗菌肽w7ff，fmoc基团与具有芳香性侧链的色氨酸共同诱导七肽重复序列自组装形成纳米结构，合成过程简单，对该抗菌肽进行自组装能力、杀菌活性、溶血活性测定，发现w7ff在pb缓冲液中自组装能力较强。组装后的w7ff在透射电镜下可以观察到清晰的纤维状结构。组装后的w7ff在较低的浓度下对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有很强的杀灭作用，且杀菌效果强于组装前的w7ff；w7ff的溶血率随着肽浓度的增加而升高，浓度小于64μm时溶血率低于10％，在最小抑菌浓度范围内无溶血现象出现，有良好的生物相容性。通过机理试验发现，组装前后的w7ff均作用于细菌细胞膜，发挥抗菌活性。综上所述，本发明的抗菌肽w7ff具有自组装能力，是一条拥有较好抑菌活性的抗菌肽，具有成为抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。
附图说明
[0017]
图1抗菌肽w7ff的反相高效液相色谱图；
[0018]
图2抗菌肽w7ff的质谱图；
[0019]
图3抗菌肽w7ff的在水和pb的1,8-ans荧光光谱图，(a)水环境，(b)pb环境；
[0020]
图4抗菌肽w7ff的临界胶束浓度,(a)水环境，(b)pb环境,；
[0021]
图5抗菌肽w7ff的透射电镜图，(a)水环境，(b)pb环境；
[0022]
图6组装前后w7ff的溶血活性图；
[0023]
图7组装前后w7ff与lps的亲和能力图；
[0024]
图8组装前后w7ff对e.coli atcc25922外膜通透性的影响图。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0026]
实施例1
[0027]
具有7个氨基酸残基的重复序列为“abcdefg”，可形成α-螺旋线圈，其中“a”和“d”位置上的疏水残基选择色氨酸，而其他位置的氨基酸则选择带有正电荷的精氨酸，为多肽提供足够正电荷。引用d型苯丙氨酸进一步提高抗菌肽的稳定性。在保证正电荷和疏水性足够的前提下，fmoc基团与具有芳香性侧链的色氨酸共同诱导该抗菌肽自组装形成纳米结构。所得的抗菌肽命名为w7ff，抗菌肽序列如表1所示。
[0028]
表1抗菌肽w7ff的氨基酸序列
[0029][0030]
实施例2
[0031]
固相化学合成法合成w7ff抗菌肽
[0032]
1、抗菌肽的制备从c端到n端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将fmoc-x(x是每个抗菌肽的c端第一个氨基酸)接入到wang树脂，然后用哌啶脱保护反应30min后，去除哌啶，并用二甲基甲酰胺(dmf)清洗并检测脱保护颜色。再将fmoc-y-trt-oh(9-芴甲氧羧基-三甲基-y，y为每个抗菌肽c端第二个氨基酸)按照多肽中氨基酸的顺序依次从c端合成到n端，直至合成完毕；
[0033]
2、在上述得到的肽树脂中，加入二氯甲烷(dcm)反应30min，用dmf洗涤3遍后检测，确定所有氨基酸已正确连接。将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽。
[0034]
3、使用0.2mol/l硫酸钠(磷酸调节至ph＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，c18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相c18柱进一步纯化，洗脱液a为0.1％tfa/水溶液；洗脱液b为0.1％tfa/乙腈溶液，洗脱浓度为25％b～40％b，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
[0035]
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)为1687.94，抗菌肽的纯度大于95％。
[0036]
实施例3：自组装抗菌肽的表征
[0037]
1、1,8-ans荧光光谱的测定：8-苯胺基-1-萘磺酸盐(1,8-ans)可与多肽疏水核心结合，检测是否具有自组装能力的荧光染料。将多肽储备液(2.56mm)与无菌水或pb缓冲液(10mm,ph＝7.4)混合，获得不同浓度的抗菌肽稀释液，50μl的1,8-ans在避光的条件下与稀释液混合，在激发波长360nm，发射波长420nm-670nm的条件下进行测定荧光值。所得荧光值绘制曲线如图3。
[0038]
2、临界胶束浓度测定:尼罗红染料是一种疏水性荧光探针，常用来检测多肽的临界胶束浓度(cmc)。使用无菌水或pb稀释多肽储备液(2.56mm)至不同浓度，50μl的尼罗红溶液加入到不同浓度的多肽稀释液中，全程避光。用酶标仪在激发波长为550nm，发射波长为600-750nm的条件下检测样品中尼罗红荧光值。以多肽浓度的对数值lgc为横坐标，校正后的平均荧光强度值为纵坐标绘制曲线(如图4)，其交点处所对应的肽浓度为临界胶束浓度。
[0039]
3、自组装抗菌肽微观形态的观察：将多肽储备液(2.56mm)用pb稀释至150μm，80℃水浴锅孵育1h，获得组装肽。用移液枪吸取10μl滴到铜网上，静置约2min，用滤纸轻轻吸走多余液体，让残余的多肽溶液自然干燥约2min，然后加入10μl磷钨酸进行染色，3min后，用滤纸小心去除多余的染色溶液。使用透射电镜观察多肽的纳米结构(如图5)。
[0040]
抗菌肽的自组装表征试验表明，在1,8-ans荧光光谱测定中，w7ff在水中和pb缓冲液两种环境中均可引起ans荧光强度增加，并伴随着蓝移现象。在pb环境中，w7ff的荧光值更高，说明多肽在pb缓冲液中更容易发生聚集。临界胶束浓度试验中，w7ff在水中的荧光值基本保持不变，没有出现拐点，而在pb缓冲液下，在w7ff的浓度大于70μm时，尼罗红荧光强度开始增加，出现拐点。这表明多肽形成稳定纳米结构的最小浓度(即cmc值)为70μm。使用透射电镜观察组装肽在150μm浓度下的纳米结构，可以明显看到组装后的w7ff在pb缓冲液中形成了明显的纤维状结构。
[0041]
实施例4：抗菌肽生物学活性的测定
[0042]
1、抗菌活性的测定：通过测定抗菌肽的最小杀菌浓度(lc)来了解抗菌肽自组装前后杀菌活性变化。细菌在摇速为220rpm，温度为37℃的摇床中孵育过夜，第二天转移至新的、无菌的mhb中培养至细胞生长的对数期。使用分光光度计将细菌的od
600nm
值调至0.4左右，使用pb将细菌稀释1000倍，并添加到50μl含有不同浓度抗菌肽的pb中，在37℃下孵育2h。孵育结束后，从每个孔中吸取50μl，用无菌pbs连续稀释至10-1
、10-2
和10-3
，分别取10μl涂布于mha固体培养基上,在37℃下孵育18h后取出计数。测试进行3次重复，每个重复两个平行。检测结果见表2。
[0043]
表2抗菌肽w7ff的杀菌活性(μm)
[0044][0045]
通过表2可以看出，组装前后的w7ff杀菌活性有较大差距。组装前的w7ff在64μm时对革兰性阴性菌仍无杀菌效果。相较于组装前，组装后的w7ff对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的杀菌活性明显提高了2-8倍。表明了组装后的w7ff对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有较好的杀菌活性。
[0046]
2、溶血活性的测定：取健康人的新鲜血液1ml，1000g离心5min，收集红细胞；用pbs缓冲液洗涤3遍，再用10ml pbs重悬；按比例在红细胞中添加pbs，使阳性对照的值在1左右。取50μl红细胞悬液与50μl用pbs溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心10min；取50μl上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μl pbs作为阴性对照；50μl红细胞加50μl 0.1％tritonx-100作为阳性对照。检测结果见图6。
[0047]
通过图6可以看出组装前后的w7ff的溶血率无明显变化。随着抗菌肽浓度增加，w7ff的溶血率随之升高。w7ff的溶血率在浓度小于64μm时低于10％，在最小抑菌浓度范围
内无溶血现象出现，说明组装前后w7ff均有良好的生物相容性。
[0048]
实施例5：自组装抗菌肽的抑菌机制
[0049]
1、lps的亲和能力测定：采用bodipy-tr-cadaverine染料替代法检测抗菌肽与lps的结合亲和力。将50μg/ml lps(e.coli o111:b4)与5μg/ml bc染料在tris缓冲液中孵育4小时后，将不同浓度的肽与等体积的lps-bc混合液在96孔板上混合，注意避光。用荧光分光光度计检测各孔荧光值，激发波长为580nm，发射波长为620nm。使用以下公式计算相对荧光强度百分比％δf(au)：
[0050][0051]fobs
是在多肽存在的条件下测到的荧光值，f0是lps探针溶液荧光值，f
100
是加入10μg/ml多粘菌素b产生的荧光值。每个处理设置三个平行重复，本试验独立重复三次。
[0052]
通过对自组装抗菌肽的抑菌机制研究发现，组装前后的w7ff与lps的结合能力均呈现剂量依赖关系。相较于组装前，组装后的w7ff表现出更好的lps结合能力。说明组装后的w7ff能与细菌细胞壁上的lps结合，进一步插入膜中。
[0053]
2、细菌外膜通透性的测定：使用细胞外膜敏感性荧光染料npn来检测抗菌肽对e.coli atcc25922外膜的影响。将e.coli atcc 25922培养至对数生长期后离心(5000g，5min)收集菌体，用5mm hepes缓冲液(含5mm葡萄糖，ph＝7.2)冲洗3遍，重选菌液至od
600nm
＝0.2。加入终浓度为10μm npn，37℃下避光孵育30min。将菌液加入到96孔板，每孔100μl，使用荧光分光光度计检测荧光强度记为f0，加入各种浓度的抗菌肽后立即检测荧光强度至荧光释放稳定记为f
obs
。设激发波长350nm、发射波长420nm。根据下面的公式计算细菌外膜通透性：
[0054][0055]
式中，f
obs
：抗菌肽样品处理组的荧光强度；f0：不加抗菌肽的npn初始荧光强度；f
100
：加入10μg/ml多粘菌素b的npn荧光强度。
[0056]
用荧光染料进一步检测抗菌肽对细菌的外膜通透性，发现组装后的w7ff以剂量依赖性方式破坏了革兰氏阴性菌外膜，且在相同浓度下，组装后的w7ff造成细菌外膜通透性改变的程度优于组装前。
[0057]
综上所述，fmoc基团与可形成α-螺旋线圈的七肽重复序列连接，可与序列中具有芳香性侧链的色氨酸发生协同效应，成功诱导七肽重复序列完成自组装，在pb环境下形成稳定、清晰的纤维状纳米结构；组装后的w7ff对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌具有较好的杀菌活性，且杀菌效果优于组装前。组装前后的w7ff在64μm时溶血率低于10％，在最小抑菌浓度范围内均无溶血现象出现，有良好的生物相容性。通过机理试验发现，组装前后的w7ff作用于细菌细胞膜，发挥抗菌活性。由以上可知，组装后的w7ff具有成为抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。