细胞内相分离的检测方法

1.本发明涉及一种细胞内相分离的检测方法，属于细胞生物学技术领域。


背景技术：

2.相分离是指在细胞中的生物大分子通过弱的相互作用达到某一阈值后，从分离到聚集，形成一个凝集相，类似液滴。一般在细胞内，富集生物大分子液相呈现液滴的结构，具有类似液滴的特征：液滴的球形度高；液滴能够与周围环境快速交换；液滴之间能够融合。这些特征也作为证明发生相分离的证据。细胞在应激状态下或在某些疾病过程中相分离过程也会伴随发生。同时，相分离本身是可逆和可调控的，例如：一旦应激解除，相分离调控的应激颗粒会立即消失。然而，相分离过程并没有通用的检测方法。
3.根据以往的研究结果，在细胞内发生的具有相分离性质的蛋白质均有rna结合能力，相分离形成的凝聚相中均包含细胞rna分子，因此可以通过表征细胞内rna的分布表征相分离的发生。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种细胞内相分离的检测方法，利用rna染料检测细胞质中rna的分布，从而判定细胞质内是否发生相分离。
5.本发明的目的通过以下技术方案实现：
6.一种细胞内相分离的检测方法，其特征在于用rna荧光染料将细胞内rna染色，观察染色后rna的分布，通常rna在细胞体内是均匀分布的，如果细胞质区域内有rna呈液滴状分布，则表明细胞内发生了相分离。
7.优选的，所述rna荧光染料为syto rnaselect green、吖啶橙或碘化丙啶。
8.优选的，其步骤包括：
9.(1)收集待检测的细胞，用乙醇固定细胞；
10.(2)加入rna荧光染料进行染色；
11.(3)将染色后的细胞封片，置于共聚焦显微镜下观察细胞内rna分布情况，如rna呈液滴状分布，则表明细胞内发生了相分离。也可以采用荧光显微镜进行观察，放大倍数在100倍以上。
12.优选的，步骤(3)中先加入防荧光猝灭剂再封片。
13.优选的，步骤(3)中共聚焦显微镜以63倍油镜拍摄细胞内的rna分布情况。
14.本发明提供的细胞相分离的检测方法，通过对细胞内rna染色的方式，即可直观的观察到细胞是否发生相分离，操作简单，可以作为通用的细胞相分离检测方法，应用在生物医疗相关领域。
附图说明
15.图1：实施例1中使用rna荧光染料syto rnaselect green检测过氧化氢刺激下的
相分离结果图。
16.图2：实施例2中使用rna荧光染料吖啶橙检测低温刺激下的相分离结果图。
17.图3：实施例3中使用rna荧光染料碘化丙啶检测热刺激下的相分离结果图。
18.具体实施方法：
19.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
20.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
21.下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
22.实施例1
23.选取小鼠乳腺癌细胞4t1，首先向24孔板中加入无菌的盖玻片做细胞爬片，以105/孔接种到细胞培养24孔板中，预培养24小时；以细胞培养液将过氧化氢溶液配置终浓度为100μm的溶液，加入至细胞培养体系中，刺激6小时后，吸弃上清后，4℃用70％乙醇固定细胞30分钟；随后向细胞培养板中加入1μm syto rnaselect green染色液染色30分钟，随后取出盖玻片加入防荧光猝灭剂倒扣于载玻片上，盖玻片四周以封片剂封好，共聚焦显微镜以63倍油镜拍摄细胞内的rna分布情况。
24.结果如图1所示，对照组细胞的rna在细胞内的分布整体较为均匀，在过氧化氢刺激条件下rna形成液滴状，表明了细胞中相分离的发生。
25.实施例2
26.选取小鼠乳腺癌细胞4t1，首先向24孔板中加入无菌的盖玻片做细胞爬片，以105/孔接种到细胞培养24孔板中，预培养24小时；细胞培养体系放入4℃环境下刺激1小时，随后吸弃上清，4℃用70％乙醇固定细胞30分钟；随后向细胞培养板中加入1微克/毫升的吖啶橙染色液染色30分钟，随后取出盖玻片加入防荧光猝灭剂倒扣于载玻片上，盖玻片四周以封片剂封好，共聚焦显微镜以63倍油镜拍摄细胞内的rna分布情况。
27.结果如图2所示，对照组细胞的rna在细胞内的分布整体较为均匀，在冷刺激条件下rna形成液滴状，表明了细胞中相分离的发生。
28.实施例3
29.选取小鼠乳腺癌细胞4t1，首先向24孔板中加入无菌的盖玻片做细胞爬片，以105/孔接种到细胞培养24孔板中，预培养24小时；细胞培养体系放入4℃环境下刺激1小时，随后吸弃上清，4℃用70％乙醇固定细胞30分钟；随后向细胞培养板中加入50微克/毫升的碘化丙啶染色液染色30分钟，随后取出盖玻片加入防荧光猝灭剂倒扣于载玻片上，盖玻片四周以封片剂封好，共聚焦显微镜以63倍油镜拍摄细胞内的rna分布情况。
30.结果如图3所示，对照组细胞的rna在细胞内的分布整体较为均匀，在热刺激条件下rna形成液滴状，表明了细胞中相分离的发生。
31.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种细胞内相分离的检测方法，其特征在于用rna荧光染料将细胞内rna染色，观察染色后rna的分布，如果细胞质区域内有rna呈液滴状分布，则表明细胞内发生了相分离。2.根据权利要求1所述的细胞内相分离的检测方法，其特征在于所述rna荧光染料为syto rnaselect green、吖啶橙或碘化丙啶。3.根据权利要求1或2所述的细胞内相分离的检测方法，其特征在于其步骤包括：(1)收集待检测的细胞，用乙醇固定细胞；(2)加入rna荧光染料进行染色；(3)将染色后的细胞封片，置于共聚焦显微镜或者荧光显微镜下观察细胞内rna分布情况，如rna呈液滴状分布，则表明细胞内发生了相分离。4.根据权利要求3所述的细胞内相分离的检测方法，其特征在于步骤(3)中先加入防荧光猝灭剂再封片。5.根据权利要求3所述的细胞内相分离的检测方法，其特征在于步骤(3)中共聚焦显微镜以63倍油镜拍摄细胞内的rna分布情况。

技术总结
本发明公开了一种细胞内相分离的检测方法，其特征在于用RNA染料将细胞内RNA染色，观察染色后RNA的分布，如果细胞质区域内有RNA呈液滴状分布，则表明细胞内发生了相分离。本发明提供的细胞相分离的检测方法，通过对细胞内RNA染色的方式，即可直观的观察到细胞是否发生相分离，操作简单，可以作为通用的细胞相分离检测方法，应用在生物医疗相关领域。应用在生物医疗相关领域。应用在生物医疗相关领域。


技术研发人员：董磊 兴振 王珍珍
受保护的技术使用者：无锡市南京大学锡山应用生物技术研究所
技术研发日：2022.12.09
技术公布日：2023/3/10