葡萄糖雷公藤甲素缀合物及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2020年3月2日提交的美国临时申请第62/984,181号的优先权的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用以其整体并入。
3.发明背景
4.政府支持
5.本发明是根据由美国国立卫生研究院(national institute of health)授予的gm008763、tr001079和ca006973在政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
6.本公开内容的领域
7.本发明总体上涉及小分子，并且更具体地涉及小分子用于癌症治疗的用途。
8.背景信息
9.尽管真核转录抑制剂在细胞增殖和存活中具有基础作用，但与翻译抑制剂相比，存在少得多的真核转录抑制剂。雷公藤甲素(triptolide)((1s,2s,4s,5s,7r,8r,9s,11s,13s)-8-羟基-1-甲基-7-丙-2-基-3,6,10,16-四氧杂七环[11.7.0.02,4.02,9.05,7.09,11.014,18]二十-14(18)-烯-17-酮)，一种来自传统中国药用植物雷公藤(thunder god vine)(也被称为雷公藤(lei gong teng))的活性成分，已成为由rna聚合酶ii(rnapii)介导的少数特异性真核转录抑制剂中的一种。以其有效的免疫抑制活性和抗炎活性而闻名，具有富集的雷公藤甲素的雷公藤的提取物几个世纪以来一直被用作用于治疗各种各样的自身免疫性紊乱的强有力的免疫抑制剂。雷公藤甲素在迄今为止测试的几乎所有癌细胞系中也呈现出有效的抗增殖活性。构成雷公藤甲素的抗增殖活性的基础的分子机制已经被研究持续数十年。尽管许多认定的雷公藤甲素结合蛋白已经被报告，但大多数不能解释其抗增殖活性和促凋亡活性。一般转录因子tfiih的xpb亚基作为雷公藤甲素的生理靶标的鉴定和验证为雷公藤甲素的广泛抗癌活性提供了合理的分子解释。
[0010]
雷公藤甲素与xpb的活性位点中的cys342形成共价加合物，导致抑制xpb的dna依赖性atp酶活性，有效地阻断通过rnapii的转录起始。我们已经示出，在xpb基因的单个剩余的等位基因中cys342到苏氨酸残基的突变产生了可行的、尽管生长缓慢的hek293t细胞，该hek293t细胞变得对雷公藤甲素几乎完全抗性。除了cys342残基之外，xpb及其调控亚基p52两者中的许多其他残基似乎在tfiih和雷公藤甲素之间的相互作用中起重要作用，因为它们的突变也引起了在表达突变体的细胞系中对雷公藤甲素的抗性，尽管具有不同程度。雷公藤甲素对转录的作用似乎不仅仅由tfiih的atp酶活性的抑制引起，因为雷公藤甲素与xpb的结合随后引起rnapii的催化亚基的降解，加剧了雷公藤甲素对rnapii介导的转录的抑制作用。最近的工作指示cdk7激酶作为导致由雷公藤甲素诱导的rnapii的泛素化和蛋白酶体介导的降解的途径的一部分。然而，雷公藤甲素触发rnapii的rpb1亚基的降解的确切机制仍然有待被完全阐明。因此，雷公藤甲素通过独特的两步机制来抑制真核转录，所述两步机制是抑制xpb以防止rnapii介导的转录起始，随后降解rnapii本身。
[0011]
概述
[0012]
本文公开了具有式(i)的结构的葡萄糖-雷公藤甲素缀合物，或其药学上可接受的
盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0013][0014]
在一些实施方案中，l可以选自
–
co(cr1r2)nco
–
、
–
(cr1r2)nco
–
、
–
co(cr1r2)n–
、
–
(cr1r2)nso
–
、
–
(cr1r2)nso2–
、
–
so(cr1r2)n–
、
–
so2(cr1r2)n–
、
–
so(cr1r2)nso
–
、
–
so2(cr1r2)nso2–
、、、每个n可以是选自0至6的整数。m可以是选自0至4的整数。每个r1和r2可以独立地选自氢、甲基、乙基和卤素。r3可以选自氢、甲基、乙基、丙基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、烷氧基、叠氮基和卤素。
[0015]
本文还公开了具有式(ii)的结构的葡萄糖-雷公藤甲素缀合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0016][0017]
在一些实施方案中，n可以是选自0至10的整数。在一些实施方案中，n可以是3。t&a部分可以是雷公藤甲素或其类似物中的一种。在一些实施方案中，t&a部分可以选自
[0018]
以及其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0019]
在一些实施方案中，糖部分可以选自在一些实施方案中，糖部分可以选自
[0020][0020]
以及其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0021]
在一些实施方案中，本公开内容中的葡萄糖-雷公藤甲素缀合物是具有以下结构的化合物1：
[0022][0023]
还公开了一种药物制剂，其可以包含具有式(i)、式(ii)的结构的化合物，或化合物1，以及药学上可接受的载体。
[0024]
本文还公开了一种合成葡萄糖-雷公藤甲素缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体的方法。该方法可以包括
[0025][0026]
(a)使雷公藤甲素与选自4-羟基丁酸、邻苯二甲酸、1,5-戊二酸和琥珀酸的连接体缀合，以形成雷公藤甲素连接体衍生物t1；
[0027][0028]
(b)使t1与糖中间体t2反应以得到中间体t3，其中
[0029]
r1选自由以下组成的组：对甲氧基苄基、1-氯乙酰基保护基团、三乙基甲硅烷基和苄基；并且
[0030]
r2是氢或cnhccl3；以及
[0031][0032]
(c)将中间体t3脱保护，以获得葡萄糖-雷公藤甲素缀合物t4。
[0033]
t3还可以通过遵循下文提供的步骤来合成：
[0034][0035]
使葡萄糖t5与选自4-羟基丁酸、邻苯二甲酸、1,5-戊二酸和琥珀酸的连接体缀合，以形成葡萄糖连接体衍生物t6，其中x是o，r1选自对甲氧基苄基、1-氯乙酰基保护基团、三乙基甲硅烷基和苄基；以及
[0036][0037]
使葡萄糖连接体衍生物t6与雷公藤甲素反应以得到中间体t3。
[0038]
在一些实施方案中，r1是对甲氧基苄基(pmb)。在一些实施方案中，r2是cnhccl3。在一些实施方案中，脱保护反应通过三氟乙酸(tfa)实现。
[0039]
本文还公开了一种治疗受试者的疾病的方法，该方法包括施用有效量的具有式(i)、式(ii)的结构的化合物或化合物1。在一些实施方案中，疾病可以是癌症，癌症的类型可以选自由以下组成的组：中枢神经系统(cns)癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、食道癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、肾脏癌、子宫内膜癌、头颈癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、胆囊癌、喉癌、多发性骨髓瘤、
鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌和卡波西肉瘤。在一些实施方案中，该方法还可以包括施用化学治疗剂，化合物可以在施用化学治疗剂之前、与施用化学治疗剂同时或在施用化学治疗剂之后被施用。在一些实施方案中，化合物可以被皮下地(s.c.)、静脉内地(i.v.)、肌内地(i.m.)、鼻内地、口服地或局部地施用。在一些实施方案中，化合物可以以延迟释放制品、缓慢释放制品、延长释放制品或控制释放制品被配制。在一些实施方案中，化合物可以以选自以下的剂型被提供：可注射剂型、可输注剂型、可吸入剂型、可食用剂型、口服剂型、局部剂型及其组合。
[0040]
附图简述
[0041]
为了便于充分理解本公开内容，现在参考附图。这些附图不应被解释为限制本公开内容，但是意图仅是说明性的。
[0042]
图1是根据本公开内容的一些实施方案的所提出的方案，其图示出在低氧条件下葡萄糖转运蛋白的增加的水平如何导致葡萄糖-雷公藤甲素缀合物的摄取增加和癌细胞增殖的抑制增加；
[0043]
图2a-图2b示出了化合物1在体外不抑制tfiih的atp酶活性，而雷公藤甲素(tpl)在低10倍的浓度有效地抑制活性。数据，相对于dmso的释放的无机磷酸盐(
32
pi)的平均值
±
se(n＝3)；
[0044]
图2c示出了用化合物1(圆形)、化合物10(方形)或tpl(菱形)处理在24小时之后抑制细胞增殖；
[0045]
图2d示出了突变体xpb c342t在敲入细胞系t7115(深灰色三角形)中的表达导致雷公藤甲素抗性，但在表达野生型xpb的同基因细胞系(灰色三角形)中不导致雷公藤甲素抗性。增殖通过3h胸苷并入来测量并且使用graphpad prism作图。数据，相对于dmso的平均值
±
se(n＝3)；
[0046]
图2e示出了仅表达c342t xpb突变体的xpb的敲入细胞系对化合物1(圆形)具有抗性，而增殖的抑制在表达野生型(方形)xpb的同基因细胞系中观察到。增殖通过3h胸苷并入来测量并且使用graphpad prism作图。数据，相对于dmso的平均值
±
se(n＝3)；
[0047]
图3a示出了如通过串联hplc-ms监测的化合物10和化合物1在不同的孵育时间在人类血清中的水解；色谱图在a
280
处获取；
[0048]
图3b示出了化合物10和化合物1以及水解中间体10l和水解中间体1l的化学结构，该水解中间体10l和水解中间体1l可以随后被水解以释放雷公藤甲素(tpl)；
[0049]
图3c示出了通过使用xtt测定测量原代细胞和多种癌细胞系中的生存力确定的化合物1的ic
50
。一些肝癌细胞系、肺癌细胞系、黑素瘤细胞系和胰腺癌细胞系对化合物1处理响应不佳。huvec＝人类脐血管内皮细胞，mec＝乳腺上皮细胞，pec＝前列腺上皮细胞，rpt＝肾近端小管，aec＝气道上皮细胞。数据，相对于dmso的平均值
±
se生存力(n＝3-7)；
[0050]
图3d示出了通过使用xtt测定测量原代细胞中的生存力确定的化合物1和化合物10的ic
50
，图示出相对于化合物1而言对化合物10的增加的敏感性。化合物10的平均ic
50
显著低于化合物1的平均ic
50
，p《0.01。huvec＝人类脐血管内皮细胞，mec＝乳腺上皮细胞，pec＝前列腺上皮细胞，rpt＝肾近端小管，aec＝气道上皮细胞。数据，相对于dmso的平均值
±
se生存力(n＝3-7)；
[0051]
图4a和图4b示出了用dmso(对照)、化合物1(1μm)、螺内酯(10μm)处理hela细胞或
者用螺内酯(10μm)预处理随后用化合物1(1μm)处理的效果。用1μm化合物1处理持续24h耗尽内源性rna聚合酶ii(rnapii)；而10μm螺内酯(sp)和dmso本身不影响固定的hela细胞中的蛋白质水平，所述固定的hela细胞被加工用于rpb1(rnapii的催化亚基)和dapi(核标志物)的免疫细胞化学染色。用10μm螺内酯预处理细胞显著地(p《0.001)从化合物1诱导的降解中拯救内源性rnapii。rpb1和dapi染色的代表性图像被示出，连同细胞内rpb1的定量和学生t检验分析。数据，相对于dmso的平均值
±
se rpb1水平(n＝3)。比例尺是20μm；
[0052]
图4c示出了用增加浓度的螺内酯(sp)处理的细胞的全细胞裂解物，其经受使用对xpb特异性的抗体的蛋白质印迹分析，这示出螺内酯以剂量依赖性方式诱导细胞中内源性xpb的降解，gapdh被用作加载对照；
[0053]
图4d示出了用化合物1、sp或者化合物1和sp的组合处理的细胞的全细胞裂解物，其经受使用对rpb1特异性的抗体的内源性rnapii的蛋白质印迹分析，示出在1μm和3μm时化合物1诱导的rnapii降解被10μm sp处理所拮抗；
[0054]
图4e示出了相对于dmso对照的在浓度增加的化合物1，来自仅表达c342t xpb的同基因敲入细胞的全细胞裂解物，图示出如通过针对rpb1的免疫印迹测量的化合物1对rnapii的催化亚基的降解在没有野生型xpb的情况下被抑制。相比之下，rbp1相互作用抑制剂α-鹅膏蕈碱在c342t xpb同基因细胞系中在1μm诱导rpb1的降解。肌动蛋白被用作加载对照；
[0055]
图4f示出了用0.1μm雷公藤甲素处理然后裂解以用于使用抗rpb1特异性抗体的蛋白质印迹分析的具有野生型(293t wt)xpb或雷公藤甲素抗性突变体(xpb c342t)xpb的同基因细胞。与雷公藤甲素暴露的具有xpb c342t突变的细胞(其中rpb1水平类似于dmso对照)相比，用雷公藤甲素处理导致wt xpb细胞中rnapii降解的rpb1亚基的降解。gapdh被用作加载对照；
[0056]
图5a和图5b示出了亮相显微照片和对应的核破碎定量，指示与化合物1处理，尤其是使用3μm化合物1处理(其中大量细胞聚拢和起泡(具有黑色星号和白色星号的插图))相比，在dmso暴露的情况下的最小的细胞病理学。如通过使用hoechst 33258染色的细胞化学分析检测的，聚拢的hela细胞中的核破碎通过化合物1处理显著增加(具有两个白色星号的插图)，而在dmso中没有显著增加。数据，核破碎的细胞相对于总细胞的百分比
±
se(n＝3)。比例尺是20μm；
[0057]
图5c示出了在用化合物1处理hela细胞期间的细胞色素c释放，如通过线粒体的离心分离随后使用细胞色素c特异性抗体进行蛋白质印迹分析评估的。hela细胞暴露于3μm化合物1触发细胞色素c从线粒体(m)到细胞溶质(c)的释放。肌动蛋白特异性抗体和vdac1特异性抗体分别被用作对照，以确保细胞质和线粒体分级的效率；
[0058]
图5d示出了在化合物1处理期间全细胞裂解物的活性胱天蛋白酶3(a-casp3)和parp1的蛋白质印迹分析，指示胱天蛋白酶3活化的剂量依赖性增加。随着化合物1的浓度增加，还观察到通过活性胱天蛋白酶3的明显的parp1裂解。
[0059]
图5e示出了通过10μm螺内酯对细胞中xpb的降解抑制了化合物1诱导的凋亡信号传导，如通过经受蛋白质印迹分析的全细胞裂解物中的减少的parp1裂解所指示的，肌动蛋白被用作加载对照；
[0060]
图6a示出了使用对hif-1α特异性的抗体的固定的细胞的免疫细胞化学分析，这指
示与pc3细胞中的常氧(20％ o2)相比，暴露于低氧(1％ o2)持续24h使内源性hif-1α稳定化，比例尺是20μm；
[0061]
图6b示出了全细胞裂解物的内源性hif-1α、glut1和肌动蛋白(对照)的蛋白质印迹分析，指示相对于常氧，在低氧期间增加的hif-1α水平和活性以及增加的glut1水平和活性(即2-nbdg摄取)，比例尺是20μm；
[0062]
图6c示出了低氧增强了化合物1在处理后48h的抗增殖作用，如通过3h胸苷并入测量的，而用多柔比星和低氧共处理降低了药物效能，tpl在存在低氧的情况下示出适度增强的抗增殖作用。数据，相对于dmso的平均值
±
se(n＝3)；
[0063]
图6d示出了使用对rpb1特异性的抗体的免疫细胞化学，这指示细胞暴露于低氧在6h之后触发通过3μm化合物1的rnapii亚基rpb1降解的早期发生，比例尺是20μm；
[0064]
图6e示出了在低氧条件和常氧条件下经受使用抗rpb1特异性抗体的蛋白质印迹的全细胞裂解物，图示出10μm葡萄糖转运蛋白1抑制剂wzb117拮抗在低氧条件下由3μm化合物1触发的rnapii降解的早期发生；
[0065]
图6f示出了与dld-1glut1敲除(glut1 ko)细胞相比，暴露于低氧(1％ o2)的dld-1wt细胞呈现出对化合物1的增强的敏感性。在常氧(20％o2)下，dld-1wt和glut1 ko之间没有观察到敏感性的差异。数据被表示为相对于dmso的平均值
±
sem(n＝3)。比例尺是20μm；
[0066]
图7a示出了化合物1和化合物10在转移性前列腺癌模型中具有类似的最大耐受剂量(mtd)。在通过生物发光成像确认nod/scid/il2r
null
小鼠中的肿瘤生长之后，每日施用1mg/kg的化合物10或化合物1持续30天被动物耐受，并且能够在整个处理过程中抑制肿瘤生长。化合物10或化合物1的抗肿瘤作用在处理后2周持续存在；
[0067]
图7b示出了kaplan-meier曲线，指示对照处理、化合物10处理和化合物1处理的存活时间(在处理开始之后的天数(n＝5))。中值存活时间(天数)如下：未经处理的＝27，dmso＝29，化合物10(1mg/kg)＝76，化合物1(0.25mg/kg)＝46，化合物1(0.5mg/kg)＝76，化合物1(1mg/kg)＝84；以及
[0068]
图8a-图8h示出了低氧影响癌细胞对化合物1的敏感性。与mcf-7(e)或hepg2(g)(其中在低氧期间观察到适度的增强或抗性)相比，hela细胞(a)和mda mb231细胞(b)暴露于低氧环境(1％ o2)增强了化合物1在处理后48h的抗增殖作用，如通过3h胸苷并入测量的。雷公藤甲素(tpl)在除了在低氧示出抗性的hepg2之外的所有测试的细胞中示出适度的抗增殖作用。增殖通过3h胸苷并入来测量并且使用graphpad prism作图。数据表示相对于dmso的平均值
±
sem(n＝3)。
[0069]
详述
[0070]
癌症治疗的主要障碍是肿瘤微环境所特有的在低氧下诱导的化学抗性。雷公藤甲素，一种有效的真核转录抑制剂，具有有效的抗肿瘤活性。然而，其临床潜力一直受到毒性和水溶解度的限制。为了解决雷公藤甲素的这些局限性，我们设计并合成了葡萄糖-雷公藤甲素缀合物(糖化雷公藤甲素(glutriptolide))，并且证明了它们在体外和体内的抗肿瘤活性。在本文中，我们鉴定出具有改变的连接体结构的化合物1。化合物1具有在人类血清中的改善的稳定性、相比正常细胞更大的对癌细胞的选择性以及针对癌细胞增加的效能。化合物1呈现出持续的抗肿瘤活性，延长前列腺癌转移动物模型中的存活。重要的是，我们发现与常氧相比，化合物1在低氧下对癌细胞更有效。总之，这项工作提供了一种有吸引力的
糖化雷公藤甲素药物先导(lead)，并且提出了通过细胞毒素剂与葡萄糖的缀合来克服化学抗性的可行策略。
[0071]
在过去的几十年中，已经做出了巨大的努力来开发雷公藤甲素及其类似物作为免疫抑制药物和抗癌药物。主要障碍之一是雷公藤甲素的一般毒性，该一般毒性最可能归因于雷公藤甲素对转录的抑制。另一个是雷公藤甲素的有限的水溶解度。迄今为止，雷公藤甲素的两种衍生物仍在临床开发中。一种类似物(5r)-5-羟基雷公藤甲素作为免疫抑制剂正在经历临床试验。另一种是明尼甲素(minnelide)，一种具有增大的溶解度的雷公藤甲素的磷酸化形式，正在经历人类试验用于治疗胰腺癌和其他类型的癌症。鉴于雷公藤甲素的基于机制的毒性，难以用现有的雷公藤甲素类似物将雷公藤甲素的抗肿瘤活性和内在毒性分开，因此需要一种根本上不同的方法来解决这个问题。最近，我们通过将雷公藤甲素与葡萄糖缀合设计了一类不同的雷公藤甲素类似物，希望靶向葡萄糖成瘾的肿瘤细胞而不是正常细胞。此外，葡萄糖的高水溶解度将显著增加所得到的葡萄糖-雷公藤甲素缀合物(在下文中称为糖化雷公藤甲素)的溶解度。来自我们的第一代糖化雷公藤甲素的先导化合物中的一种(化合物10)确实呈现出相比雷公藤甲素更高的溶解度和肿瘤细胞选择性，并且被示出在体内具有持续的抗肿瘤活性。不幸地，一种专性降解中间体雷公藤甲素-琥珀酸酯(也被称为f60008)已经经历早期人类临床研究，并且被发现对两名患者是致命的。此外，化合物10在人类血清中具有不稳定性，排除了其作为可行的药物候选物的可能性。
[0072]
为了鉴定具有改善的药理学性质和降低的毒性的糖化雷公藤甲素类似物，我们通过改变连接体结构以及连接体和葡萄糖之间的伴随的键(linkage)来着手设计并合成一系列第二代葡萄糖-雷公藤甲素缀合物。对这些第二代糖化雷公藤甲素类似物的筛选鉴定出在连接体和葡萄糖之间具有糖苷键的化合物1，化合物1在降解后将释放含醇的中间体。相比化合物10，化合物1被发现在体外对癌细胞具有强4倍的效力，并且呈现出相比正常细胞更大的对癌细胞的选择性。化合物1还被发现在人类血清中具有大得多的稳定性。与雷公藤甲素不同，化合物1在体外对tfiih的atp酶活性几乎没有影响。然而，与雷公藤甲素类似，化合物1以xpb依赖性方式抑制多种癌细胞系的增殖，诱导凋亡，并且引起rnapii的催化亚基的降解。使用化合物1作为探针，我们还研究了化合物1在低氧条件下对癌细胞的作用，并且发现化合物1在低氧条件下比在常氧条件下对癌细胞更有效。鉴于低氧在对几乎所有已知的抗癌药物的化学抗性中的关键作用，我们对化合物1的发现提出了通过药物与葡萄糖的缀合来克服低氧诱导的抗药性的令人兴奋的可能性。
[0073]
当公开值的范围，并且使用记法“从n1...至n2”或“在n1...和n2之间”，其中n1和n2是数字时，那么除非另外指定，否则该记法意图包括数字本身和在它们之间的范围。该范围可以在端值之间并且包括端值是整数的或连续的。通过实例的方式，范围“从2个至6个碳”意图包括两个、三个、四个、五个和六个碳，因为碳以整数单位出现。相比之下，通过实例的方式，范围“从1μm至3μm(微摩尔)”意图包括1μm、3μm以及其间的一切直至任意数目的有效数字(例如，1.255μm、2.1μm、2.9999μm等)。当在“0个碳原子”的上下文中将n设置为0时，其意图指示键或空(null)。
[0074]
如本文所使用的，术语“约”意图限定它修饰的数值，将这样的值表示为在误差边际内的变量。当没有叙述特定的误差边际诸如图表或数据表中给出的平均值的标准偏差时，术语“约”应被理解为意指将涵盖所叙述的值的范围和考虑到有效数字也将通过向上或
向下舍入到该数字而包括的范围。
[0075]
如本文单独或组合所使用的，术语“酰基”指的是附接至烯基、烷基、芳基、环烃基、杂芳基、杂环或任何其他部分的羰基，其中附接至羰基的原子是碳。“乙酰基”基团指的是-c(o)ch3基团。“烷基羰基”或“烷酰基”基团指的是通过羰基基团附接至母体分子部分的烷基基团。这样的基团的实例包括甲基羰基和乙基羰基。酰基基团的实例包括甲酰基、烷酰基和芳酰基。
[0076]
如本文单独或组合所使用的，术语“烯基”指的是具有一个或更多个双键并且含有从2个至20个碳原子的直链或支链烃基团。在某些实施方案中，所述烯基将包含从2个至6个碳原子。术语“亚烯基”指的是在两个或更多个位置处附接的碳-碳双键体系，诸如亚乙烯基[(-ch＝ch-)，(-c::c-)]。合适的烯基基团的实例包括乙烯基、丙烯基、2-甲基丙烯基、1,4-丁二烯基及类似基团。除非另外指定，否则术语“烯基”可以包括“亚烯基”基团。
[0077]
如本文单独或组合所使用的，术语“烷氧基”指的是烷基醚基团，其中术语烷基是如下文所定义的。合适的烷基醚基团的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基及类似基团。
[0078]
如本文单独或组合所使用的，术语“烷基”指的是含有从1个至20个碳原子的直链或支链烷基基团。在某些实施方案中，所述烷基将包含从1个至10个碳原子。在另外的实施方案中，所述烷基将包含从1个至6个碳原子。烷基基团可以如本文所定义的任选地被取代。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、壬基及类似基团。如本文单独或组合所使用的，术语“亚烷基(alkylene)”指的是衍生自在两个或更多个位置处附接的直链或支链饱和烃的饱和脂肪族基团，诸如亚甲基(-ch
2-)。除非另外指定，否则术语“烷基”可以包括“亚烷基”基团。
[0079]
如本文单独或组合所使用的，术语“烷基氨基”指的是通过氨基基团附接至母体分子部分的烷基基团。合适的烷基氨基基团可以是单烷基化的或二烷基化的，形成诸如，例如，n-甲基氨基、n-乙基氨基、n,n-二甲基氨基、n,n-乙基甲基氨基及类似基团的基团。
[0080]
如本文单独或组合所使用的，术语“亚烷基(alkylidene)”指的是烯基基团，其中碳-碳双键的一个碳原子属于烯基基团被附接至的部分。
[0081]
如本文单独或组合所使用的，“烷基硫基”指的是烷基硫醚(r-s-)基团，其中术语烷基是如上文所定义的，并且其中硫可以是单氧化的或双氧化的。合适的烷基硫醚基团的实例包括甲基硫基、乙基硫基、正丙基硫基、异丙基硫基、正丁基硫基、异丁基硫基、仲丁基硫基、叔丁基硫基、甲磺酰基、乙亚磺酰基及类似基团。
[0082]
如本文单独或组合所使用的，术语“炔基”指的是具有一个或更多个三键并且含有从2个至20个碳原子的直链或支链烃基团。在某些实施方案中，所述炔基包含从2个至6个碳原子。在另外的实施方案中，所述炔基包含从2个至4个碳原子。术语“亚炔基”指的是在两个位置处附接的碳-碳三键，诸如亚乙炔基(-c:::c-，-c≡c-)。炔基基团的实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-2-基及类似基团。除非另外指定，否则术语“炔基”可以包括“亚炔基”基团。
[0083]
如本文单独或组合所使用的，术语“酰氨基”和“氨基甲酰基”指的是通过羰基基团附接至母体分子部分的如下文所描述的氨基基团，反之亦然。如本文单独或组合所使用的，术语“c酰氨基”指的是具有如本文所定义的r的c(＝o)nr2基团。如本文单独或组合所使用
的，术语“n酰氨基”指的是具有如本文所定义的r的rc(＝o)nh基团。如本文单独或组合所使用的，术语“酰基氨基”包括通过氨基基团附接至母体部分的酰基基团。“酰基氨基”基团的实例是乙酰基氨基(ch3c(o)nh-)。
[0084]
如本文单独或组合所使用的，术语“氨基”指的是-nrr’，其中r和r’独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、酰基、杂烃基、芳基、环烃基、杂芳基和杂环烃基，它们中的任何一个本身可以任选地被取代。此外，r和r’可以组合以形成杂环烃基，它们中的任一个可以任选地被取代。
[0085]
如本文单独或组合所使用的，术语“芳基”意指含有一个、两个或三个环的碳环芳香族体系，其中这样的多环环体系被稠合在一起。术语“芳基”包括芳香族基团诸如苯基、萘基、蒽基和菲基。
[0086]
如本文单独或组合所使用的，术语“芳基烯基”或“芳烯基”指的是通过烯基基团附接至母体分子部分的芳基基团。
[0087]
如本文单独或组合所使用的，术语“芳基烷氧基”或“芳烷氧基”指的是通过烷氧基基团附接至母体分子部分的芳基基团。
[0088]
如本文单独或组合所使用的，术语“芳基烷基”或“芳烷基”指的是通过烷基基团附接至母体分子部分的芳基基团。
[0089]
如本文单独或组合所使用的，术语“芳基炔基”或“芳炔基”指的是通过炔基基团附接至母体分子部分的芳基基团。
[0090]
如本文单独或组合所使用的，术语“芳基烷酰基”或“芳烷酰基”或“芳酰基”指的是衍生自芳基取代的烷烃羧酸的酰基基团，诸如苯甲酰基、萘甲酰基、苯基乙酰基、3-苯基丙酰基(氢化肉桂酰基)、4-苯基丁酰基、(2-萘基)乙酰基、4-氯氢化肉桂酰基及类似基团。
[0091]
如本文单独或组合所使用的，术语芳氧基指的是通过氧基附接至母体分子部分的芳基基团。
[0092]
如本文单独或组合所使用的，术语“苯并(benzo)”和“苯并(benz)”指的是衍生自苯的二价基团c6h4＝。实例包括苯并噻吩和苯并咪唑。
[0093]
如本文单独或组合所使用的，术语“氨基甲酸酯”指的是氨基甲酸的酯(-nhcoo-)，其可以从氮端或酸端附接至母体分子部分，并且其可以如本文所定义的任选地被取代。
[0094]
如本文单独或组合所使用的，术语“o氨基甲酰基”指的是具有如本文所定义的r和r’的oc(o)nrr’基团。
[0095]
如本文单独或组合所使用的，术语“n氨基甲酰基”指的是具有如本文所定义的r和r’的roc(o)nr’基团。
[0096]
如本文所使用的，术语“羰基”，当单独时包括甲酰基[-c(o)h]，并且当组合时是-c(o)-基团。
[0097]
如本文所使用的，术语“羧基(carboxyl)”或“羧基(carboxy)”指的是-c(o)oh或对应的“羧酸根”阴离子，诸如在羧酸盐中的“羧酸根”阴离子。“o羧基”基团指的是rc(o)o-基团，其中r是如本文所定义的。“c羧基”基团指的是-c(o)or基团，其中r是如本文所定义的。
[0098]
如本文单独或组合所使用的，术语“氰基”指的是-cn。
[0099]
如本文单独或组合所使用的，术语“环烃基”或可选择地“碳环”指的是饱和或部分饱和的单环、双环或三环烃基基团，其中每一个环部分包含从3个至12个碳原子环成员，并
且其可以任选地是如本文所定义的任选地被取代的苯并稠合的环体系。在某些实施方案中，所述环烃基将包含从5个至7个碳原子。这样的环烃基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、四氢萘基、茚满基、八氢萘基、2,3-二氢-1h-茚基、金刚烷基及类似基团。如本文所使用的“双环”和“三环”意图包括稠合的环体系诸如十氢萘、八氢萘以及多环(多中心)饱和或部分不饱和类型两者。后一种类型的异构体通常通过双环[1,1,1]戊烷、樟脑、金刚烷和双环[3,2,1]辛烷来例示。
[0100]
如本文单独或组合所使用的，术语“酯”指的是桥接碳原子处连接的两个部分的羧基基团。
[0101]
如本文单独或组合所使用的，术语“醚”指的是桥接碳原子处连接的两个部分的氧基基团。
[0102]
如本文单独或组合所使用的，术语“卤代”或“卤素”指的是氟、氯、溴或碘。
[0103]
如本文单独或组合所使用的，术语“卤代烷氧基”指的是通过氧原子附接至母体分子部分的卤代烷基基团。
[0104]
如本文单独或组合所使用的，术语“卤代烷基”指的是具有如上文所定义的含义的烷基基团，其中一个或更多个氢被卤素替换。具体地包括单卤代烷基基团、二卤代烷基基团和多卤代烷基基团。对于一个实例，单卤代烷基基团可以在基团中具有碘原子、溴原子、氯原子或氟原子。二卤代烷基基团和多卤代烷基基团可以具有两个或更多个相同的卤原子或不同的卤代基团的组合。卤代烷基基团的实例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。“卤代亚烷基”指的是在两个或更多个位置处附接的卤代烷基基团。实例包括氟亚甲基(-cfh-)、二氟亚甲基(-cfh-)、氯亚甲基(-chcl-)及类似基团。
[0105]
如本文单独或组合所使用的，术语“杂烃基”指的是完全饱和或包含从1个至3个不饱和度、由所陈述的数目的碳原子和从一个至三个选自由o、n和s组成的组的杂原子组成的稳定的直链或支链或环状烃基团或其组合，并且其中氮原子和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或更多个杂原子(heteroatom(s))o、n和s可以位于杂烃基基团的任何内部位置处。多达两个杂原子可以是连续的，诸如，例如，-ch
2-nh-och3。
[0106]
如本文单独或组合所使用的，术语“杂芳基”指的是3元至7元不饱和杂单环，或者包含至少一个选自由o、s和n组成的组的原子的稠合的单环、双环或三环环体系，其中稠合的环中的至少一个是芳香族的。在某些实施方案中，所述杂芳基将包含从5个至7个碳原子。该术语还包括稠合的多环基团，其中杂环与芳基环稠合，其中杂芳基环与其他杂芳基环稠合，其中杂芳基环与杂环烃基环稠合，或者其中杂芳基环与环烃基环稠合。杂芳基基团的实例包括吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、吡喃基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基(indolizinyl)、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲唑基、苯并三唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并吡喃基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、色酮基(chromonyl)、香豆素基(coumarinyl)、苯并吡喃基、四氢喹啉基、四唑并哒嗪基、四氢异喹啉基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基(furopyridinyl)、吡咯并吡啶基及类似基团。示例性的三环杂环基团包括咔唑基、苯并吲
哚基、菲咯啉基(phenanthrolinyl)、二苯并呋喃基、吖啶基、菲啶基、呫吨基及类似基团。
[0107]
如本文单独或组合所使用的，术语“杂环烃基”和可互换地，“杂环”各自指的是包含至少一个杂原子作为环成员的饱和、部分不饱和或完全不饱和的单环、双环或三环杂环基团，其中每一个所述杂原子可以独立地选自由氮、氧和硫组成的组。在某些实施方案中，所述杂环烃基将包含从1个至4个杂原子作为环成员。在另外的实施方案中，所述杂环烃基将包含从1个至2个杂原子作为环成员。在某些实施方案中，所述杂环烃基将在每一个环中包含从3个至8个环成员。在另外的实施方案中，所述杂环烃基将在每一个环中包含从3个至7个环成员。在又另外的实施方案中，所述杂环烃基将在每一个环中包含从5个至6个环成员。“杂环烃基”和“杂环”意图包括砜、亚砜、叔氮环成员的n-氧化物以及碳环稠合的环体系和苯并稠合的环体系；此外，这两个术语还包括其中杂环与如本文所定义的芳基基团或另外的杂环基团稠合的体系。杂环基团的实例包括氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、1,3-苯并二氧杂环戊烯基、二氢异吲哚基、二氢异喹啉基、二氢噌啉基、二氢苯并二噁英基、二氢[1,3]噁唑并[4,5-b]吡啶基、苯并噻唑基、二氢吲哚基、二氢吡啶基、1,3-二噁烷基(1,3-dioxanyl)、1,4-二噁烷基、1,3-二氧戊环基、异吲哚啉基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、四氢吡啶基、哌啶基、硫代吗啉基及类似基团。除非特别禁止，否则杂环基团可以任选地被取代。
[0108]
如本文单独或组合所使用的，术语“肼基”指的是通过单键连接的两个氨基基团，即-n-n-。
[0109]
如本文单独或组合所使用的，术语“羟基”指的是-oh。
[0110]
如本文单独或组合所使用的，术语“羟基烷基”指的是通过烷基基团附接至母体分子部分的羟基基团。
[0111]
如本文单独或组合所使用的，术语“亚氨基”指的是＝n-。
[0112]
如本文单独或组合所使用的，术语“亚氨基羟基”指的是＝n(oh)和＝n-o-。
[0113]
措辞“在主链中”指的是在基团与本文公开的式中的任何一种的化合物的附接点处开始的最长的连续或相邻的碳原子链。
[0114]
术语“异氰酰基”指的是-nco基团。
[0115]
术语“异硫代氰酰基”指的是-ncs基团。
[0116]
措辞“线性原子链”指的是独立地选自碳、氮、氧和硫的原子的最长直链。
[0117]
如本文单独或组合所使用的，术语“低级”，在不另外具体地定义的情况下，意指包含从1个至6个且包括6个碳原子。
[0118]
如本文单独或组合所使用的，术语“低级芳基”意指苯基或萘基，它们可以如所规定的任选地被取代。
[0119]
如本文单独或组合所使用的，术语“低级杂芳基”意指：1)包含五个或六个环成员的单环杂芳基，其中一个和四个之间的所述环成员可以是选自由o、s和n组成的组的杂原子；或2)双环杂芳基，其中稠合的环中的每一个包含五个或六个环成员，在它们之间包含一个至四个选自由o、s和n组成的组的杂原子。
[0120]
如本文单独或组合所使用的，术语“低级环烃基”意指具有在三个和六个之间的环成员的单环环烃基。低级环烃基可以是不饱和的。低级环烃基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
[0121]
如本文单独或组合所使用的，术语“低级杂环烃基”意指具有在三个和六个之间的
环成员的单环杂环烃基，其中一个和四个之间的环成员可以是选自由o、s和n组成的组的杂原子。低级杂环烃基的实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基。低级杂环烃基可以是不饱和的。
[0122]
如本文单独或组合所使用的，术语“低级氨基”指的是-nrr’，其中r和r’独立地选自由以下组成的组：氢、低级烷基和低级杂烃基，它们中的任何一个可以任选地被取代。此外，低级氨基基团的r和r’可以组合以形成五元或六元杂环烃基，它们中的任一个可以任选地被取代。
[0123]
如本文单独或组合所使用的，术语“烷基硫基(mercaptyl)”指的是rs-基团，其中r是如本文所定义的。
[0124]
如本文单独或组合所使用的，术语“硝基”指的是-no2。
[0125]
如本文单独或组合所使用的，术语“氧基”或“氧杂”指的是-o-。
[0126]
如本文单独或组合所使用的，术语“氧代”指的是＝o。
[0127]
术语“全卤代烷氧基”指的是其中所有氢原子被卤素原子替换的烷氧基基团。
[0128]
如本文单独或组合所使用的，术语“全卤代烷基”指的是其中所有氢原子被卤素原子替换的烷基基团。
[0129]
如本文单独或组合所使用的，术语“磺酸酯”、“磺酸”和“磺酸基”指的是-so3h基团及其阴离子，因为磺酸被用于盐形成。
[0130]
如本文单独或组合所使用的，术语“硫烷基(sulfanyl)”指的是-s-。
[0131]
如本文单独或组合所使用的，术语“亚磺酰基”指的是-s(o)-。
[0132]
如本文单独或组合所使用的，术语“磺酰基”指的是-s(o)
2-。
[0133]
术语“n磺酰氨基”指的是具有如本文所定义的r和r’的rs(＝o)2nr’基团。
[0134]
术语“s磺酰氨基”指的是具有如本文所定义的r和r’的s(＝o)2nrr’基团。
[0135]
如本文单独或组合所使用的，术语“硫杂”和“硫基”指的是-s-基团或其中氧被硫替换的醚。硫基基团的氧化衍生物，即亚磺酰基和磺酰基，被包含在硫杂和硫基的定义中。
[0136]
如本文单独或组合所使用的，术语“硫醇”指的是-sh基团。
[0137]
如本文所使用的，术语“硫代羰基”，当单独时包括硫代甲酰基-c(s)h，并且当组合时是-c(s)-基团。
[0138]
术语“n硫代氨基甲酰基”指的是具有如本文所定义的r和r’的roc(s)nr
’‑
基团。
[0139]
术语“o硫代氨基甲酰基”指的是具有如本文所定义的r和r’的-oc(s)nrr’基团。
[0140]
术语“硫代氰酰基”指的是-cns基团。
[0141]
术语“三卤代甲磺酰氨基”指的是其中x是卤素并且r如本文所定义的x3cs(o)2nr-基团。
[0142]
术语“三卤代甲磺酰基”指的是其中x是卤素的x3cs(o)
2-基团。
[0143]
术语“三卤代甲氧基”指的是其中x是卤素的x3co-基团。
[0144]
如本文单独或组合所使用的，术语“三取代的甲硅烷基”指的是在其三个自由价处被如本文在被取代的氨基的定义下列出的基团取代的有机硅基团。实例包括三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基及类似基团。
[0145]
本文的任何定义可以与任何其他定义组合使用以描述复合结构基团。按照惯例，任何这样的定义的尾部元素是附接至母体部分的元素。例如，复合基团烷基酰氨基将表示
通过酰氨基基团附接至母体分子的烷基基团，并且术语烷氧基烷基将表示通过烷基基团附接至母体分子的烷氧基基团。
[0146]
当基团被定义为“空”时，意味着所述基团不存在。
[0147]
术语“任选地被取代的”意指前面基团可以是被取代的或未被取代的。当被取代时，“任选地被取代的”基团的取代基可以包括，但不限于，单独或组合的一个或更多个独立地选自以下基团或特别指定的基团组的取代基：低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷酰基、低级杂烃基、低级杂环烃基、低级卤代烷基、低级卤代烯基、低级卤代炔基、低级全卤代烷基、低级全卤代烷氧基、低级环烃基、苯基、芳基、芳氧基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、氧代、低级酰氧基、羰基、羧基、低级烷基羰基、低级羧基酯、低级甲酰氨基、氰基、氢、卤素、羟基、氨基、低级烷基氨基、芳基氨基、酰氨基、硝基、硫醇、低级烷基硫基、低级卤代烷基硫基、低级全卤代烷基硫基、芳基硫基、磺酸酯、磺酸、三取代的甲硅烷基、n3、sh、sch3、c(o)ch3、co2ch3、co2h、吡啶基、噻吩、呋喃基、低级氨基甲酸酯和低级脲。两个取代基可以被连接在一起以形成由零个至三个杂原子组成的稠合的五元、六元或七元碳环或杂环，例如形成亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。任选地被取代的基团可以是未被取代的(例如，-ch2ch3)、完全地被取代的(例如，-cf2cf3)、单取代的(例如，-ch2ch2f)或在完全地被取代的和单取代的之间的任何水平被取代的(例如，-ch2cf3)。在叙述取代基而关于取代没有限定的情况下，被取代的形式和未被取代的形式两者被涵盖。在取代基被限定为“被取代的”的情况下，被取代的形式是明确预期的。此外，可以根据需要定义特定部分的不同组的任选的取代基；在这些情况下，任选的取代将是如所定义的，通常紧接在措辞“任选地被......取代”之后。
[0148]
除非另外定义，否则术语r或术语r’，在单独地出现且没有数字指定时，指的是选自由以下组成的组的部分：氢、烷基、环烃基、杂烃基、芳基、杂芳基和杂环烃基，它们中的任何一个可以任选地被取代。这样的r基团和r’基团应被理解为如本文所定义的任选地被取代。无论r基团是否具有数字指定，每个r基团(包括r、r’和rn，其中n＝(1、2、3、
…
n))、每个取代基和每个术语应被理解为在从组中选择方面彼此独立。如果任何变量、取代基或术语(例如，芳基、杂环、r等)在式或一般结构中出现多于一次，则其定义在每次出现时独立于在每次其他出现时的定义。本领域技术人员还将认识到，某些基团可以被附接至母体分子，或者可以占据如所书写的从任一端起的元素链中的位置。因此，仅通过实例的方式，不对称基团诸如-c(o)n(r)-可以在碳或氮处被附接至母体部分。
[0149]
不对称中心存在于本文公开的化合物中。这些中心由符号“r”或“s”指定，这取决于手性碳原子周围的取代基的构型。应当理解，本公开内容涵盖所有立体化学异构体形式，包括非对映异构体形式、对映异构体形式和差向异构体形式，以及d-异构体和l-异构体及其混合物。化合物的单独的立体异构体可以由含有手性中心的可商购的起始材料合成地制备，或者通过制备对映异构体产物的混合物，随后分离诸如转化为非对映异构体的混合物，随后进行分离或重结晶，色谱技术，在手性色谱柱上直接分离对映异构体，或本领域已知的任何其他适当的方法来制备。特定立体化学的起始化合物是可商购的或可以通过本领域已知的技术来制备和拆分。此外，本文公开的化合物可以作为几何异构体存在。本公开内容包括所有顺式(cis)异构体、反式(trans)异构体、顺式(syn)异构体、反式(anti)异构体、顺式(entgegen)(e)异构体和反式(zusammen)(z)异构体以及其适当的混合物。此外，化合物可以作为互变异构体存在；所有互变异构的异构体由本公开内容提供。此外，本文公开的化合
物可以以未溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂诸如水、乙醇及类似溶剂的溶剂化形式存在。通常，溶剂化形式被认为等同于未溶剂化形式。
[0150]
术语“键”指的是当通过键连接的原子被认为是较大亚结构的一部分时，两个原子或两个部分之间的共价键。除非另外指定，否则键可以是单键、双键或三键。分子的图中两个原子之间的虚线指示在该位置处可能存在或可能不存在另外的键。
[0151]
术语“光学纯的立体异构体”指的是立体异构体的诸如对映异构体的或非对映异构体的过量或每一种对映异构体或非对映异构体的摩尔分数之间的绝对差异。
[0152]
本文描述的化合物的药学上可接受的盐包括例如来自无毒的有机酸或无机酸的化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒盐包括衍生自无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸及类似无机酸的盐；以及由诸如以下的有机酸制备的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟基乙磺酸及类似有机酸。在其他情况下，所描述的化合物可以包含一个或更多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。这些盐同样可以在施用媒介物或剂型制造工艺中原位制备，或者通过使呈其游离酸形式的纯化的化合物与合适的碱诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，与氨，或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独反应来制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐及类似盐。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪及类似有机胺。
[0153]
本文公开了具有式(i)的结构的葡萄糖-雷公藤甲素缀合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0154][0155]
在一些实施方案中，l可以选自-x-y-z-，其中x和z可以单独地且独立地是直接键、-ch
2-、-c(o)-、-so-、-so
2-、-opo-、-opo
2-，并且其中y是直接键、被取代的或未被取代的-(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)no(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)o(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nnh(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)nh(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)ns(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(ch2)ns(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)no(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)o(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nnh(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)nh(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)ns(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(ch2)ns(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(c
2-c6)炔基-、被取
代的或未被取代的-(ch2)no(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)o(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nnh(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)nh(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)ns(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(ch2)ns(c
2-c6)炔基-，其中每个烷基基团、烯基基团和炔基基团可以任选地被烷基、烷氧基、氨基、羟基、氧代、芳基、杂芳基、羧基、氰基、硝基、叠氮基或三氟甲基取代。n可以是选自0至6的整数。每个r可以独立地选自由以下组成的组：氢基团、烷基基团和乙酰基基团。
[0156]
在一些实施方案中，l可以选自-co(cr1r2)nco-、-(cr1r2)nco-、-co(cr1r2)
n-、-(cr1r2)nso-、-(cr1r2)nso
2-、-so(cr1r2)
n-、-so2(cr1r2)
n-、-so(cr1r2)nso-、-so2(cr1r2)nso
2-、、、n可以是选自0至6的整数。m可以是选自0至4的整数。每个r1和r2可以独立地选自氢、甲基、乙基和卤素。r3可以选自氢、甲基、乙基、丙基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、烷氧基、叠氮基和卤素。
[0157]
本文还公开了具有式(ii)的结构的葡萄糖-雷公藤甲素缀合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0158][0159]
在一些实施方案中，n可以是选自0至10的整数。在一些实施方案中，n可以是3。t&a部分可以是雷公藤甲素或其类似物中的一种。在一些实施方案中，t&a部分可以选自
[0160]
以及其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0161]
在一些实施方案中，糖部分可以选自在一些实施方案中，糖部分可以选自在一些实施方案中，糖部分可以选自以及其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0162]
本文还公开了具有式(iii)的结构的葡萄糖-雷公藤甲素缀合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物、立体异构体、非对映异构体或对映异构体。
[0163][0164]
在一些实施方案中，l可以选自-x-y-z-，其中x和z可以单独地且独立地是直接键、-ch
2-、-c(o)-、-so-、-so
2-、-opo-、-opo
2-，并且其中y是直接键、被取代的或未被取代的-(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)no(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)o(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nnh(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)nh(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)ns(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(ch2)ns(c
1-c6)烷基-、被取代的或未被取代的-(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)no(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)o(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nnh(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)nh(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)ns(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(ch2)ns(c
2-c6)烯基-、被取代的或未被取代的-(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)no(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)o(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nnh(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)nh(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)ns(c
2-c6)炔基-、被取代的或未被取代的-(ch2)nc(o)(ch2)ns(c
2-c6)炔基-，其中每个烷基基团、烯基基团和炔基基团可以任选地被烷基、烷氧基、氨基、羟基、氧代、芳基、杂芳基、羧基、氰基、硝基、叠氮基或三氟甲基取代。n可以是选自0至6的整数。每个r可以独立地选自由以下组成的组：氢基团、烷基基团和乙酰基基团。
[0165]
在一些实施方案中，l可以选自-co(cr1r2)nco-、-(cr1r2)nco-、-co(cr1r2)
n-、-(cr1r2)nso-、-(cr1r2)nso
2-、-so(cr1r2)
n-、-so2(cr1r2)
n-、-so(cr1r2)nso-、-so2(cr1r2)nso
2-、、、n可以是选自0至6的整数。m可以是选自0至4的整数。每个r1和r2可以独立地选自氢、甲基、乙基和卤素。r3可以选自氢、甲基、乙基、丙基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、烷氧基、叠氮基和卤素。
[0166]
提供了通过经由连接体将雷公藤甲素与葡萄糖缀合以形成葡萄糖-雷公藤甲素缀合物而产生的化合物。连接体可以选自4-羟基丁酸、邻苯二甲酸、1,5-戊二酸、琥珀酸等等。合成路线是有效的并且可以提供克量级葡萄糖-雷公藤甲素缀合物。与大部分(如果不是全部)现有的细胞毒性药物相比，化合物1在低氧下对癌细胞非常有效，这可能是由于在低氧条件下glut表达的增加。
[0167]
在一些实施方案中，葡萄糖-雷公藤甲素缀合物的合成可以遵循下文步骤，如下：
[0168][0169]
步骤1：t1的合成始于雷公藤甲素的c14羟基基团与连接体的酰化。
[0170][0171]
步骤2：糖基团的引入。糖化雷公藤甲素缩合型施密特供体或四-o-保护的-d-吡喃葡萄糖t2与雷公藤甲素连接体衍生物t1的合成给出中间体t3。r1可以分别选自c
1-c6烷基酰基保护基团、被取代的或未被取代的苯甲酰基保护基团、基于硅的保护基团、被取代的或未被取代的苄基保护基团、被取代的或未被取代的烯丙基保护基团等等；r1可以优先地选自对甲氧基苄基、1-氯乙酰基保护基团、三乙基甲硅烷基和苄基。r2是氢或cnhccl3。
[0172][0173]
步骤3：t3的脱保护可以提供糖化雷公藤甲素t4。
[0174]
可选择地，葡萄糖-雷公藤甲素缀合物的合成可以遵循下文步骤：
[0175][0176]
步骤1：葡萄糖与连接体的缀合。四-o-保护的-d-吡喃葡萄糖t6的合成始于t6的羟基基团与连接体的酰化。r1可以分别选自c
1-c6烷基酰基保护基团、被取代的或未被取代的苯甲酰基保护基团、基于硅的保护基团、被取代的或未被取代的苄基保护基团、被取代的或
未被取代的烯丙基保护基团等等；r1可以优先地选自对甲氧基苄基、1-氯乙酰基保护基团、三乙基甲硅烷基和苄基。
[0177][0178]
步骤2：雷公藤甲素的引入。糖化雷公藤甲素缩合的葡萄糖连接体衍生物t2与雷公藤甲素的合成以给出中间体t3。r1可以分别选自c
1-c6烷基酰基保护基团、被取代的或未被取代的苯甲酰基保护基团、基于硅的保护基团、被取代的或未被取代的苄基保护基团、被取代的或未被取代的烯丙基保护基团等等；r1可以优先地选自对甲氧基苄基、1-氯乙酰基保护基团、三乙基甲硅烷基和苄基。
[0179][0180]
步骤3：t3的脱保护可以提供糖化雷公藤甲素t4。
[0181]
作为葡萄糖-雷公藤甲素缀合物中癌细胞增殖的最有效抑制剂的化合物1的设计和合成被描述如下。糖化雷公藤甲素可以被分成三种结构组分：葡萄糖、雷公藤甲素和连接体。第一代糖化雷公藤甲素-1(化合物10)包含四碳琥珀酸酯连接体，产生先前被示出在人类中引起毒性的活化中间体。因此，我们选择了一系列新的连接体以连接葡萄糖和雷公藤甲素(表1)。简言之，附接在葡萄糖的c2位置处的那些连接体包括γ-羟基丁酸(化合物1)，将两个甲基基团添加到琥珀酸酯主链(化合物2和化合物3)，将苯基基团并入到琥珀酸酯主链中(化合物4和化合物5)，通过一个碳延长琥珀酸酯连接体(化合物6和化合物7)。此外，我们合成了两种包含c6取代的葡萄糖和琥珀酸酯连接体的衍生物(化合物8和化合物9)。然后，我们在hek293t细胞增殖测定中确定了新合成的糖化雷公藤甲素的效能(表1)。如所预期的，糖化雷公藤甲素具有比雷公藤甲素本身低的效能。在第二代糖化雷公藤甲素中，化合
物1明显比化合物10更有效，化合物10的ic
50
(71nm)比雷公藤甲素的ic
50
(5.6nm)高不到13倍。除了化合物8之外，其余的新的糖化雷公藤甲素类似物不如化合物10有效。但是与化合物1不同，化合物8在活化后将释放与化合物10相同的毒性雷公藤甲素-琥珀酸酯中间体。因此，随后的研究集中在化合物1的表征上。
[0182]
表1.雷公藤甲素(tpl)和葡萄糖缀合的雷公藤甲素的化学结构。
[0183]
[0184]
[0185][0186]
图1是根据本公开内容的一些实施方案的图示出糖化雷公藤甲素如何抑制癌细胞的增殖的提出的方案。
[0187]
作为葡萄糖-雷公藤甲素缀合物中癌细胞增殖的有效抑制剂的化合物1的设计和合成。糖化雷公藤甲素可以被分成三种结构组分：葡萄糖、雷公藤甲素和连接体。第一代糖化雷公藤甲素-1(化合物10)包含4-碳琥珀酸酯连接体，产生先前被示出毒性太大而不能用于人类的活化中间体。因此，我们选择了一系列可选择的连接体以连接葡萄糖和雷公藤甲素(表1)。简言之，附接在葡萄糖的c2位置处的这些连接体包括γ-羟基丁酸(化合物1)，将两个甲基基团添加到琥珀酸酯主链(化合物2和化合物3)，将苯基基团并入到琥珀酸酯主链(化合物4和化合物5)，以及通过一个碳延长琥珀酸酯连接体(化合物6、化合物7)。此外，我们还合成了两种包含c6取代的葡萄糖和琥珀酸酯连接体的衍生物(化合物8、化合物9)。然后，我们在hek293t细胞增殖测定中确定了新合成的糖化雷公藤甲素的效能(表1)。如所预期的，糖化雷公藤甲素具有比雷公藤甲素本身低的效能。在第二代糖化雷公藤甲素中，化合物1明显比糖化雷公藤甲素-1更有效，糖化雷公藤甲素-1的ic
50
(71nm)比雷公藤甲素的ic
50
(5.6nm)高约13倍。除了化合物8之外，其余的第二代糖化雷公藤甲素类似物不如化合物10有效。但是与化合物1不同，化合物8在活化后将释放与化合物10相同的毒性雷公藤甲素-琥珀酸酯中间体。因此，随后的研究集中在化合物1的表征上，在下文中被称为化合物2。
[0188]
化合物1是以xpb依赖性方式抑制细胞增殖的前药。我们最初设计糖化雷公藤甲素的前提是，这些缀合物将用作这样的前药，所述前药对xpb几乎没有抑制作用，直到它们进入癌细胞，在癌细胞中连接体被细胞内水解酶裂解以释放活性雷公藤甲素。因此，我们使用γ-[
32
p]-atp作为底物来确定化合物1对纯化的tfiih的dna依赖性atp酶活性的影响。在水
解后，释放的
32
pi可以使用薄层色谱法从底物中分离出来，并且用放射自显影术可视化。尽管tfiih的atp酶活性几乎完全被200nm雷公藤甲素抑制，但仅一小部分活性被2mm化合物1影响(图2a和图2b)。图2a-图2e示出化合物1是需要xpb结合以用于其抗增殖作用的前药。图2a-图2b示出化合物1在体外不抑制tfiih的atp酶活性，而雷公藤甲素(tpl)在低10倍的浓度有效地抑制活性。数据被表示为相对于dmso的释放的无机磷酸盐(
32
pi)的平均值
±
se(n＝3)。尽管化合物1对重组tfiih的atp酶活性具有可忽略不计的影响，但其以剂量依赖性方式抑制hek293t细胞增殖，比化合物10更有效(图2c和表1)。图2c示出用化合物1(圆形)、化合物10(方形)或tpl(菱形)处理在24h之后抑制细胞增殖。这些观察结果表明，化合物1是可以在细胞内部活化的无活性前药。为了确定化合物1的抗增殖作用是否是通过抑制xpb介导的，我们利用编码c342t xpb突变体的单个等位基因的工程化突变体细胞系t7115，其先前被示出对雷公藤甲素具有抗性(图2d)。图2d示出xpb c342t突变导致对雷公藤甲素的抗性。突变体xpb c342t在敲入细胞系t7115(深灰色三角形)中的表达导致雷公藤甲素抗性，但在表达野生型xpb的同基因细胞系(灰色三角形)中不导致雷公藤甲素抗性。增殖通过3h胸苷并入来测量并且使用graphpad prism作图。数据表示相对于dmso的平均值
±
sem(n＝3)。尽管野生型(wt)293t细胞被化合物1以剂量依赖性方式抑制，但同基因t7115突变体株系对化合物1具有抗性，表明化合物1通过抑制xpb起作用，使雷公藤甲素从化合物1的细胞内水解释放成为必要(图2e)。图2e示出仅表达c342t xpb突变体的xpb的敲入细胞系对化合物1(圆形)具有抗性，而增殖的抑制在表达wt(方形)xpb的同基因细胞系中观察到。增殖通过3h胸苷并入来测量并且使用graphpad prism作图。数据被表示为相对于dmso的平均值
±
sem(n＝3)。
[0189]
与化合物10相比，化合物1具有在人类血清中更大的稳定性和更高的相比正常细胞对癌细胞的选择性。为了使糖化雷公藤甲素实现相比其正常对应物对葡萄糖转运蛋白(glut)过度表达癌细胞的选择性，必要的是它们在血清中具有足够长的半衰期，以减少在它们进入肿瘤细胞中之前在血液中释放的游离雷公藤甲素的量。我们通过将化合物10和化合物1与人类血清孵育并检测游离雷公藤甲素的释放来确定化合物10和化合物1的稳定性。尽管化合物10在4h内经历降解以产生雷公藤甲素-琥珀酸酯中间体，并且在48h内产生大量的游离雷公藤甲素(图3a和图3b)，但化合物1在人类血清中孵育持续多达72h之后很大程度上保持完整(图3a)。这些结果表明，在人类血清中，化合物1比化合物10稳定得多。
[0190]
图3a-图3d示出了化合物1相对于化合物10在人类血清中具有增加的稳定性和对非恶性的原代细胞的较低的一般毒性。图3a示出了如通过串联hplc-ms监测的化合物10和化合物1在不同的孵育时间在人类血清中的水解。色谱图在a
218
处获取。图3b示出了化合物10和化合物1以及水解中间体10l和水解中间体1l的化学结构，该水解中间体10l和水解中间体1l随后释放雷公藤甲素(tpl)。
[0191]
表2.化合物1和化合物10在癌细胞和原代细胞中的生物活性。
[0192][0193][0194]
注：敏感细胞系(黑色)具有ic
50
《1μm，而不敏感的癌细胞系(红色)具有ic
50
≥1μm。示出了来自三个独立实验的平均ic
50
值及其标准偏差。n/a指示由于剂量曲线中缺乏s型响应而不适用。
[0195]a使用不等方差的学生t检验。
[0196]b化合物10相对于化合物1的ic
50
的p值。
[0197]
为了比较化合物1和化合物10对癌细胞的选择性，我们使用一组正常原代细胞来确定化合物1和化合物10用于抑制细胞生存力的ic
50
值，所述正常原代细胞包括人类脐血管内皮细胞(huvec)、乳腺上皮细胞(mec)、前列腺上皮细胞(pec)、肾近端小管(rpt)、气道上皮细胞(aec)、成纤维细胞和星形胶质细胞。化合物1对原代细胞的ic
50
值范围为从4mm至10.9mm，其显著高于范围为从0.26mm至6.5mm的对癌细胞系(除了肝细胞系snu-387和肺细胞系nci-h1299之外)的ic
50
值(图3c，表2)。图3c示出了如通过xtt测定测量的原代细胞生存力与多个癌细胞系相比呈现出对化合物1的降低的敏感性。肝癌细胞系、肺癌细胞系、黑素瘤细胞系和胰腺癌细胞系对化合物1处理响应不佳。huvec＝人类脐血管内皮细胞，mec＝乳腺上皮细胞，pec＝前列腺上皮细胞，rpt＝肾近端小管，aec＝气道上皮细胞。数据被表示为相对于dmso的平均值
±
sem生存力(n＝3-7)。这代表了相比化合物10的显著改善，化合物10对于每种原代细胞类型具有较低的ic
50
值，并且对于大多数癌细胞系具有相当的ic
50
值(图3d和表2)。图3d示出了化合物1在原代细胞中的毒性小于化合物10。原代细胞示出与化合物1相比对化合物10的增加的敏感性，如通过xtt生存力测定测量的。化合物10的平均ic
50
显著低于化合物1的平均ic
50
，p《0.01。huvec＝人类脐血管内皮细胞，mec＝乳腺上皮细胞，pec＝前列腺上皮细胞，rpt＝肾近端小管，aec＝气道上皮细胞。数据代表相对于dmso的平均值
±
sem生存力(n＝3-7)。我们还注意到，癌细胞系似乎在其对化合物1和化合物10的敏感性方面根据组织或器官来源分离(segregate)。在所测试的有限数目的癌细胞系的情况下，前列腺癌细胞和乳腺癌细胞看起来比肝癌细胞和肺癌细胞更敏感(图3c，表2)。
[0198]
化合物1通过与xpb相互作用来引起rnapii的催化rpb1亚基的降解。我们和其他人先前已经示出雷公藤甲素诱导rnapii的催化rpb1亚基的降解，这是雷公藤甲素的标志性细胞效应中的一种。使用免疫染色，我们观察到化合物1还引起hela细胞中rpb1的降解(图4a)。图4a-图4f示出了化合物1诱导的rna聚合酶2降解是xpb依赖性的。图4a-图4b示出了用1mm化合物1处理持续24h耗尽内源性rna聚合酶ii(rnapii)；而10mm螺内酯(sp)或dmso本身不影响固定的hela细胞中的蛋白质水平，所述固定的hela细胞被加工用于rpb1(rnapii的催化亚基)和dapi(核标志物)的免疫细胞化学染色。用10mm螺内酯预处理细胞显著地(p《0.001)从化合物1诱导的降解中拯救内源性rnapii。rpb1和dapi染色的代表性图像被示出，连同细胞内rpb1的定量和学生t检验分析。数据被表示为相对于dmso的平均值
±
se rpb1水平(n＝3)。除了雷公藤甲素之外，已知的甾体药物螺内酯(sp)已经被报告为结合xpb。然而，与雷公藤甲素不同，sp诱导蛋白酶体介导的xpb降解，而没有明显的细胞毒性。在10mm时，sp引起大部分xpb的降解(图4c)，但对rpb1的稳定性没有影响(图4b)。图4c示出了螺内酯降解xpb，而雷公藤甲素需要野生型xpb以用于rpb1的降解。用增加浓度的螺内酯(sp)处理的细胞的全细胞裂解物经受使用对xpb特异性的抗体的蛋白质印迹分析，示出螺内酯以剂量依赖性方式诱导细胞中内源性xpb的降解。为了确定sp对xpb的耗尽是否拮抗从糖化雷公藤甲素释放的雷公藤甲素对rpb1的降解，我们用1mm化合物1和10mm sp的组合处理细胞。用sp共处理从由化合物1诱导的降解中拯救rpb1。使用蛋白质印迹分析以检测rpb1蛋白的内源性水平获得类似的结果(图4d)。图4d示出了用化合物1、sp或组合处理的细胞的全细胞裂解物经受使用对rpb1特异性的抗体的内源性rnapii的蛋白质印迹分析，示出在1mm或3mm时化合物1诱导的rnapii降解被10mm sp所拮抗。为了进一步证实由化合物1诱导的rpb1降解需要
释放的雷公藤甲素与xpb的结合，我们确定了在处理wt细胞系和c342t突变体细胞系两者后rpb1的水平。尽管在wt细胞中存在化合物1的情况下观察到rpb1的降解(图4d)，但即使当化合物1的浓度在c342t xpb突变体细胞系中达到3mm时，rpb1水平仍保持稳定(图4e)。图4e示出了来自仅表达c342t xpb的同基因敲入细胞的全细胞裂解物，其示出如通过对rpb1的免疫印迹测量的化合物1对rnapii的催化亚基的降解在不存在wt xpb的情况下受到抑制。相比之下，rpb1相互作用抑制剂α-鹅膏蕈碱在c342t xpb同基因细胞系中在1mm诱导rpb1的降解。肌动蛋白被用作加载对照。比例尺，20mm。该结果证实了用sp和雷公藤甲素所得到的观察结果(图4f)，表明由化合物1诱导的rpb1的降解需要从化合物1释放的雷公藤甲素与xpb的共价结合。图4f示出了具有野生型(293t wt)xpb或雷公藤甲素抗性突变体(xpb c342t)xpb的同基因细胞用0.1mm雷公藤甲素处理，然后裂解以用于使用抗rpb1特异性抗体的蛋白质印迹分析。与雷公藤甲素暴露的具有xpb c342t突变的细胞(其中rpb1水平类似于dmso对照)相比，用雷公藤甲素处理导致wt xpb细胞中rnapii降解的rpb1亚基的降解。gapdh被用作加载对照。
[0199]
化合物1经由线粒体介导的凋亡途径的活化来诱导癌细胞的凋亡。已知雷公藤甲素在许多癌细胞系中诱导凋亡。我们通过检查hela细胞在暴露于化合物1后的细胞形态来研究化合物1的细胞效应。化合物1引起膜起泡和核破碎，指示凋亡(图5a和图5b)。图5a-图5e示出化合物1诱导凋亡信号传导。图5a和图5b示出了亮相显微照片，指示与化合物1处理，尤其是与使用3mm化合物1(其中大量细胞聚拢和起泡(具有黑色星号的插图))相比，在dmso暴露的情况下的最小的细胞病理学。如通过使用hoechst 33258染色的细胞化学分析检测的，聚拢的hela细胞中的核破碎通过化合物1处理显著增加(具有两个白色星号的插图)，而在dmso中没有显著增加。数据被表示为核破碎的细胞相对于总细胞的百分比
±
se(n＝3)。具有核破碎的细胞的百分比在1mm化合物1的存在下从6％增加至23％，并且在用3mm化合物1处理后增加至53％。化合物1诱导细胞色素c从线粒体释放到细胞溶质中，这是内在凋亡途径的活化中的关键步骤(图5c)。图5c示出了通过线粒体的离心分离随后使用细胞色素c特异性抗体进行蛋白质印迹分析评估的在化合物1处理期间的细胞色素c释放。hela细胞暴露于3mm化合物1触发细胞色素c从线粒体(m)到细胞溶质(c)的释放。肌动蛋白特异性抗体和vdac1特异性抗体分别用于确保细胞质和线粒体分级的效率。如所预期的，化合物1剂量依赖性地活化胱天蛋白酶-3，这伴随着parp1的裂解(图5d)。图5d示出了在化合物1处理期间全细胞裂解物的活性胱天蛋白酶3(a-casp3)和parp1的蛋白质印迹分析，这示出胱天蛋白酶3活化的剂量依赖性增加。随着化合物1的浓度增加，还观察到通过活性胱天蛋白酶3的明显的parp1裂解。与rpb1降解类似，parp1的裂解需要xpb，因为用较高浓度的sp共处理防止胱天蛋白酶-3对parp1的裂解(图5e)。图5e示出了10mm螺内酯对细胞中xpb的降解，其抑制了化合物1诱导的凋亡信号传导，如通过经受蛋白质印迹分析的全细胞裂解物中的减少的parp1裂解所指示的。肌动蛋白被用作加载对照。比例尺，20mm。总之，这些结果表明化合物1通过诱导细胞色素c释放并随后活化hela细胞中的胱天蛋白酶-3来活化线粒体介导的凋亡途径。
[0200]
化合物1示出在体内对肿瘤生长的持续抑制和延长的存活。我们先前已经示出化合物10在实验性转移性前列腺癌小鼠模型中在体内呈现出持续的抗肿瘤活性。使用相同的动物模型，我们评估了化合物1与化合物10并行的抗肿瘤效力。因此，表达萤火虫萤光素酶
的pc3前列腺癌细胞作为报告物(reporter)通过尾静脉被注射到动物中。在肿瘤细胞注射之后三周，化合物1和化合物10以不同剂量每天一次通过腹膜内注射来施用，持续总共30天。每周通过生物发光成像监测肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞的快速生长和转移到其他器官在未经处理的动物中出现，到第4周杀死所有未经处理的动物(图7a)。图7a-图7b示出化合物1在体内前列腺癌模型中改善了存活。图7a示出化合物1和化合物10在转移性前列腺癌模型中具有相似的最大耐受剂量(mtd)。在通过生物发光成像确认nod/scid/il2r
null
小鼠中的肿瘤生长之后，每日施用1mg/kg的化合物10或化合物1持续30天被动物耐受，并且能够在整个处理过程中抑制肿瘤生长。化合物10或化合物1的抗肿瘤作用在处理后2周持续存在。对于给药1mg/kg化合物10的动物，肿瘤细胞在处理的第2周被清除，并且直到在停止处理之后两周才恢复(图7a)。相比之下，接受相同剂量的化合物1的动物在停止处理两周之后具有不可检测的癌细胞水平，表明化合物1在体内比化合物10更有效(图7a)。尽管化合物1和化合物10被施用持续仅30天，但它们都显著延长了动物的存活，远远超过了四周的处理窗口(图7b)。图7b示出了kaplan-meier曲线，示出对照处理、化合物10处理或化合物1处理的存活时间(在处理开始之后的天数[n＝5])。中值存活时间(天数)如下：未经处理的＝27，dmso＝29，化合物10(1mg/kg)＝76，化合物1(0.25mg/kg)＝46，化合物1(0.5mg/kg)＝76，化合物1(1mg/kg)＝84。此外，在用化合物1处理后的延长的存活与由最高剂量的化合物1获得的最长存活是剂量依赖性的(未经处理的组26天相对于1mg/kg化合物1处理组86天)。此外，卡方分析示出1mg/kg化合物10的存活曲线与0.5mg/kg化合物1没有显著不同(在p＝0.05时不否决零假设)。相比之下，1mg/kg的化合物1的存活曲线与相同剂量的化合物10显著不同(在p＝0.001时否决零假设)。以0.5mg/kg给予的化合物1导致与1mg/kg的化合物10相同的总存活，这与化合物1在体外在肿瘤细胞系中与化合物10相比较高的效能一致。
[0201]
化合物1在低氧条件下比在常氧条件下对癌细胞更有效。由于快速生长的肿瘤中缺乏足够的血管密度，肿瘤微环境是低氧的。因此，肿瘤细胞上调hif-1的表达，这进而驱动许多促存活和促血管生成因子包括多药耐药(mdr)泵和glut的表达。在低氧下mdr和glut的上调使肿瘤细胞对化学治疗药物具有抗性。有趣的是，由于葡萄糖部分的存在，在低氧下葡萄糖转运蛋白的上调应该使癌细胞更易受化合物1的影响。为了测试这种可能性，我们使用前列腺癌细胞系pc3来确定低氧对癌细胞对化合物1的敏感性的影响，因为增加的hif-1α在转移性前列腺活检中示出。因此，将pc3细胞在低氧(1％ o2)条件或常氧(20％ o2)条件下培养。如所预期的，hif-1α在常氧条件下不存在，但在低氧下被显著地诱导(图6a)。图6a-图6f示出低氧增强化合物1的抗增殖作用。图6a示出了使用对hif-1α特异性的抗体的固定的细胞的免疫细胞化学分析，示出与pc3细胞中的常氧(20％ o2)相比，暴露于低氧(1％ o2)持续24h使内源性hif-1α稳定化。内源性hif-1α的蛋白质印迹分析揭示了伴随着glut1水平的对应增加的hif-1α的类似增加(图6b)。图6b示出了全细胞裂解物的内源性hif-1α的蛋白质印迹分析，这指示与常氧相比在低氧期间的增加，这也对应于葡萄糖转运蛋白1(glut1)的增加。在低氧下还增加显色葡萄糖类似物2-nbdg的摄取。重要的是，pc3细胞在低氧条件下对化合物1变得更敏感，其中从在常氧条件下427nm的ic
50
降低到81nm的ic
50
(图6c)，而雷公藤甲素的ic
50
在从常氧切换到低氧后从4.5nm适度降低到1.5nm。图6c示出了低氧增强化合物1在处理后48h的抗增殖作用，如通过3h胸苷并入测量的，而用多柔比星和低氧共处理降低了药物效能。雷公藤甲素(tpl)示出适度的抗增殖作用。数据被表示为相对于dmso的平均值
±
se(n＝3)。用hela和mda mb231也观察到在低氧下对化合物1的增强的易感性的相同趋势(图8a-图8h)。
[0202]
图8a-图8h示出了低氧影响癌细胞对化合物1的敏感性。与mcf-7(图8e)或hepg2(图8g)相比，hela细胞(图8a)和mda mb231细胞(图8b)暴露于低氧环境增强了化合物1在处理后48h的抗增殖作用，如通过3h胸苷并入测量的，其中在低氧期间观察到适度的增强或抗性。雷公藤甲素(tpl)在除了在低氧示出抗性的hepg2之外的所有测试的细胞中示出适度的抗增殖作用。增殖通过3h胸苷并入来测量并且使用graphpad prism作图。数据表示相对于dmso的平均值
±
sem(n＝3)。
[0203]
与化合物1相比，多柔比星的效能在低氧下被降低(图6c)。rnapii的降解，一种通过雷公藤甲素抑制xpb的指标(图4a-图4f)，早在低氧下用化合物1处理之后6h观察到，而在常氧条件中未观察到(图6d)，其中化合物1诱导的rpb1的降解也以xpb依赖性方式发生(图4a-图4f)。图6d示出了使用对rpb1特异性的抗体的免疫细胞化学，这指示细胞暴露于低氧在6h之后触发通过3mm化合物1的rnapii亚基rpb1降解的早期发生。为了验证这种敏感性的差异是否是由于在低氧条件下glut1水平和功能的上调(图6b)，我们利用了glut1抑制剂wzb117。glut抑制剂wzb117的添加消除了在低氧(1％ o2)条件下化合物1对pc3细胞中内源性rnapii的快速降解(图6e)，指示在低氧期间的glut1上调有助于在低氧条件下化合物1对内源性rnapii的快速降解。图6e示出了经受使用抗rpb1特异性抗体的蛋白质印迹的全细胞裂解物，这示出10mm葡萄糖转运蛋白1抑制剂wzb117拮抗由3mm化合物1和低氧触发的rnapii降解的早期发生。为了进一步评估glut1上调在对化合物1的低氧诱导的敏化中的作用，我们检查了在常氧(20％氧气)条件和低氧(1％氧气)条件下化合物1对wtdld-1及其同基因glut1敲除细胞系两者的增殖的影响。与在低氧条件下的glut1敲除细胞系(ic
50
：2.5mm)相比，wt dld-1细胞对化合物1更敏感(ic
50
：1.3mm)，指示对化合物1的低氧诱导的敏化的glut1依赖性(图6f)。相比之下，在常氧下，在dld-1wt和glut1ko之间未观察到敏感性的差异。图6f示出了与dld-1glut1敲除(glut1 ko)细胞相比，暴露于低氧的dld-1wt细胞呈现出对化合物1的增强的敏感性。在常氧下，在dld-1wt和glut1 ko之间未观察到敏感性的差异。数据被表示为相对于dmso的平均值
±
sem(n＝3)。比例尺，20mm。总之，这些结果揭示，与大多数现有的抗癌剂相比，化合物1在低氧下对肿瘤细胞更有效，使其成为具有潜在增强的体内抗肿瘤活性的独特的抗癌剂。
[0204]
大多数细胞毒性抗癌药物，包括目前在临床上使用的那些细胞毒性抗癌药物诸如紫杉醇、多柔比星和环磷酰胺，通过阻断与正常细胞共享的必需细胞蛋白质靶来发挥其对癌细胞的抗增殖作用和促凋亡作用。因此，不令人惊讶的是，这些化学治疗剂对患者具有严重的不良作用。由rnapii介导的转录对于哺乳动物细胞增殖和生长是必需的。因此，不令人惊讶的是，癌细胞易受雷公藤甲素的影响，雷公藤甲素通过xpb/tfiih的共价修饰，伴随着以xpb依赖性方式诱导的rnapii的rpb1催化亚基的降解来阻断rnapii介导的mrna合成(图4f)。鉴于rnapii介导的转录在正常细胞中的至关重要的作用，雷公藤甲素的毒性也可以归因于相同的机制，使得鉴于共享的分子机制，难以降低雷公藤甲素的毒性而不损害其抗肿瘤效力。通过将雷公藤甲素与葡萄糖缀合，通过利用与大多数正常组织相比在快速生长的肿瘤细胞中表达的更高水平的葡萄糖转运蛋白来实现对癌细胞的选择性。在本研究中，我们已经鉴定了第二代糖化雷公藤甲素类似物化合物1，其满足我们关于相比正常细胞对肿
瘤细胞的显著增强的选择性、改善的血清稳定性和在pc-3肿瘤模型中持续的抗肿瘤活性的预期。重要的是，在表征化合物1的过程中，我们发现与在体外的常规的细胞毒性药物相比，化合物1在低氧下获得抗肿瘤效能，表明在癌症治疗期间克服抗药性的新兴策略。
[0205]
被称为化合物1的第二代糖化雷公藤甲素的最佳先导在许多方面优于第一代化合物10。首先，血浆酯酶对化合物10的降解产生了高毒性的中间体，该中间体先前在1期临床试验中被证明对二十名受试者中的两名受试者是致命的。尽管化合物10中间体的毒性的机制基础仍然是未知的，但我们的来自有限数目的原代人类细胞的数据指示与化合物10相比，化合物1在非癌细胞中的显著更低的毒性(图3d)。化合物10中间体的所报告的毒性发生在接受最高剂量的治疗的两名患者中，表明剂量限制性毒性。来自以18mg/m2给药的致死病例的f60008和雷公藤甲素的最大血清水平分别为1,361ng/ml(～2.96mm)和58.5ng/ml(～0.16mm)。我们使用原代人类细胞进行的基于细胞的生存力测定示出化合物10的ic
50
值范围为从1.37mm至5.6mm(图3d和表2)，其包括使用18mg/m
2 f60008的致死病例中f60008的上文报告的血浆浓度。我们先前使用较小的原代人类细胞组还已经示出，雷公藤甲素的ic
50
范围为从0.0042mm至0.0235mm，其比来自致死病例的雷公藤甲素的最大血清浓度低7倍至38倍。总之，用化合物10中间体f60008观察到的毒性是部分剂量依赖性的，因为在施用《12mg/m
2 f60008的20名患者中的18名患者中没有观察到致命性。通过用糖苷键替换与葡萄糖的酯键，潜在的中间体将是预期具有较小毒性的醇。更重要的是，鉴于与化合物10相比，化合物1在人类血清中大得多的稳定性，预期该醇降解中间体的量被显著减少，进一步降低化合物1的潜在毒性(图3a)。其次，与化合物10相比，化合物1在人类血清中呈现出更大的稳定性(图3a)。这可能归因于连接体和葡萄糖部分之间的糖苷键，该糖苷键需要与化合物10中相应的酯键不同类型的水解酶。血清稳定性的增加使化合物1成为用于药物开发的潜在更好的先导，因为化合物1是前药，并且血清中的过早降解将释放可能对正常组织施加毒性的游离雷公藤甲素。第三，化合物1示出相比于对癌细胞的子集对正常细胞更低的细胞毒性(图3c)。有趣的是注意到，不同类型的癌系呈现出不同的敏感性。在所测试的有限的癌细胞系中，看起来前列腺癌、乳腺癌和头颈癌对化合物1特别敏感。相比之下，黑素瘤系、胰腺癌系、肺癌系和肝癌系看起来对化合物1不太敏感，其中与正常细胞相比，平均ic
50
值相当或者甚至更高。将需要对大量的癌细胞系和培养的患者来源的肿瘤细胞的集合的广泛谱系分析，以全面地确定化合物1对某些类型的癌症诸如前列腺的癌症的选择性毒性是否成立。
[0206]
除了化合物1在体外独特的抗癌活性之外，化合物1在体内在pc3异种移植物模型中也呈现出持续的抗肿瘤活性(图7a-图7b)。癌细胞在停止用化合物1处理之后两周未能重新出现，但在停止用化合物10处理之后两周重新出现。与化合物10相比，在用化合物1处理之后癌细胞的较慢的再现也与经化合物1处理的动物的较长的存活一致。0.5mg/kg的化合物1与1mg/kg的化合物10在体内延长异种移植物模型动物的存活方面一样有效。更大的血清稳定性，与癌细胞的子集相比对正常细胞的更低的细胞毒性，以及在低氧下对癌细胞的增加的效力连同体内化合物1的持续的抗肿瘤活性使得该糖化雷公藤甲素类似物成为用于进一步开发作为一种靶向转录的抗癌药物的有前景的主要候选物的感兴趣的实例。
[0207]
已知实体瘤的微环境是低氧的，并且低氧已经被示出在肿瘤细胞中赋予对细胞毒性抗癌药物的抗性，这是癌症疗法的主要障碍。由于已知低氧上调癌细胞表面上的glut表达并且鉴于glut赋予肿瘤细胞对糖化雷公藤甲素的选择性，因此我们研究了低氧对化合物
1的效能的影响。在低氧期间用于抑制癌细胞增殖的化合物1的效能的增加与广泛使用的、fda批准的抗癌药物多柔比星的效能的降低形成对比(图6c和图8a-图8h)。化合物1作为抗癌药物候选物的这一特征提供了在其他常规的抗癌药物遇到抗性的情况下在低氧下对癌细胞更有效的另外的的优点。还有趣的是注意到，与多柔比星不同，雷公藤甲素本身在其在低氧条件下对癌细胞生长的抑制作用方面还示出适度的增强，而不是减弱。这可能部分地归因于其对需要tfiih和rnapii的hif-1的转录活性的抑制。因为低氧涉及基因的转录以使癌细胞的存活适应低氧条件，所以雷公藤甲素抑制哺乳动物转录起始的能力可以抑制hif驱动的低氧活化的基因的转录，低氧活化的基因的转录促进经历低氧的癌细胞的增殖。在低氧下用雷公藤甲素处理癌细胞抑制hif-1α靶基因vegf、bnip3和caix的转录，包括低氧反应元件(hre)驱动的萤光素酶报告物。雷公藤甲素处理还逆转了低氧诱导的上皮-间充质转变，解释了观察到的雷公藤甲素的体外抗增殖作用的三倍增强(图6c)。在低氧期间癌细胞中glut的增加的表达还放大了化合物1对低氧癌细胞的增殖的转录抑制的影响，如在低氧期间化合物1ic
50
的五倍增加所看到的(图6c)。化合物1中雷公藤甲素与葡萄糖的缀合将低氧期间雷公藤甲素的效应量(effect size)从单独的雷公藤甲素处理期间的0.71增强到经化合物1处理的低氧pc3细胞中的64.89。与亲本dld-1细胞相比，低氧dld-1glut1敲除细胞的降低的敏感性证明了低氧癌细胞中增强的化合物1诱导的抗增殖的glut1依赖性(图6f)。尽管在hela和三阴性乳腺癌细胞系mda mb231中也观察到在低氧下对葡萄糖缀合的雷公藤甲素化合物1的增强的敏感性(图8a-图8h)，但这种效应没有在所有测试的细胞系中观察到，因为肝癌细胞系hepg2在低氧下仍然对化合物1具有抗性。尽管癌细胞对化合物1有明显的组织特异性敏感性，但我们的结果表明，有效的非特异性抗增殖剂与葡萄糖的缀合为在低氧条件中靶向癌细胞诸如实体瘤中的癌细胞提供了有前景的策略。这一发现为通过细胞毒性药物与葡萄糖的缀合来对抗实体瘤中低氧诱导的抗药性提供了尽管可行但可选择的策略。
[0208]
总而言之，雷公藤甲素是已经使用了几个世纪的来自传统中国药用植物的关键成分。它通过对一般转录因子tfiih的xpb亚基的不可逆的抑制，有效地阻断转录起始而具有有效的抗肿瘤活性。它作为抗癌药物的潜在发展已经受到其毒性和在水中的不溶性的限制。为了解决这些问题，我们已经设计并合成了雷公藤甲素的葡萄糖缀合物，其呈现出较低的毒性和体内持续的抗肿瘤活性。然而，先前的先导糖化雷公藤甲素释放出潜在有毒的降解中间体，使其不适合作为药物候选物。通过使用将雷公藤甲素与葡萄糖连接的分子连接体，我们鉴定了具有增强的血清稳定性和对正常细胞降低的毒性的糖化雷公藤甲素。重要的是，与癌细胞在低氧下对其获得抗性的大多数细胞毒性抗癌药物相比，糖化雷公藤甲素化合物在低氧条件下对癌细胞更有效，这可能是由于葡萄糖转运蛋白的上调。化合物1示出了体内持续的抗肿瘤活性，并且显著延长了经处理的动物的存活。这些发现表明，细胞毒性药物与葡萄糖的缀合通常可能是克服抗药性的可行策略，并且该化合物是用于作为靶向的抗癌前药进一步开发的有前景的候选物。
[0209]
术语“治疗”在本文中与术语“治疗方法”可互换地使用，并且指的是以下两者：1)治愈、减缓、减轻诊断出的病理状况、疾病或紊乱的症状和/或停止诊断出的病理状况、疾病或紊乱的进展的治疗性治疗或措施，以及2)防治性/预防性措施。需要治疗的个体可能包括已经患有特定医学疾病或紊乱的个体，以及可能最终获得紊乱的个体(即，需要预防性措施
的个体)。
[0210]
如本文使用的术语“受试者”指的是对其进行本主题方法的任何个体或患者。通常，受试者是人类，尽管如本领域技术人员将理解的，受试者可以是动物。
[0211]
本文还公开了包含具有式(i)、式(ii)、式(iii)的结构的化合物或化合物1的药物组合物。术语“药学上可接受的载体”指的是可以与本公开内容的化合物一起被施用至患者并且不破坏本公开内容的化合物的药理学活性的无毒载体。可以用于这些组合物的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白诸如人类血清白蛋白，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和的植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇以及羊毛脂。
[0212]
在仅包含本文描述的化合物作为活性组分的药物组合物中，用于施用这些组合物的方法可以另外地包括向受试者施用另外的剂或疗法的步骤。这样的疗法包括但不限于贫血疗法，糖尿病疗法，高血压疗法，胆固醇疗法，神经药理学药物，调节心血管功能的药物，调节炎症、免疫功能、血细胞的产生的药物；激素和拮抗剂，影响胃肠功能的药物，微生物疾病的化学治疗剂，和/或肿瘤疾病的化学治疗剂。其他药理学疗法可以包括在任何药物类别中发现的任何其他药物或生物制剂。例如，其他药物类别可以包括过敏/感冒/ent疗法、镇痛剂、麻醉剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗病毒剂、哮喘/肺部疗法、心血管疗法、皮肤病学疗法、内分泌/代谢疗法、胃肠疗法、癌症疗法、免疫学疗法、神经病疗法、眼科疗法、精神病疗法或风湿病疗法。可以与本文描述的化合物一起施用的剂或疗法的其他实例包括基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞因子拮抗剂、免疫抑制剂、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、前列腺素或抗血管过度增殖化合物。
[0213]
如本文使用的术语“治疗有效量”指的是活性化合物或药物剂的量，该量引起由研究者、兽医、医生或其他临床医师所寻求的组织、系统、动物、个体或人类中的生物学或医学应答，该生物学或医学应答包括以下中的一种或更多种：(1)预防疾病；例如，预防可能易患疾病、状况或紊乱但尚未经历或呈现疾病的病理学或症状学的个体的疾病、状况或紊乱，(2)抑制疾病；例如，抑制正在经历或呈现疾病、状况或紊乱的病理学或症状学的个体的疾病、状况或紊乱(即，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；以及(3)改善疾病；例如，改善正在经历或呈现疾病、状况或紊乱的病理学或症状学的个体的疾病、状况或紊乱(即，逆转病理学和/或症状学)。
[0214]
如本文使用的，术语“组合”、“组合的”和相关术语指的是根据本公开内容的治疗剂的同时施用或依次施用。例如，所描述的化合物可以与另一种治疗剂以单独的单位剂型同时或依次地施用或者以单一单位剂型一起施用。因此，本公开内容提供了包含所描述的化合物、另外的治疗剂和药学上可接受的载体、辅料或媒介物的单一单位剂型。当患者或个体被同时暴露于两种剂时，两种或更多种剂通常被认为被“组合地”施用。在许多实施方案中，当患者或个体在特定的靶组织或样品中(例如，在脑中、在血清中等)同时示出剂的治疗相关水平时，两种或更多种剂被认为被“组合地”施用。
[0215]
当本公开内容的化合物与其他剂以组合疗法被施用时，它们可以被依次或同时地施用至患者。可选择地，根据本公开内容的药物组合物或防治性组合物包含伊维菌素
(ivermectin)或本文描述的任何其他化合物与另一种治疗剂或防治剂的组合。通常被施用以治疗特定疾病或状况的另外的治疗剂可以被称为“适合于所治疗的疾病或状况的剂”。
[0216]
本公开内容的组合物和方法中使用的化合物还可以通过附加适当的官能团来修饰以增强选择性生物学性质。这样的修饰是本领域已知的，并且包括增加进入给定生物学系统(例如，血液、淋巴系统或中枢神经系统)中的生物学渗透、增加口服利用度、增加溶解度以允许通过注射施用、改变代谢和/或改变排泄速率的修饰。
[0217]
根据优选的实施方案，本公开内容的组合物被配制用于药物施用至受试者或患者，例如哺乳动物，优选地人类。这样的药物组合物被用于改善、治疗或预防受试者的本文描述的疾病中的任一种。
[0218]
本公开内容的剂通常作为药物组合物被施用，所述药物组合物包含活性治疗剂，即和多种其他药学上可接受的组分。参见remington's pharmaceutical science(第15版,mack publishing company,easton,pa.,1980)。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。取决于期望的制剂，组合物还可以包含药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。稀释剂被选择，以便不影响组合的生物学活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包含其他载体、辅料或无毒、非治疗性、非免疫原性的稳定剂及类似物。
[0219]
在一些实施方案中，本公开内容提供了药学上可接受的组合物，其包含与一种或更多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的一种或更多种所描述的化合物，用于治疗本文描述的疾病，包括但不限于癌症。虽然可以单独施用所描述的化合物，但优选的是将所描述的化合物作为如本文描述的药物制剂(组合物)施用。所描述的化合物可以与其他药物类似地被配制用于以用于在人类医学或兽医医学中使用的任何方便的方式施用。
[0220]
如详细地描述的，本公开内容的药物组合物可以被专门配制用于以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些形式：口服施用，例如灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，例如目的用于口腔吸收、舌下吸收和全身吸收的片剂，用于施加至舌的大丸剂(bolus)、粉末、颗粒剂、糊剂；肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放制剂通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；局部施加，例如作为施加至皮肤、肺或口腔的乳膏、软膏或控制释放贴剂或喷雾剂；阴道内地或直肠内地，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；舌下地；经眼地；经皮地；或者经鼻地、肺部和至其他粘膜表面。
[0221]
润湿剂、乳化剂和润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和增香剂(perfuming agent)、防腐剂以及抗氧化剂也可以存在于组合物中。
[0222]
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠及类似物；油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚及类似物；以及金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及类似物。
[0223]
用于根据本公开内容使用的制剂包括适合于口服施用、鼻施用、局部(包括含服和
舌下)施用、直肠施用、阴道施用和/或肠胃外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。通常，该量将在从约1％至约99％的活性成分的范围内。在一些实施方案中，该量将在从约5％至约70％、从约10％至约50％、或从约20％至约40％的范围内。
[0224]
在某些实施方案中，如本文描述的制剂包含选自由环糊精、脂质体、胶束形成剂例如胆汁酸以及聚合物载体例如聚酯和聚酸酐组成的组的赋形剂；以及本公开内容的化合物。在某些实施方案中，先前提及的制剂使得本公开内容的所描述的化合物口服可生物利用。
[0225]
制备包含所描述的化合物的制剂或组合物的方法包括使本公开内容的化合物与载体和任选地一种或更多种辅助成分结合的步骤。一般来说，制剂可以通过以下来制备：使本公开内容的化合物与液体载体或细分的固体载体或两者均匀地且紧密地结合，并且然后如果必要的话，将产品成形。
[0226]
药物组合物可以呈无菌可注射制品的形式，例如作为无菌可注射水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(诸如，例如tween 80)和悬浮剂来配制。无菌可注射制品也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，如在1,3-丁二醇中的溶液。在可以被采用的可接受的媒介物和溶剂中的是甘露糖醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油常规地被用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射剂，天然的药学上可接受的油诸如橄榄油或蓖麻油(尤其是呈其聚氧乙基化形式)也是如此。这些油溶液或悬浮液还可以包含长链醇稀释剂或分散剂，诸如pharmacopeia helvetica中描述的那些，或类似的醇。其他常用的表面活性剂诸如tween、span和其他乳化剂或通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型的生物利用度增强剂也可以用于配制的目的。
[0227]
在一些情况下，为了延长药物的效果，减缓来自皮下注射或肌内注射的药物的吸收可以是合意的。这可以通过使用具有差的水溶解度的结晶材料或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率进而可以取决于晶体尺寸和结晶形式。可选择地，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中来实现。
[0228]
可注射的储库(depot)形式通过在可生物降解的聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成所描述的化合物的微胶囊基质来制备。取决于药物与聚合物的比例和所采用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射的制剂还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
[0229]
本公开内容的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂和水性悬浮液和溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当水性悬浮液和溶液以及丙二醇被口服地施用时，活性成分
与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
[0230]
本文描述的适合于口服施用的制剂可以呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基底(flavored basis)，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)、粉末、颗粒剂的形式，或作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆剂，或作为软锭剂(pastille)(使用惰性基底，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)和/或作为漱口剂及类似物，其各自包含预定量的本公开内容的化合物作为活性成分。本文描述的化合物还可以作为大丸剂、舐剂(electuary)或糊剂被施用。
[0231]
在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒剂及类似物)中，活性成分与一种或更多种药学上可接受的载体混合，所述载体诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或以下中的任一种：填充剂或增量剂(extender)，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯树胶；保湿剂，诸如甘油；崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；溶液阻滞剂，诸如石蜡；吸收促进剂，诸如季铵化合物；润湿剂，诸如例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子型表面活性剂；吸收剂，诸如高岭土和膨润土粘土；润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；以及着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物还可以被用作在使用赋形剂诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇及类似物的软壳明胶胶囊和硬壳明胶胶囊中的填充剂。
[0232]
片剂可以通过任选地与一种或更多种辅助成分一起压缩或模制来制备。压缩的片剂可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制的片剂可以在合适的机器中制备，在所述机器中粉末状化合物的混合物用惰性液体稀释剂润湿。如果使用固体载体，则制品可以呈片剂形式，以粉末或丸粒形式放置在硬明胶胶囊中，或者呈糖锭剂或锭剂的形式。固体载体的量将例如从约25mg至800mg，优选地约25mg至400mg变化。当使用液体载体时，制品可以例如呈糖浆剂、乳剂、软明胶胶囊、无菌可注射液体诸如安瓿或非水性液体悬浮液的形式。在组合物呈胶囊的形式的情况下，任何常规封装都是合适的，例如在硬明胶胶囊壳中使用先前提及的载体。
[0233]
片剂和其他固体剂型诸如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂可以任选地用包衣和壳获得或制备，所述包衣和壳诸如肠溶包衣和药物配制技术中熟知的其他包衣。它们可以可选择地或另外地被配制，以便提供其中的活性成分的缓慢释放或控制释放，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供期望的释放概况、其他聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可以被配制用于快速释放，例如冷冻干燥。它们可以通过例如经过保留细菌的过滤器过滤或通过并入呈可以在即将使用之前被溶解在无菌水中或一些其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物的形式的灭菌剂来灭菌。这些组合物还可以任选地包含乳浊剂(opacifying agent)，并且可以是这样的组合物：该组合物仅仅或优先地在胃肠道的某一部分中释放活性成分，任选地以延迟方式释放。可以被使用的包埋组合物的实例包括聚合物物质和蜡。如果合适的话，活性成分还可以与上文描述的赋形剂中的一种或更多种一起呈微囊化形式。
[0234]
用于口服施用本公开内容的化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以包含本领域中常用的惰
性稀释剂，诸如，例如水或其他的溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、以及其混合物。
[0235]
除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含辅料，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、增香剂和防腐剂。
[0236]
除了活性化合物之外，悬浮液可以包含悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍胶、以及其混合物。
[0237]
本公开内容的药物组合物还可以以用于直肠施用的栓剂的形式施用。这些组合物可以通过将本公开内容的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温为固体，但在直肠温度为液体，并且因此将在直肠中融化以释放活性组分。这样的材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
[0238]
当期望的治疗涉及通过局部施加的容易接近的区域或器官时，本公开内容的药物组合物的局部施用是特别有用的。对于局部施加至皮肤，药物组合物应该用包含悬浮或溶解在载体中的活性组分的合适的软膏配制。用于局部施用本公开内容的化合物的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白色石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选择地，药物组合物可以用包含悬浮或溶解在载体中的活性化合物的合适的洗剂或乳膏配制。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。本公开内容的药物组合物还可以通过直肠栓剂制剂或以合适的灌肠制剂被局部施加至下部肠道。局部施用的经皮贴剂也被包括在本公开内容中。
[0239]
本公开内容的药物组合物可以通过鼻气雾剂或吸入来施用。这样的组合物根据药物制剂领域中熟知的技术来制备，并且可以采用苄醇或其他合适的防腐剂、用于增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂被制备为盐水中的溶液。
[0240]
对于眼科用途，药物组合物可以在具有或不具有防腐剂诸如苯扎氯铵的情况下被配制为在等渗的、ph调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选地被配制为在等渗的、ph调节的无菌盐水中的溶液。可选择地，对于眼科用途，药物组合物可以配制在软膏诸如凡士林中。
[0241]
经皮贴剂具有提供本公开内容的化合物向身体的控制递送的额外的优点。将化合物溶解或分散在适当的介质中可以制成这样的剂型。吸收增强剂也可以被用于增加化合物跨过皮肤的通量。提供速率控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中可以控制这样的通量的速率。
[0242]
可以用于本公开内容的药物组合物的合适的水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及类似物)及其合适的混合物、植物油诸如橄榄油以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料诸如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需要的粒度以及通过使用表面活性剂，可以维持合适的流动性。
[0243]
这样的组合物还可以包含辅料诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。在某些实施
方案中，包含一种或更多种抗细菌剂和/或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及类似物可以是合意的。可以可选择地或另外地合意的是，在组合物中包括等渗剂，诸如糖、氯化钠以及类似物。此外，可注射的药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来引起。
[0244]
在某些实施方案中，所描述的化合物或药物制品被口服地施用。在其他实施方案中，所描述的化合物或药物制品被静脉内地施用。可选择的施用途径包括舌下施用、肌内施用和经皮施用。
[0245]
当本文描述的化合物作为药物被施用至人类和动物时，它们可以本身被给予或作为药物组合物被给予，该药物组合物包含例如0.1％至99.5％(更优选地0.5％至90％)的与药学上可接受的载体组合的活性成分。
[0246]
本文描述的制品可以被口服地、肠胃外地、局部地或直肠地给予。它们当然以适合于相关施用途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊形式，通过注射、吸入、洗眼剂、软膏、栓剂等施用，通过注射、输注或吸入施用；通过洗剂或软膏局部施用；以及通过栓剂直肠施用。口服施用是优选的。
[0247]
这样的化合物可以通过任何合适的施用途径施用至人类和其他动物以用于治疗，所述施用途径包括口服地、经鼻地(如通过例如喷雾剂)、直肠地、阴道内地、肠胃外地、脑池内地和局部地(如通过粉末、软膏或滴剂，包括含服地和舌下地)。
[0248]
无论所选择的施用途径如何，可以以合适的水合形式使用的本文描述的化合物和/或本公开内容的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
[0249]
活性成分在本公开内容的药物组合物中的实际剂量水平可以改变，以便获得对于实现特定的患者、组合物和施用模式的期望的治疗应答有效而对于患者无毒的活性成分的量。
[0250]
术语“施用......(administration of)”和/或“施用(administering)”应被理解为意指向需要治疗的受试者提供以治疗有效量的药物组合物。施用途径可以是肠内、局部或肠胃外的。因此，施用途径包括但不限于皮内、皮下、静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、真皮内、经皮、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内、口服、舌下、含服、直肠、阴道、鼻眼施用，以及输注、吸入和雾化。
[0251]
术语“癌症”指的是一组疾病，其特征在于在一个部位(原发部位)开始的异常且不受控制的细胞增殖，具有侵入和扩散至其他部位(继发部位、转移灶)的可能性，这种可能性将癌症(恶性肿瘤)与良性肿瘤区分开来。几乎所有的器官可以被影响，导致可以影响人类的多于100种类型的癌症。癌症可以由许多原因引起，所述原因包括遗传倾向(genetic predisposition)、病毒感染、暴露于电离辐射、暴露于环境污染物、吸烟和/或饮酒、肥胖、差的饮食、缺乏身体活动或其任何组合。
[0252]
由国家癌症研究所描述的示例性癌症包括：成人急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；成人急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；aids相关的淋巴瘤；aids相关的恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童脑干胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑干胶质瘤脑肿瘤；儿童小脑星形细胞瘤脑肿瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性
胶质瘤脑肿瘤；儿童室管膜瘤脑肿瘤；儿童髓母细胞瘤脑肿瘤；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤脑肿瘤(brain tumor,supratentorial primitive neuroectodermal tumors,childhood)；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤脑肿瘤；儿童(其他)脑肿瘤；乳腺癌；乳腺癌合并妊娠(breast cancer and pregnancy)；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌：儿童类癌瘤；胃肠道类癌瘤；肾上腺皮质癌；胰岛细胞癌；不明原发灶癌；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；慢性骨髓增生性紊乱；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结肠直肠癌；皮肤t细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食道癌；儿童食道癌；尤文氏家族肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼内黑素瘤眼癌；成视网膜细胞瘤眼癌；胆囊癌；胃(胃部)癌；儿童胃(胃部)癌；胃肠道类癌瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童脑干胶质瘤；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤(glioma.childhood visual pathway and hypothalamic)；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金淋巴瘤(hodgkin's lymphoma,adult)；儿童霍奇金淋巴瘤(hodgkin's lymphoma,childhood)；妊娠期霍奇金淋巴瘤(hodgkin's lymphoma during pregnancy)；下咽癌；儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤(hypothalamic and visual pathway glioma,childhood)；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性成淋巴细胞白血病(leukemia,acute lymphoblastic,adult)；儿童急性成淋巴细胞白血病(leukemia,acute lymphoblastic,childhood)；成人急性骨髓性白血病；儿童急性骨髓性白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性成淋巴细胞白血病(lymphoblastic leukemia,adult acute)；儿童急性成淋巴细胞白血病(lymphoblastic leukemia,childhood acute)；慢性淋巴细胞白血病；aids相关的淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期霍奇金淋巴瘤(lymphoma,hodgkin's during pregnancy)；成人非霍奇金淋巴瘤(lymphoma,non-hodgkin's,adult)；儿童非霍奇金淋巴瘤(lymphoma,non-hodgkin's,childhood)；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia,waldenstrom's)；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童髓母细胞瘤；黑素瘤；眼内黑素瘤；梅克尔细胞癌；恶性间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌；儿童多发性内分泌瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿；骨髓发育不良综合征；慢性髓细胞性白血病；儿童急性骨髓性白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性紊乱；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；成神经细胞瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨骼的骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌；胰岛细胞胰腺癌；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体肿瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠合并乳腺癌；妊娠合并霍奇金淋巴瘤；妊娠合并非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；成视网膜细胞瘤；
儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；尤文氏家族肿瘤肉瘤；卡波西肉瘤；骨骼的骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤肉瘤；儿童横纹肌肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；塞扎里综合征；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；梅克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；隐匿性原发性转移性鳞状颈癌；胃部(胃)癌；儿童胃部(胃)癌；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童未知原发部位的癌症；儿童罕见癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；和威尔姆斯肿瘤。
[0253]
在某些方面中，癌症包括肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、食道癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌、头颈癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、卵巢癌、黑素瘤、胆囊癌、喉癌、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌和卡波西肉瘤。
[0254]
在某些方面中，方法还包括施用化学治疗剂。本公开内容的化合物可以与一种或更多种另外的治疗剂组合施用。措辞“组合疗法”、“与......组合”等指的是同时使用多于一种药物或治疗以增加响应。本公开内容的fgfr抑制剂可以例如与用于治疗癌症的其他药物或治疗组合使用。在多个方面中，化合物在施用化学治疗剂之前、同时或之后施用。
[0255]
术语“抗癌疗法”指的是可以用于治疗癌症的任何疗法或治疗。抗癌疗法包括但不限于外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法和靶向疗法。
[0256]
化学治疗剂或抗癌剂的实例包括但不限于放线菌素、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、帕尼单抗、爱必妥(西妥昔单抗)、马妥珠单抗、imc-iif 8、theracim hr3、地诺单抗、安维汀(贝伐单抗)、修美乐(阿达木单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、remicade(英夫利昔单抗)、利妥昔单抗、synagis(帕利珠单抗)、mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星)、raptiva(依法珠单抗)、tysabri(那他珠单抗)、zenapax(达昔单抗)、neutrospec(锝(99mtc)法索单抗(fanolesomab))、托珠单抗、prostascint(铟-ill标记的卡罗单抗喷地肽)、bexxar(托西莫单抗)、zevalin(缀合至钇90的替伊莫单抗(idec-y2b8))、xolair(奥马珠单抗)、mabthera(利妥昔单抗)、reopro(阿昔单抗)、mabcampath(阿仑单抗)、simulect(巴利昔单抗)、leukoscan(硫索单抗)、cea-scan(阿西莫单抗)、verluma(nofetumomab)、panorex(依决洛单抗)、阿仑单抗、cdp 870、那他珠单抗、gilotrif(阿法替尼)、lynparza(奥拉帕尼)、perjeta(帕妥珠单抗)、otdivo(纳武单抗)、bosulif(博舒替尼)、cabometyx(卡博替尼)、ogivri(曲妥珠单抗-dkst)、sutent(苹果酸舒尼替尼)、adcetris(本妥昔单抗)、alecensa(艾乐替尼)、calquence(阿卡替尼(acalabrutinib))、yescarta(ciloleucel)、verzenio(玻玛西林),keytruda(派姆单抗)、aliqopa(库潘尼西(copanlisib))、nerlynx(来那替尼)、imfinzi(德瓦鲁单抗(durvalumab))、darzalex(达雷木单抗)、tecentriq(阿特珠单抗)以及tarceva(埃罗替尼)。免疫治疗剂的实例包括但不限于白细胞介素(il-2、il-7、il-12)、细胞因子(干扰素、g-csf、咪喹莫特)、趋化因子(ccl3、ccl26、cxcl7)、免疫调节酰亚胺
药物(沙利度胺及其类似物)。
[0257]
术语“辅助疗法”指的是为防止疾病复发而添加到初级治疗的治疗，或者为增强或延长初级疗法的效果而给予的另外的疗法，如向手术方案的添加化学疗法。
[0258]
如本文使用的术语“激动剂”指的是能够活化受体以诱导完全或部分药理学响应的化学物质。受体可以被内源性激动剂和拮抗剂或外源性激动剂和拮抗剂活化或灭活，导致刺激或抑制生物响应。生理学激动剂是产生相同的身体响应但不与相同的受体结合的物质。特定受体的内源性激动剂是由身体自然产生的化合物，该化合物结合并活化该受体。超激动剂是能够比靶受体的内源性激动剂产生更大的最大响应，并且因此效率大于100％的化合物。这并不一定意味着它比内源性激动剂更有效，而是可以在受体结合后在细胞内部产生的最大可能响应的比较。完全激动剂(full agonist)结合并活化受体，在该受体处表现出完全效力。部分激动剂(partial agonist)也结合并活化给定的受体，但相对于完全激动剂在受体处仅具有部分效力。反向激动剂是结合与该受体的激动剂相同的受体结合位点并逆转受体的组成型活性的剂。反向激动剂发挥与受体激动剂相反的药理学作用。不可逆激动剂是以这样的方式与受体永久地结合的一种类型的激动剂，该方式使得受体被永久地活化。它与单纯的激动剂不同，因为激动剂与受体的结合是可逆的，而不可逆激动剂与受体的结合被认为是不可逆的。这引起化合物产生激动剂活性的短暂爆发，随后是受体的脱敏和内化，其中长期治疗产生更像拮抗剂的效果。选择性激动剂对某一种类型的受体是特异性的。
[0259]
如本文使用的术语“拮抗剂”指的是可以通过共价键、离子键、氢键、疏水性相互作用或其组合竞争性地或非竞争性地与酶、受体或辅助受体结合并且使相关的下游信号传导途径直接地或间接地失活的小分子、肽、蛋白质或抗体。
[0260]
如本文使用的术语“抗癌化合物”指的是选择性地靶向癌细胞并减少它们的生长、增殖或侵袭性或包含这样的癌细胞的肿瘤的肿瘤负担的小分子化合物。
[0261]
术语“类似物”和“衍生物”可互换地使用，以意指由类似结构的另一种化合物在一个或更多个步骤中产生的化合物。化合物的“衍生物”或“类似物”至少保留一定程度的参考化合物的期望功能。因此，“衍生物”的替代术语可以是“功能性衍生物”。衍生物可以包括化学修饰，诸如烷基化、酰化、氨基甲酰化、碘化或衍生化合物的任何修饰。这样的衍生化的分子包括，例如，其中游离氨基基团已经被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基基团、苄氧羰基基团、叔丁氧基羰基基团、氯乙酰基基团或缩甲醛基团的那些分子。游离羧基基团可以被衍生化以形成盐、酯、酰胺或酰肼。游离羟基基团可以被衍生化以形成o-酰基衍生物或o-烷基衍生物。
[0262]
如本文使用的术语“变构调节(allosteric modulation)”指的是通过在受体的除了内源性配体(正构配体)以外的不同位点(即调控位点)处结合变构调节剂并且增强或抑制内源性配体的作用来调节受体的过程。它通常通过引起受体分子的构象变化而起作用，这导致配体的结合亲和力的变化。因此，变构配体通过初级“配体”来“调节”其活化，并且可以调节受体的活化的强度。许多变构酶由其底物调控，这样的底物被认为是“同向变构调节剂(homotropic allosteric modulator)”。非底物调控分子被称为“异向变构调节剂(heterotropic allosteric modulator)”。
[0263]
术语“变构调控(allosteric regulation)”是通过在蛋白质变构位点(意指除了
蛋白质的活性位点以外的位点)处结合效应物分子来调控酶或其他蛋白质。增强蛋白质的活性的效应物被称为“变构活化剂”，而降低蛋白质的活性的那些效应物被称为“变构抑制剂”。因此，当一个配体的结合增强了底物分子和其他结合位点之间的吸引力时，发生“变构活化”；当一个配体的结合降低了在其他活性位点处底物的亲和力时，发生“变构抑制”。如本文使用的术语“拮抗剂”指的是抵消另一种物质的作用的物质。
[0264]
术语“测定标志物”或“报告基因”(或“报告物”)指的是可以被检测或者容易地鉴定和测量的基因。报告基因的表达可以在rna水平或在蛋白质水平测量。可以在实验测定方案中检测的基因产物包括但不限于标志物酶、抗原、氨基酸序列标志物、细胞表型标志物、核酸序列标志物及类似基因产物。研究人员可以将报告基因附接到细胞培养物、细菌、动物或植物中的另一种感兴趣的基因。例如，一些报告物是可选择的标志物，或者赋予表达它们的生物体特性，允许生物体容易地鉴定和测定。为了将报告基因引入到生物体中，研究人员可以将报告基因和感兴趣的基因放置在相同的dna构建体中，该dna构建体待被插入到细胞或生物体中。对于培养物中的细菌或真核细胞，这可以呈质粒的形式。常用的报告基因可以包括但不限于荧光蛋白、萤光素酶、β-半乳糖苷酶和可选择的标志物，诸如氯霉素和卡那霉素。
[0265]
如本文所使用的，术语“生物利用度”指的是与标准或对照相比，活性药物成分或治疗部分从施用的剂型吸收到体循环中的速率和程度。
[0266]
如本文使用的术语“生物标志物”(或“生物签名(biosignature)”)指的是肽、蛋白质、核酸、抗体、基因、代谢物或用作生物状态的指标的任何其他物质。它是一种被客观地测量并评价为正常生物学过程、致病过程或对治疗干预的药理学响应的细胞或分子指标的特性。如本文使用的术语“指标”指的是衍生自一系列观察到的事实的任何物质、数目或比率，所述事实可以揭示随时间变化的相对变化；或可见的信号、体征、标志、注释(note)或症状或其实有(existence)或存在的证据。一旦提出的生物标志物已经被验证，它就可以用于诊断疾病风险、个体的疾病的存在，或者用于对个体的疾病进行定制治疗(药物治疗或施用方案的选择)。在评价潜在的药物疗法中，生物标志物可以被用作自然终点的替代物，自然终点诸如存活或不可逆发病率。如果治疗改变了生物标志物，并且该改变与改善的健康具有直接联系，则生物标志物可以用作用于评价临床益处的替代终点。临床终点是可以用于度量患者的感觉、功能或生存如何的变量。替代终点是意图替代临床终点的生物标志物；这些生物标志物被证明以被监管机构和临床社区所接受的置信水平预测临床终点。
[0267]
如本文使用的术语“结合”或其语法形式中的任一种指的是保持住、吸引、与之相互作用或与之组合的能力。
[0268]
术语“细胞”在本文中用于指活的生物体的结构和功能单元，并且是被归类为活的生物体的最小单元。
[0269]
如本文使用的术语“细胞系”指的是已经经历转化并且可以在培养中无限地传代的永生化细胞群体。
[0270]
如本文使用的术语“化学抗性”指的是对多种结构上和功能上不同的剂具有抗性的细胞表型的发展。肿瘤可以在化学疗法之前具有内在的抗性，或者可以由最初对化学疗法敏感的肿瘤在治疗期间获得抗性。抗药性是涉及多种相互关联或独立的机制的多因素现象。涉及的机制的异质表达可以表征相同类型的肿瘤或相同肿瘤的细胞，并且可以至少部
分地反映肿瘤进展。可以导致细胞抗性的示例性机制包括：涉及降低细胞内药物浓度的防御因子的增加的表达；药物-靶相互作用的改变；细胞响应的变化，特别是增加了细胞修复dna损伤或耐受应激条件的能力，以及凋亡途径中的缺陷。
[0271]
如本文使用的术语“化学敏感的”、“化学敏感性”或“化学敏感性肿瘤”指的是对化学疗法或化学治疗剂有响应的肿瘤。化学敏感性肿瘤的特性包括但不限于肿瘤细胞群体的减少的增殖、减小的肿瘤大小、减少的肿瘤负担、肿瘤细胞死亡以及肿瘤细胞群体的减缓的/抑制的进展。
[0272]
如本文使用的术语“化学治疗剂”指的是可用于治疗或控制疾病例如癌症的化学物质。
[0273]
如本文使用的术语“化学疗法”指的是采用一种或更多种化学治疗剂的治疗进程。在癌症的上下文中，化学疗法的目标是例如杀死癌细胞，减少癌细胞的增殖，减少包含癌细胞的肿瘤的生长，减少癌细胞的侵袭性，增加癌细胞的凋亡。
[0274]
术语“化学疗法方案”(“联合化学疗法”)意指采用多于一种药物的化学疗法，以便受益于多于一种药物的不同毒性。联合癌症疗法的原理是不同的药物通过不同的细胞毒性机制起作用；由于它们具有不同的剂量限制性不良作用，因此它们可以以全剂量一起给予。
[0275]
如本文使用的术语“相容”意指组合物的组分能够以这样的方式彼此组合：使得不存在在普通使用条件下将显著降低组合物的效力的相互作用。
[0276]
如本文使用的术语“状况”指的是多种健康状态，并且意图包括由任何潜在机制或损伤引起的紊乱或疾病。
[0277]
如本文使用的术语“接触”及其多种语法形式指的是接触或者直接或局部接近的状态或状况。将组合物接触到靶目的地，诸如但不限于器官、组织、细胞或肿瘤，可以通过技术人员已知的任何施用方式发生。
[0278]
如本文使用的术语“衍生物”意指可以在一个或更多个步骤中由类似结构的另一种化合物产生的化合物。肽或化合物的“衍生物(derivative)”或“衍生物(derivatives)”至少保留一定程度的肽或化合物的期望功能。因此，“衍生物”的替代术语可以是“功能性衍生物”。衍生物可以包括对肽的化学修饰，诸如烷基化、酰化、氨基甲酰化、碘化或衍生肽的任何修饰。这样的衍生化的分子包括，例如，其中游离氨基基团已经被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基基团、苄氧羰基基团、叔丁氧基羰基基团、氯乙酰基基团或缩甲醛基团的那些分子。游离羧基基团可以被衍生化以形成盐、酯、酰胺或酰肼。游离羟基基团可以被衍生化以形成o-酰基衍生物或o-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以被衍生化以形成n-im-苄基组氨酸。作为衍生物或类似物还包括这样的肽：包含二十种标准氨基酸的一种或更多种天然存在的氨基酸衍生物，例如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸或羧基谷氨酸，并且可以包括不通过肽键连接的氨基酸。这样的肽衍生物可以在肽的合成期间并入，或者肽可以通过熟知的化学修饰方法来修饰(参见，例如，glazer等人,chemical modification of proteins,selected methods and analytical procedures,elsevier biomedical press,new york(1975))。
[0279]
术语“可检测的标志物”涵盖可选择的标志物和测定标志物两者。术语“可选择的标志物”指的是用表达构建体转化的细胞可以被选择或筛选到的多种基因产物，包括抗药性标志物、可用于荧光活化的细胞分选的抗原标志物、粘附标志物诸如允许选择性粘附的
粘附配体的受体及类似物。当核酸被合成性地制备或改变时，可以利用核酸要在其中表达的预期的宿主的已知密码子偏好性。
[0280]
术语“可检测的响应”指的是可以在测定中检测到的任何信号或响应，所述测定可以在具有或不具有检测试剂的情况下进行。可检测的响应包括但不限于放射性衰变和能量(例如，荧光、紫外光、红外光、可见光)发射、吸收、偏振、荧光、磷光、透射、反射或共振转移。可检测的响应还包括色谱迁移率、浊度、电泳迁移率、质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振光谱和x射线衍射。可选择地，可检测的响应可以是测量生物学材料的一种或更多种性质诸如熔点、密度、电导率、表面声波、催化活性或元素组成的测定的结果。如本文所使用的，术语“疾病”或“紊乱”指的是健康受损或异常功能的状况。
[0281]
如本文所使用的，术语“酶促活性”指的是在给定条件下在给定时间内消耗的底物(或形成的产物)的量。酶促活性也可以被称为“转换数”。
[0282]
术语“功能等同物”或“功能上等同”在本文中可互换地使用，以指具有与参考物质、分子、多核苷酸、蛋白质、肽或多肽相似或相同的生物学活性的物质、分子、多核苷酸、蛋白质、肽或多肽。术语“半最大抑制浓度”(“ic
50”)是化合物在抑制生物学或生物化学功能中的有效性的度量。
[0283]
术语“抑制(inhibiting)”、“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition)”在本文中用于指减少过程的量或速率，以完全地停止过程，或者减少、限制或阻断其作用或功能。抑制可以包括将物质的量、速率、作用功能或过程减少或降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
[0284]
如本文使用的术语“抑制剂”指的是与酶结合从而降低酶活性的分子。酶抑制剂是与酶结合从而降低酶活性的分子。抑制剂的结合可以阻止底物进入酶的活性位点和/或阻碍酶催化其反应。抑制剂结合是可逆的或不可逆的。不可逆的抑制剂通常与酶反应并且以化学方式改变它，例如，通过修饰酶促活性所需的关键氨基酸残基。相比之下，可逆的抑制剂非共价地结合，并且取决于这些抑制剂结合酶、酶-底物复合物还是两者而产生不同类型的抑制。酶抑制剂通常通过其特异性和效能来评价。
[0285]
如本文使用的术语“损伤”指的是由外部剂或外部力引起的身体的结构或功能的损害或伤害，所述外部剂或外部力可以是物理的或化学的。
[0286]
如本文使用的术语“干扰(interfere)”或“以干扰(to interfere with)”指的是妨碍、阻止、抑制、阻碍、阻挡、阻断、减少或防止作用或发生。通过实例的方式，受体拮抗剂干扰(例如，阻断或抑制)激动剂介导的响应，而不是引起生物学响应本身。
[0287]
如本文使用的术语“侵袭”或“侵袭性”指的是恶性细胞中的过程，所述过程包括穿透周围组织和通过周围组织的移动。
[0288]
如本文使用的术语“kaplan meier图”或“kaplan meier存活曲线”指的是临床研究受试者在给定的时间长度内存活(同时考虑在许多小间隔内的时间)的概率的图。kaplan meier图假定：(i)在任何时候，被删掉(censor)(即，丢失)的受试者与继续被跟踪的受试者具有相同的存活前景；(ii)存活概率对于在研究的早期和晚期招募的受试者是相同的；以及(iii)事件(例如，死亡)在指定的时间发生。在某个时间点计算事件发生的概率，其中连
续的概率乘以任何早前计算的概率以得到最终估计值。在任何特定时间的存活概率被计算为存活的受试者的数目除以处于风险的受试者的数目。已经死亡、退出或者已经从研究中删掉的受试者不被视为处于风险。
[0289]
如本文使用的术语“配体”指的是这样的分子，所述分子可以选择性地结合到分子，使得配体及其结合配偶体之间的结合相互作用通过可定量的测定相比于非特异性相互作用是可检测到的。衍生物、类似物和模拟化合物意图被包括在该术语的定义内。
[0290]
术语“标志物”和“细胞表面标志物”在本文中可互换地使用，以指在细胞的表面上发现的受体、受体的组合或抗原决定簇或表位，这些受体、受体的组合或抗原决定簇或表位允许细胞类型与其他类型的细胞是可区分的。具有选择性地结合或粘附到其他信号传导分子的能力的专门的蛋白质受体(标志物)覆盖在身体内每个细胞的表面。细胞使用这些受体和与它们结合的分子作为与其他细胞沟通的方式并且在身体内实施其适当功能。细胞分选技术是基于细胞生物标志物，其中细胞表面标志物可以用于阳性选择或阴性选择，即，用于从细胞群体中纳入或排除。
[0291]
如本文使用的术语“最大耐受剂量(mtd)”指的是不产生不可接受的毒性的药物的最高剂量。如本文使用的术语“中位存活期(median survival)”指的是在此之后50％患有特定状况的个体仍然活着而50％已经死亡的时间。例如，6个月的中位存活期指示，在6个月之后，50％的患有例如结肠癌的个体将是活的，而50％已经去世。中位存活期通常用于描述当平均存活率是相对短的时候的状况诸如结肠癌的预后(即，存活的机会)。当对药物或治疗进行评价以确定该药物或治疗是否将延长寿命时，中位存活期还用于临床研究。
[0292]
如本文使用的术语“转移”指的是生物体或者恶性细胞或癌细胞从身体的一个部分转移到其他部分，产生疾病表现。如本文使用的术语“迁移”指的是细胞群体从一个地方到另一个地方的移动。
[0293]
如本文使用的术语“修饰(modify)”意指在一个或更多个详情中更改、变化、调节、缓和、改变、影响或调控到某个度量或比例。如本文使用的术语“修饰剂”指的是在度或程度上减少、减轻状况、状态、紊乱、疾病、症状或综合征的形式、症状、体征、质量、特征或性质，或者调节状况、状态、紊乱、疾病、症状或综合征的形式、症状、体征、质量、特征或性质的物质、组合物、治疗组分、活性成分、治疗剂、药物、代谢物、活性剂、蛋白质、非治疗组分、非活性成分、非治疗剂或非活性剂。如本文使用的术语“调节”意指调控、改变、适应或调节到某个度量或比例。
[0294]
如本文使用的术语“赘生物”指的是基因改变的细胞的异常增殖。恶性赘生物(或恶性肿瘤)与癌症同义。良性赘生物(或良性肿瘤)是自身停止生长、不侵入其他组织并且不形成转移的肿瘤(实体赘生物)。如本文使用的术语“正常健康对照受试者”指的是没有疾病的症状或其他临床证据的受试者。如本文使用的术语“正常人类结肠上皮细胞(hcec)”指的是使用外源引入的端粒酶和cdk4产生的永生化的人类结肠上皮细胞(hcec)系(fearon,e.r.&vogelstein,b.a genetic model for colorectal tumorigenesis.cell 61,759-767(1990))。这些细胞是非转化的核型二倍体，并且具有多能特性。当在不存在间充质饲养层的情况下放置在matrigel.rtm.中时，单独的细胞分裂并形成自组织的、隐窝样结构，其中细胞的子集呈现出与成熟肠上皮相关的标志物。
[0295]
如本文使用的术语“结果(outcome)”指的是可以被测量的特定结果或效果。结果
的非限制性实例包括降低的疼痛、减小的肿瘤大小和存活期(例如，无进展存活期(progression-free survival)或总存活期(overall survival))。
[0296]
如本文使用的术语“总存活期(os)”指的是从诊断日期或疾病诸如癌症的治疗开始起的时间长度，其中被诊断为患有该疾病的患者仍然活着。
[0297]
如本文使用的术语“肠胃外”指的是通过注射的方式引入到身体内(即，通过注射施用)，包括例如皮下地(即，在皮肤下方注射)、肌内地(即，注射到肌肉中)；静脉内地(即，注射到静脉中)、鞘内地(即，注射到脊髓周围的空间中或在脑的蛛网膜下注射)或输注技术。肠胃外地施用的组合物使用针，例如手术针递送。如本文使用的术语“手术针”指的是适于将流体(即，能够流动)组合物递送到选定的解剖结构中的任何针。可注射的制品诸如无菌的可注射的水性悬浮液或油质悬浮液可以根据已知技术使用示例性的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。
[0298]
术语“原发性肿瘤”或“原发性癌症”可互换地使用，以指身体内的原始肿瘤或最初的肿瘤。来自原发性癌症的癌细胞可以扩散到身体的其他部位并且形成新的肿瘤或继发性肿瘤。这被称为转移。继发性肿瘤与原发性肿瘤是相同类型的癌症。
[0299]
如本文使用的术语“进展”指的是疾病因其变得恶化或在身体内扩散的进程。如本文使用的术语“无进展存活期(pfs)”指的是在疾病的治疗期间和之后的时间长度，其中患者在患有该疾病的情况下生活，但该疾病没有恶化。如本文使用的术语“增殖”指的是通过将单个细胞连续分裂成相同的子细胞，导致细胞的数目的倍增或增加而使细胞群体扩展。如本文使用的术语“复发”指的是疾病(例如，癌症)通常一段时间之后再次出现，在该时间段期间，疾病不能被检测到。
[0300]
如本文使用的术语“减少(reduce)”或“减少(reducing)”指的是限制处于发展紊乱风险的个体的紊乱的发生。术语“难治性”或“抗性”在本文中可互换地使用，指对治疗没有响应的疾病或状况。该疾病在治疗开始时可以具有抗性，或者该疾病在治疗期间可以变得具有抗性。如本文使用的术语“缓解”指的是疾病的体征和症状的减少或消失。在部分缓解中，一些但不是全部的体征和症状消失。在完全缓解中，尽管疾病可能仍然在身体内，但全部的体征和症状消失。
[0301]
如本文使用的术语实体瘤响应评价标准(或“recist”)指的是度量癌症患者对治疗的响应如何的标准方式。它是基于肿瘤缩小、保持不变还是变得更大。为了使用recist，必须存在可以在x射线、ct扫描或mri扫描上测量的至少一种肿瘤。患者可以具有的响应类型可以是完全响应(cr)、部分响应(pr)、进行性疾病(pd)和稳定性疾病(sd)。
[0302]
如本文使用的术语“体征”指的是在身体检查期间发现的或从实验室测试发现的示出一个人可能患有状况或疾病的东西。术语“受试者”或“个体”或“患者”可互换地使用，以指哺乳动物起源的动物物种的成员，包括但不限于小鼠、大鼠、猫、山羊、绵羊、马、仓鼠、雪貂、鸭嘴兽、猪、犬、豚鼠、兔和灵长类动物，诸如例如猴、猿或人类。如本文使用的术语“需要这样的治疗的受试者”指的是患有疾病、紊乱、状况或病理学过程例如癌症的患者。
[0303]
如本文使用的术语“实质抑制”、“实质上抑制”及类似术语指的是至少50％的抑制、至少55％的抑制、至少60％的抑制、至少65％的抑制、至少70％的抑制、至少75％的抑制、至少80％的抑制、至少85％的抑制、至少90％的抑制、至少95％的抑制或至少99％的抑制。
[0304]
如本文使用的术语“存活率”指的是在疾病(例如，癌症)中存活持续指定的时间量的个体的百分比。例如，如果特定癌症的5年存活率为34％，这意味着最初被诊断为患有该癌症的100个个体中有34个个体在5年之后将是活着的。
[0305]
如本文使用的术语“肿瘤”指的是涉及在数目(增殖)上或在大小上异常的细胞生长、具有侵入或扩散到身体的其他部位(转移)的潜力的疾病。术语“肿瘤负担”或“肿瘤负荷”在本文中可互换地使用，指癌细胞的数目、肿瘤的大小或身体内的癌症的量。
[0306]
在治疗中，剂的剂量任选地在从约0.0001mg/kg受试者体重至约100mg/kg受试者体重、约0.01mg/kg受试者体重至约5mg/kg受试者体重、约0.15mg/kg受试者体重至约3mg/kg受试者体重、0.5mg/kg受试者体重至约2mg/kg受试者体重和约1mg/kg受试者体重至约2mg/kg受试者体重的范围内。在其他实施方案中，剂量在从约100mg/kg受试者体重至约5g/kg受试者体重、约500mg/kg受试者体重至约2mg/kg受试者体重和约750mg/kg受试者体重至约1.5g/kg受试者体重的范围内。例如，取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-20mg/kg)的剂是用于施用至患者的候选剂量，例如不管是通过一次或更多次单独的施用还是通过连续输注。典型的日剂量在从约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，这取决于上文提及的因素。对于经过若干天或更长时间的重复施用，取决于状况，治疗持续直到出现疾病症状的期望的抑制。然而，其他剂量方案也可以是有用的。单位剂量可以在例如约5mg至500mg的范围内，诸如50mg、100mg、150mg、200mg、250mg和300mg。治疗的进展通过常规技术和测定来监测。
[0307]
在一些实施方案中，剂以小于约1μg/kg，例如约0.35μg/kg至约0.75μg/kg或约0.40μg/kg至约0.60μg/kg的有效量(或剂量)施用至人类患者。在一些实施方案中，剂的剂量为约0.35μg/kg、或约0.40μg/kg、或约0.45μg/kg、或约0.50μg/kg、或约0.55μg/kg、或约0.60μg/kg、或约0.65μg/kg、或约0.70μg/kg、或约0.75μg/kg、或约0.80μg/kg、或约0.85μg/kg、或约0.90μg/kg、或约0.95μg/kg或约1μg/kg。在多种实施方案中，剂的绝对剂量为约2μg/受试者至约45μg/受试者、或约5μg/受试者至约40μg/受试者、或约10μg/受试者至约30μg/受试者、或约15μg/受试者至约25μg/受试者。在一些实施方案中，剂的绝对剂量为约20μg、或约30μg、或约40μg。
[0308]
在多种实施方案中，剂的剂量可以由人类患者的体重决定。例如，对于约0kg至约5kg(例如约0kg、或约1kg、或约2kg、或约3kg、或约4kg、或约5kg)的小儿人类患者，剂的绝对剂量为约2μg；或对于约6kg至约8kg(例如约6kg、或约7kg、或约8kg)的小儿人类患者为约3μg；或对于约9kg至约13kg(例如9kg、或约10kg、或约11kg、或约12kg、或约13kg)的小儿人类患者为约5μg；或对于约14kg至约20kg(例如约14kg、或约16kg、或约18kg、或约20kg)的小儿人类患者为约8μg；或对于约21kg至约30kg(例如约21kg、或约23kg、或约25kg、或约27kg、或约30kg)的小儿人类患者为约12μg；或对于约31kg至约33kg(例如约31kg、或约32kg、或约33kg)的小儿人类患者为约13μg；或对于约34kg至约50kg(例如约34kg、或约36kg、或约38kg、或约40kg、或约42kg、或约44kg、或约46kg、或约48kg、或约50kg)的成人人类患者为约20μg；或对于约51kg至约75kg(例如约51kg、或约55kg、或约60kg、或约65kg、或约70kg、或约75kg)的成人人类患者为约30μg；或对于大于约114kg(例如约114kg、或约120kg、或约130kg、或约140kg、或约150kg)的成人人类患者为约45μg。
[0309]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法的剂被皮下地(s.c.)、静脉内地(i.v.)、
肌内地(i.m.)、鼻内地或局部地施用。本文描述的剂的施用可以独立地是每天一次至四次或每月一次至四次或每年一次至六次或者每两年、三年、四年或五年一次。施用可以持续一天或一个月、两个月、三个月、六个月、一年、两年、三年的持续时间，并且甚至可以持续人类患者的一生。剂量可以作为单剂施用或分成多剂。在一些实施方案中，剂被施用约1次至约3次(例如1次或2次或3次)。
[0310]
提供以下实施例以进一步说明本公开内容的优点和特征，但其不意图限制本公开内容的范围。虽然该实施例是可以使用的那些实施例中的典型实施例，但是可以可选择地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实施例
[0311]
实施例1
[0312]
化合物1的合成(合成路线1和合成路线2)
[0313]
[0314][0315]
方案1.化合物1的合成路线1。
[0316][0317]
中间体1-1：在0℃，向γ-丁内酯(4.3ml,56.5mmol)在甲醇(150ml)中的溶液中添加na(1.3g,56.5mmol)。继续搅拌，直到起始材料完全转化(通过tlc监测，约24小时)。将反应用饱和的氯化铵(300ml)猝灭，用乙酸乙酯(150ml
×
4)萃取，将有机层合并，用盐水(100ml
×
4)洗涤，经na2so4干燥。将混合物过滤并且浓缩。柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)提供了作为无色液体的中间体产物1-1(4.5g,38.1mmol,67％)。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ3.68
–
3.59(m,5h),2.41(t,j＝7.2hz,2h),1.85(ddd,j＝7.2,6.1,1.0hz,2h)。
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ174.54,61.94,51.76,30.82,27.75。
[0318][0319]
中间体1-2：将内半缩醛(4.4g,7.4mmol)溶解在ch2cl2(50ml)中并且冷却至0℃。依次添加三氯乙腈(3.7ml,36.9mmol)和dbu(52μl,0.4mmol)。在室温搅拌持续约2h之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(石油醚/etoac＝4:1，包含1％ et3n)色谱分离，以产生作为无色油的亚氨酸酯中间体产物1-2(4.9g,6.6mmol,90％)。
[0320][0321]
中间体1-3：在氮气下在0℃，将三氯乙酰亚胺酯供体1-2(1.8g,2.4mmol)和中间体1-1(260mg,2.2mmol)溶解在ch2cl2(25ml)中。添加粉末状新鲜活化的分子筛(2g)。在15min之后，添加tmsotf(40μl,0.22mmol)，并且在0℃继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约8h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,2:1)纯化，以给出作为白色泡沫的中间体1-3(1.23g,1.77mmol,80％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.06
–
8.00(m,2h),8.00
–
7.93(m,2h),7.93
–
7.87(m,2h),7.88
–
7.81(m,2h),7.61
–
7.28(m,13h),5.90(t,j＝9.6hz,1h),5.67(t,j＝9.7hz,1h),5.51(dd,j＝9.8,7.8hz,1h),4.84(d,j＝7.9hz,1h),4.64(dd,j＝12.1,3.3hz,1h),4.50(dd,j＝12.1,5.2hz,1h),4.20
–
4.14(m,1h),3.95(dt,j＝9.8,5.9hz,1h),3.62(ddd,j＝9.8,7.0,5.6hz,1h),3.52(s,3h),2.29(t,j＝7.3hz,2h),1.95
–
1.76(m,2h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.72,166.25,165.92,165.28,165.20,133.54,133.35,133.32,133.25,130.00,129.91,129.87,129.86,129.84,129.82,129.63,129.31,128.84,128.82,128.50,128.47,128.46,128.39,101.30,72.97,72.27,71.94,69.80,68.94,63.21,51.51,30.04,24.79。esi-ms m/z：对于c
39h36o12
na[m na]
计算值719.2099，实测值719.2102。
[0322][0323]
中间体1-4：向中间体1-3(2.9g,4.4mmol)在甲醇(20ml)中的溶液中添加naome(120mg,2.2mmol)。继续搅拌，直到起始材料完全转化(通过tlc监测，约8小时)。将混合物用酸性树脂中和，过滤并且浓缩。然后将混合物与甲苯共蒸发三次并且在真空中干燥。
[0324]
将混合物溶解在干燥的吡啶(20ml)中并且冷却至0℃。经5min缓慢添加dmap(108mg,0.9mmol)和tesotf(6.0ml,26.4mmol)。在0℃继续搅拌，直到起始材料完全转化(通过tlc监测，约8小时)。将反应浓缩，然后用乙酸乙酯稀释，并且用2％ hcl洗涤两次，用饱和的和盐水洗涤一次，经na2so4干燥。然后，将混合物过滤并且浓缩。柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝30/1)提供了作为无色液体的中间体产物1-4(2.4g,3.3mmol,对于两个步骤为75％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.38(d,j＝6.9hz,1h),3.92
–
3.81(m,1h),3.77(dd,j＝10.4,5.4hz,1h),3.72
–
3.63(m,5h),3.60(dd,j＝5.9,4.6hz,1h),3.53
–
3.37(m,3h),2.41(d,j＝19.8hz,2h),1.94(t,j＝7.0hz,2h),0.98
–
0.92(m,36h),0.62(dd,j＝15.4,7.6hz,24h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ174.01,102.48,79.79,79.27,77.23,71.27,67.95,63.28,51.66,30.98,25.25,7.17,7.10,6.89,5.28,5.20,5.13,4.56；esi-ms m/z：对于c
35h76
o8si4na[m na]
计算值759.4509，实测值759.4515。
[0325][0326]
中间体1-5：向中间体1-4(850mg,1.2mmol)在甲苯(12ml)中的溶液中添加双(三丁基锡)氧化物(4.7ml,9.2mmol)。将反应加热至80℃过夜。将混合物浓缩。然后将混合物与甲苯共蒸发三次。柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝20/1至10/1)提供了作为无色液体的产物作为中间体1-5(450mg,0.62mmol,54％)，回收起始材料(250mg,0.34mmol,29％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.40(d,j＝6.9hz,1h),3.86(d,j＝9.5hz,1h),3.76(d,j＝5.2hz,1h),3.75
–
3.64(m,2h),3.60(t,j＝5.2hz,1h),3.55
–
3.40(m,3h),2.52-2.45(m,2h),1.96(q,j＝7.0hz,2h),0.98-0.92(m,36h),0.74
–
0.48(m,24h)；esi-ms m/z：对于c
34h74
o8si4na[m na]
计算值745.4353，实测值745.4358。
[0327][0328]
中间体1-6：在0℃，向中间体1-5(475mg,0.53mmol)在甲苯(9ml)中的溶液中添加net3(0.29ml,2.1mmol)和2,4,6-三氯苯甲酰氯(0.25ml,1.6mmol)，并且在室温搅拌持续0.5h。在形成混合酸酐(tlc)之后，将溶液冷却至0℃，并且将4-(二甲基氨基)吡啶(428mg,3.5mmol)和雷公藤甲素(126mg,0.35mmol)逐滴引入到反应混合物中。将反应混合物加温至室温并且搅拌持续另外的5h。在反应完成(tlc)之后，其通过添加饱和的nahco3溶液(10ml)来猝灭，并且将含水层用dcm(3
×
10ml)洗涤。将合并的有机层用盐水(5ml)洗涤，经na2so4干燥。将混合物过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法(pe/etoac,2:1)纯化提供了酯中间体产物1-6(339mg,0.32mmol,91％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.02(d,j＝1.0hz,1h),4.60(s,2h),4.34(d,j＝6.9hz,1h),3.88
–
3.77(m,1h),3.76
–
3.67(m,2h),3.68
–
3.58(m,2h),3.54(dd,j＝5.8,4.5hz,1h),3.50
–
3.32(m,6h),2.60(s,1h),2.55
–
2.35(m,2h),2.31
–
2.19(m,1h),2.14
–
2.01(m,2h),1.98
–
1.89(m,3h),1.84
–
1.77(m,2h),0.93
–
0.86(m,36h),0.64
–
0.47(m,24h)；esi-ms m/z：对于c
54h96o13
si4na[m na]
计算值1087.5820，实测值1087.5801。
[0329][0330]
化合物1：将中间体1-6(570mg,0.54mmol)溶解在dcm(10ml)中，并且冷却至0℃。然后添加tfa(1.0ml)。在此温度搅拌持续约15min之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(dcm/甲醇＝15:1)色谱分离，以产生作为白色固体的化合物1(300mg,0.49mml,91％)。1h nmr(500mhz,cd3od)δ5.09(d,j＝1.0hz,1h),4.83
–
4.72(m,2h),4.26(d,j＝7.8hz,1h),4.03
–
3.92(m,2h),3.86(dd,j＝11.9,2.1hz,1h),3.72
–
3.59(m,3h),3.47(d,j＝5.7hz,1h),3.18(dd,j＝9.1,7.8hz,1h),2.78(d,j＝13.1hz,1h),2.69
–
2.46(m,2h),2.32
–
2.19(m,2h),2.08(t,j＝13.8hz,1h),2.03
–
1.77(m,4h),1.51(dd,j＝12.4,5.0hz,1h),1.37-1.27(m,1h),1.04(s,3h),0.95(d,j＝7.0hz,3h),0.84(d,j＝6.9hz,3h)。
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ176.07,174.57,163.87,125.51,104.49,78.00,77.90,75.08,72.66,71.98,71.61,69.68,64.88,64.21,62.76,61.10,56.74,56.21,41.44,36.81,31.85,30.82,29.48,26.35,24.17,17.94,17.91,17.13,14.23；esi-ms m/z：对于c
30h40o13
na[m na]
计算值631.2361，实测值631.2368。
[0331][0332]
方案2.化合物1的合成路线2。
[0333][0334]
中间体1-7：在0℃，向β-d-葡萄糖五乙酸酯(5.0g,12.8mmol)在dcm(30ml)中的溶液中添加在乙酸中的氢溴酸溶液(8ml)。在0℃继续搅拌，直到起始材料完全转化(约3h)。将反应混合物用冷水(200ml)猝灭，并且用dcm(3
×
80ml)萃取。将有机层合并，并且用冰水(3
×
80ml)、饱和的nahco3和盐水洗涤，经na2so4干燥。将混合物过滤并且浓缩，以提供作为白色固体的2,3,4,6-四-o-乙酰基-α-d-吡喃葡萄糖基溴作为中间体1-7(4.85g,11.8mmol,92％)。
[0335][0336]
中间体1-8：在氮气下，将2,3,4,6-四-o-乙酰基-α-d-吡喃葡萄糖基溴中间体1-7(8.0g,2.4mmol)和1,4-丁二醇(260mg,2.2mmol)溶解在ch2cl2(25ml)中。添加agotf(5.5g,21.5mmol)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约2h)。将混合物用饱和的nahco3猝灭并且通过硅藻土过滤。将滤液用dcm稀释，并且用饱和的nahco3和盐水洗涤，经na2so4干燥。将混合物过滤并且在真空中浓缩。将残余物与甲苯共蒸发两次。
[0337][0338]
中间体1-9：在0℃，向中间体1-8在吡啶(40ml)中的溶液中添加dmap(500mg,3.9mmol)和mmtrcl(12.0g,39.0mmol)。在室温继续搅拌，直到起始材料完全消耗。将混合物浓缩，然后用乙酸乙酯稀释。将有机层用饱和的cuso4(2
×
100ml)和盐水洗涤，经na2so4干燥。将混合物过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法(pe/etoac,3:1)纯化提供了酯中间体1-9(6.8g,9.5mmol,对于两个步骤为50％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.42
–
7.31(m,4h),7.29
–
7.11(m,8h),6.76(d,j＝8.9hz,2h),5.12(t,j＝9.5hz,1h),5.01(t,j＝9.7hz,1h),4.90(dd,j＝9.6,8.0hz,1h),4.36(d,j＝7.9hz,1h),4.19(dd,j＝12.3,4.6hz,1h),4.10
–
3.98(m,1h),3.80(dt,j＝10.7,5.6hz,1h),3.73(s,3h),3.59(ddd,j＝9.8,4.6,2.4hz,1h),3.45
–
3.32(m,1h),3.03
–
2.93(m,2h),2.00(s,3h),1.96(s,3h),1.94(s,6h),1.61
–
1.56(m,4h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ170.89,170.49,169.56,158.80,147.19,144.93,139.32,130.41,129.35,128.51,128.03,127.96,127.86,127.32,126.89,113.33,113.11,100.95,100.91,81.86,77.36,72.92,71.92,71.42,70.15,68.51,62.52,62.02,55.40,29.48,25.99,20.93,20.85,20.80,20.78；esi-ms m/z：对于c
38h44o12
na[m na]
计算值715.2725，实测值715.2722。
[0339][0340]
中间体1-10：向中间体1-9(8.0g,11.6mmol)在甲醇(60ml)和dcm(15ml)中的溶液中添加naome(312mg,5.8mmol)。继续搅拌，直到起始材料完全转化(通过tlc监测，约6小时)。将混合物用酸性树脂中和，过滤并且浓缩。然后将混合物与甲苯共蒸发三次并且在真空中干燥。
[0341]
将混合物和tbai(854mg,2.3mmol)溶解在干燥的dmf(100ml)中，并且冷却至0℃。经5min缓慢添加nah(2.8g,60％悬浮液,69.4mmol)。在20min之后，添加pmbcl(9.4ml,
69.4mmol)并且将反应搅拌持续另外10min，此时将温度升高至室温持续4h。将反应再冷却至0℃，并且添加水以使反应猝灭。将有机层用乙酸乙酯稀释，并且用水洗涤两次，用盐水洗涤一次，经na2so4干燥。然后，将混合物过滤并且浓缩。柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)提供了作为白色固体的中间体1-10(11.0g,10.9mmol,对于两个步骤为94％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.50
–
7.43(m,4h),7.37
–
7.20(m,14h),7.11
–
7.04(m,2h),6.94
–
6.78(m,10h),4.88(dd,j＝10.6,4.7hz,2h),4.74(d,j＝10.3hz,2h),4.69
–
4.61(m,1h),4.57(d,j＝11.8hz,1h),4.49(d,j＝11.8hz,1h),4.43(d,j＝10.4hz,1h),4.36(d,j＝7.8hz,1h),3.99(dd,j＝9.8,5.1hz,1h),3.87
–
3.75(m,15h),3.72
–
3.48(m,5h),3.46
–
3.36(m,2h),3.13(d,j＝5.6hz,2h),1.79(t,j＝5.4hz,4h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ159.34,159.28,159.27,159.23,158.48,144.98,136.22,131.03,130.75,130.39,130.34,129.96,129.74,129.60,128.74,128.52,127.82,126.81,114.03,113.89,113.87,113.86,113.84,113.08,103.74,86.10,84.52,82.08,77.76,75.44,74.94,74.73,74.61,73.18,70.01,68.64,63.28,55.37,55.34,55.28,26.97,26.91；esi-ms m/z：对于c
62h68o12
na[m na]
计算值1027.4603，实测值1027.4600。
[0342][0343]
中间体1-11：在将中间体1-10(11.0g,10.9mmol)在acoh/ch2cl2/h2o(15:4:1,120ml)中的溶液在室温搅拌持续2.0h之后，将其用ch2cl2稀释并且倒入冷水中。将有机层用水(4
×
80ml)、饱和的含水nahco3和盐水洗涤，然后经na2so4干燥。在真空中浓缩之后，残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化，以给出作为白色固体的中间体1-11(7.2g,9.8mmol,90％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.26
–
7.13(m,6h),7.07
–
6.86(m,2h),6.86
–
6.55(m,8h),4.77(dd,j＝10.6,2.6hz,2h),4.64(dd,j＝10.5,2.0hz,2h),4.59(d,j＝10.6hz,1h),4.47(d,j＝11.8hz,1h),4.40(d,j＝11.8hz,1h),4.33(d,j＝10.4hz,1h),4.29(d,j＝7.8hz,1h),3.96
–
3.87(m,1h),3.79
–
3.68(m,12h),3.66
–
3.47(m,6h),3.42(t,j＝9.2hz,1h),3.37
–
3.27(m,2h),1.64(dt,j＝18.4,6.1hz,4h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ159.32,159.28,159.26,159.21,130.95,130.73,130.32,130.24,129.83,129.73,129.60,129.55,113.86,113.84,113.82,103.68,84.53,82.05,77.72,75.40,74.88,74.71,74.59,73.14,70.02,68.59,62.62,55.35,55.32,29.67,26.38；esi-ms m/z：对于c
42h52o11
na[m na]
计算值755.3402，实测值755.3409。
[0344][0345]
中间体1-12：向中间体1-11(1.8g,2.4mmol)在dcm(12ml)和水(6ml)中的溶液中添加tempo(75mg,0.48mmol)和baib(2.3g,7.2mmol)。继续搅拌，直到起始材料完全转化(约3小时)。将混合物用饱和的nahso3猝灭，并且用dcm萃取三次。将有机层合并，并且用盐水洗涤，经na2so4干燥。在真空中浓缩之后，残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1/4)
纯化，以给出作为白色固体的中间体1-12(1.3g,1.7mmol,73％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.30
–
7.11(m,6h),6.96(d,j＝8.2hz,2h),6.88
–
6.63(m,8h),4.75(dd,j＝10.6,3.0hz,2h),4.61(dd,j＝23.8,10.7hz,3h),4.51
–
4.28(m,3h),4.27(d,j＝7.7hz,1h),3.96
–
3.81(m,1h),3.72
–
3.71(m,12h),3.65
–
3.23(m,8h),2.43(t,j＝7.4hz,2h),2.06
–
1.90(m,2h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ178.66,159.35,159.31,159.24,130.96,130.66,130.36,130.22,129.93,129.75,129.65,129.59,113.92,113.87,103.63,84.52,82.04,77.68,75.44,74.90,74.73,73.18,68.74,68.52,55.38,30.77,25.03；esi-ms m/z：对于c
42h50o12
na[m na]
计算值769.3194，实测值769.3196。
[0346][0347]
中间体1-13：将中间体1-12(1.3g,1.7mmol)、雷公藤甲素(523mg,1.45mmol)、dmap(36mg,0.3mmol)和dcc(462mg,2.2mmol)在ch2cl2(30ml)中的溶液在室温搅拌持续8h。将所得到的混合物浓缩并且用乙酸乙酯稀释，然后过滤。将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体产物1-13(1.3g,1.2mmol,82％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.27
–
7.12(m,6h),6.96(d,j＝8.6hz,2h),6.85
–
6.66(m,8h),5.06
–
4.97(m,1h),4.77(t,j＝11.0hz,2h),4.69
–
4.54(m,5h),4.48(d,j＝11.8hz,1h),4.39(d,j＝11.9hz,1h),4.32(d,j＝10.4hz,1h),4.28(d,j＝7.8hz,1h),4.11
–
4.03(m,1h),3.79
–
3.70(m,13h),3.60
–
3.30(m,10h),2.67
–
2.42(m,4h),0.95(s,3h),0.87(d,j＝6.9hz,3h),0.73(d,j＝6.9hz,3h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.38,172.76,160.16,159.33,159.27,159.21,130.97,130.77,130.36,130.28,130.00,129.72,129.61,129.56,125.64,113.88,113.85,103.75,84.49,82.01,77.66,75.42,74.92,74.73,74.64,73.18,70.94,70.09,68.78,68.55,63.61,63.40,61.25,59.83,55.37,55.34,55.09,49.20,40.43,35.75,34.04,31.18,29.89,28.15,25.72,25.37,25.05,23.52,17.66,17.14,16.80,13.83。esi-ms m/z：对于c
62h72o17
na[m na]
计算值1111.4662，实测值1111.4649。
[0348][0349]
化合物1：将中间体1-13(1.0g,1.45mmol)溶解在dcm(30ml)中，并且冷却至0℃。然后添加tfa(3.0ml)。在此温度搅拌持续约15min之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(dcm/甲醇＝15:1)色谱分离，以产生作为白色固体的最终产物化合物1(510mg,0.84mmol,58％)。1h nmr(500mhz,cd3od)δ5.09(d,j＝1.0hz,1h),4.83
–
4.72(m,2h),4.26(d,j＝7.8hz,1h),4.03
–
3.92(m,2h),3.86(dd,j＝11.9,2.1hz,1h),3.72
–
3.59(m,3h),3.47(d,j＝5.7hz,1h),3.18(dd,j＝9.1,7.8hz,1h),2.78(d,j＝13.1hz,1h),2.69
–
2.46(m,2h),2.32
–
2.19(m,2h),2.08(t,j＝13.8hz,1h),2.03
–
1.77(m,4h),1.51(dd,j＝12.4,5.0hz,1h),1.37-1.27(m,1h),1.04(s,3h),0.95(d,j＝7.0hz,3h),0.84(d,j＝6.9hz,3h)。
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ176.07,174.57,163.87,125.51,104.49,78.00,77.90,75.08,72.66,71.98,71.61,69.68,64.88,64.21,62.76,61.10,56.74,56.21,41.44,36.81,31.85,30.82,29.48,26.35,24.17,17.94,17.91,17.13,14.23；esi-ms m/z：对于c
30h40o13
na[m na]
计算值631.2361，实测值631.2368。
[0350]
实施例2
[0351]
化合物2的合成
[0352]
[0353][0354]
方案3.化合物2的合成。
[0355]
向雷公藤甲素(200mg,0.56mmol)在吡啶(4ml)中的溶液中添加2,2-二甲基琥珀酸酐(285mg,2.22mmol)和dmap(14mg,0.11mmol)。在搅拌过夜之后，将混合物用乙酸乙酯稀释，然后分别用饱和的硫酸铜、水和盐水洗涤。将有机层经na2so4干燥并过滤。滤液使用旋转蒸发器浓缩以给出残余物。残余物通过硅胶柱色谱法(ch2cl2/ch3oh,15:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体2-1(215mg,0.44mmol,80％)；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.07(s,1h),4.68(s,2h),3.81(d,j＝3.1hz,1h),3.53(d,j＝2.7hz,1h),3.45(d,j＝5.6hz,1h),2.71(dd,j＝23.2,7.1hz,4h),2.32(d,j＝16.4hz,1h),2.15(ddd,j＝25.7,15.9,10.0hz,2h),2.00
–
1.81(m,2h),1.37(s,3h),1.35(s,3h),1.23(dt,j＝11.6,7.9hz,3h),1.05(s,3h),0.94(d,j＝6.9hz,3h),0.82(d,j＝6.9hz,3h)；esi-ms(m/z):511.3[m na]
。
[0356]
在氮气下，将三氯乙酰亚胺酯供体2-2(100mg,0.15mmol)和酸性中间体2-1(49mg,0.1mmol)溶解在ch2cl2(2ml)中。添加粉末状新鲜活化的分子筛(200mg)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约8h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac，2:1至1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体产物2-3(48mg,0.047mmol,a/b＝1.1:1.0,47％)。
[0357]
将碳载钯(10％,10mg)添加到中间体2-3(22mg,0.022mmol)在ch3oh中的溶液。将混合物在氢气气氛下放置持续约4h。将混合物过滤并且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法
(ch2cl2/ch3oh,15:1)纯化，以给出作为白色固体的产物化合物2(10mg,0.015mmol,a/b＝1.0:1.0,71％)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.11(d,j＝3.7hz,0.5h),5.45(d,j＝7.7hz,0.5h),5.07(d,j＝4.3hz,1h),4.80(dd,j＝19.6,10.1hz,2h),3.96(d,j＝3.0hz,1h),3.84(d,j＝11.2hz,1h),3.80
–
3.59(m,4h),3.56(dd,j＝9.8,3.7hz,1h),3.51
–
3.33(m,4h),2.76(p,j＝15.9hz,3h),2.33
–
2.16(m,2h),2.02(d,j＝47.8hz,1h),1.90(ddt,j＝11.6,9.3,7.6hz,2h),1.50(dd,j＝12.5,4.6hz,1h),1.35(d,j＝5.8hz,6h),1.03(s,3h),0.94(dd,j＝7.0,2.0hz,3h),0.84(d,j＝6.9hz,3h)；esi-ms m/z：对于c
32h42o14
na[m na]
计算值673.2467，实测值673.2466。
[0358]
实施例3
[0359]
化合物3的合成
[0360][0361][0362]
方案4.化合物3的合成。
[0363]
在氮气下，将三氯乙酰亚胺酯供体中间体10-4(参见实施例10)(371mg,0.46mmol)和酸性中间体2-1(150mg,0.31mmol)溶解在ch2cl2(6ml)中。添加粉末状新鲜活化的分
子筛(600mg)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约8h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac，2:1至1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体产物3-1(180mg,0.16mmol,a/b＝6.6:1.0,52％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.24(dd,j＝5.7,2.8hz,6h),7.03(d,j＝8.6hz,3h),6.89
–
6.70(m,10h),6.37(d,j＝3.5hz,1h),5.02(d,j＝0.9hz,1h),4.86(d,j＝10.6hz,1h),4.73(dd,j＝10.3,7.6hz,2h),4.66
–
4.43(m,6h),4.39(dd,j＝11.1,4.5hz,2h),3.83
–
3.72(m,18h),3.71
–
3.62(m,4h),3.62
–
3.52(m,2h),3.51
–
3.39(m,1h),3.30(d,j＝5.5hz,1h),1.35(d,j＝5.1hz,7h),1.00(s,3h),0.92(d,j＝6.9hz,4h),0.79(d,j＝6.9hz,4h)；esi-ms m/z：对于c
64h74o18
na[m na]
计算值1153.4767，实测值1153.4781。
[0364]
将中间体3-1(148mg,0.13mmol)溶解在dcm(5ml)中，并且冷却至0℃。然后添加tfa(0.5ml)。在此温度搅拌持续约10min之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(dcm/甲醇＝10:1)色谱分离，以产生作为白色固体的产物作为化合物3(77mg,0.12mmol,a/b＝5.2:1.0,91％)。1h nmr(500mhz,cd3od)δ6.08(d,j＝3.6hz,1h),5.42(d,j＝7.9hz,0h),5.02(d,j＝4.6hz,1h),4.86
–
4.68(m,2h),4.01
–
3.85(m,1h),3.79
–
3.51(m,5h),3.43(dd,j＝12.2,7.4hz,2h),2.89
–
2.64(m,3h),2.21(tt,j＝16.9,4.6hz,2h),2.03(t,j＝13.4hz,1h),1.93
–
1.76(m,2h),1.45(dd,j＝12.7,5.3hz,1h),1.32(d,j＝5.4hz,7h),0.99(s,3h),0.89(d,j＝6.9hz,3h),0.79(d,j＝6.8hz,3h)；
13
c nmr(126mhz,cd3od)δ177.13,176.06,172.35,163.93,125.43,93.92,75.92,74.90,72.96,72.51,71.99,70.80,64.83,64.10,62.82,62.05,61.04,56.68,56.14,49.85,44.78,42.35,41.38,36.75,30.71,29.31,25.63,25.26,24.12,17.91,17.85,17.14,14.16；esi-ms(m/z)：673.6[m na]
；esi-ms m/z：对于c
32h42o14
na[m na]
计算值673.2467，实测值673.2466。
[0365]
实施例4
[0366]
化合物4的合成
[0367]
[0368][0369]
向雷公藤甲素(200mg,0.56mmol)在吡啶(4ml)中的溶液中添加邻苯二甲酸酐(285mg,2.22mmol)和dmap(14mg,0.11mmol)。在搅拌过夜之后，将混合物用乙酸乙酯稀释，然后分别用饱和的硫酸铜、水和盐水洗涤。将有机层经na2so4干燥并过滤。滤液使用旋转蒸发器浓缩以给出残余物。残余物通过硅胶柱色谱法(ch2cl2/ch3oh,15:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体化合物4-1(260mg,0.51mmol,91％)；1h nmr(400mhz,cd3cl)δ5.07(s,1h),4.68(s,2h),3.81(d,j＝3.1hz,1h),3.53(d,j＝2.7hz,1h),3.45(d,j＝5.6hz,1h),2.71(dd,j＝23.2,7.1hz,4h),2.32(d,j＝16.4hz,1h),2.15(ddd,j＝25.7,15.9,10.0hz,2h),2.00
–
1.81(m,2h),1.37(s,3h),1.35(s,3h),1.23(dt,j＝11.6,7.9hz,3h),1.05(s,3h),0.94(d,j＝6.9hz,3h),0.82(d,j＝6.9hz,3h)；esi-ms(m/z)：511.3[m na]
。
[0370]
在氮气下，将三氯乙酰亚胺酯供体中间体10-4(参见实施例10)(618mg,0.77mmol)和酸性中间体4-1(260mg,0.51mmol)溶解在ch2cl2(10ml)中。添加粉末状新鲜活化的分子筛(900mg)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约8h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,2:1至1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体产物4-2α(75mg,0.065mmol,13％)和4-2β(225mg,0.195mmol,39％)。
[0371]
中间体4-2α：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.92(dd,j＝7.5,1.4hz,1h),7.69(dd,j＝7.6,1.4hz,1h),7.62
–
7.50(m,2h),7.35
–
7.23(m,6h),7.06
–
7.00(m,2h),6.91
–
6.77(m,8h),6.53(d,j＝3.5hz,1h),5.28(s,1h),4.86(d,j＝10.6hz,1h),4.78
–
4.54(m,9h),4.40(dd,j＝11.0,8.4hz,2h),3.97
–
3.86(m,2h),3.83
–
3.67(m,21h),3.61(dd,j＝10.8,2.0hz,1h),3.54(d,j＝3.1hz,1h),3.46(d,j＝5.6hz,1h),2.68(d,j＝12.9hz,1h),2.31(d,j＝17.6hz,1h),2.19(ddd,j＝24.9,12.5,6.3hz,4h),1.90
–
1.79(m,1h),1.54(dd,j＝12.1,5.4hz,1h),1.06(s,3h),1.01(d,j＝6.9hz,3h),0.81(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.37,166.23,165.61,160.19,159.44,159.40,159.28,131.78,131.64,131.47,131.03,130.42,130.11,130.02,129.79,129.74,129.72,129.67,129.19,125.63,113.92,113.90,113.87,91.22,81.48,78.70,77.36,76.60,75.38,75.03,73.25,72.72,72.27,70.08,67.60,63.70,61.21,60.50,60.06,55.60,55.38,55.34,55.02,40.47,35.76,29.97,27.36,23.53,21.17,17.58,17.16,16.76,14.31,13.88；esi-ms m/z：对于c
66h70o18
na[m na]
计算值1173.4454，实测值1173.4466。
[0372]
中间体4-2β：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.77(dd,j＝7.8,1.2hz,1h),7.63(dd,j＝7.8,1.3hz,1h),7.52(td,j＝7.6,1.3hz,1h),7.42(td,j＝7.6,1.3hz,1h),7.21
–
7.11(m,5h),7.11
–
7.04(m,2h),7.03
–
6.96(m,2h),6.80
–
6.63(m,9h),5.77
–
5.70(m,1h),5.22(s,1h),4.77
–
4.45(m,9h),4.37(dd,j＝12.9,11.0hz,2h),3.73(d,j＝3.2hz,1h),3.71(s,3h),3.69(s,3h),3.67(s,3h),3.65(s,3h),3.63(q,j＝5.4,4.2hz,5h),3.55
–
3.48(m,1h),3.46(d,j＝3.0hz,1h),3.40(d,j＝5.5hz,1h),2.56(d,j＝12.7hz,1h),2.20(d,j＝17.8hz,1h),2.15
–
1.91(m,3h),1.77(t,j＝14.0hz,1h),1.45(dd,j＝12.4,5.3hz,1h),1.10(td,j＝12.3,5.8hz,1h),0.97(s,3h),0.93(d,j＝6.9hz,3h),0.73(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.30,166.56,164.77,160.22,159.30,159.22,132.90,132.04,130.97,130.66,130.30,130.26,130.20,130.18,129.76,129.73,129.66,129.56,129.51,129.45,129.24,125.43,113.80,113.77,94.88,84.68,80.50,77.01,75.81,75.24,74.59,74.51,73.15,72.16,70.02,67.75,63.61,63.57,61.29,60.02,55.56,55.29,55.24,55.21,54.89,40.33,35.65,29.85,27.33,23.36,17.54,17.06,16.81,13.80；esi-ms m/z：对于c
66h70o18
na[m na]
计算值1173.4454，实测值1173.4466。
[0373][0374]
化合物4：将中间体4-2β(118mg,0.10mmol)溶解在dcm(5ml)中，并且冷却至0℃。然后添加tfa(0.5ml)。在此温度搅拌持续约10min之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(dcm/甲醇＝10:1)色谱分离，以产生作为白色固体的产物化合物4(55mg,80％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.05
–
7.57(m,4h),5.72(d,j＝7.7hz,1h),5.29(d,j＝1.0hz,1h),4.85
–
4.69(m,2h),4.01(d,j＝3.2hz,1h),3.88(dd,j＝12.2,2.2hz,1h),3.76
–
3.67(m,2h),3.58(d,j＝5.6hz,1h),3.54
–
3.37(m,4h),2.87
–
2.71(m,1h),2.36
–
1.98(m,4h),1.57
–
1.43(m,1h),1.33(ddd,j＝17.0,11.4,4.9hz,1h),1.06(s,3h),1.03(d,j＝6.8hz,3h),0.86(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ184.70,176.86,175.66,172.48,142.00,141.68,141.49,141.09,139.42,139.36,134.12,105.44,87.66,86.46,83.20,82.88,80.62,79.63,73.61,72.96,71.45,71.02,70.16,65.58,64.91,50.00,45.41,39.42,37.60,32.78,26.61,26.49,25.84,22.88；esi-ms m/z：对于c
34h38o14
na[m na]
计算值693.2154，实测值693.2143。
[0375]
实施例5
[0376]
化合物5的合成
[0377][0378][0379]
方案5.化合物5的合成。
[0380]
将中间体化合物4-2α(50mg,0.043mmol)溶解在dcm(2ml)中，并且冷却至0℃。然后添加tfa(0.2ml)。在此温度搅拌持续约10min之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(dcm/甲醇＝10:1)色谱分离，以产生作为白色固体的产物化合物5(24mg,83％)。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.14
–
7.51(m,4h),6.38(d,j＝3.7hz,1h),5.27(d,j＝0.9hz,1h),4.86
–
4.70(m,2h),4.00(d,j＝3.1hz,1h),3.93
–
3.71(m,3h),3.71
–
3.67(m,1h),3.66(d,j＝3.7hz,1h),3.58(d,j＝5.6hz,1h),3.48(s,1h),2.78(d,j＝12.3hz,1h),2.33
–
2.18(m,2h),2.10(q,j＝6.9hz,1h),1.99
–
1.87(m,1h),1.56
–
1.46(m,1h),1.39
–
1.27(m,2h),1.04(s,3h),1.00(d,j＝6.9hz,3h),0.86(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ176.08,167.95,167.72,163.89,133.99,133.20,132.53,132.10,130.94,130.25,125.48,94.92,76.28,74.86,74.50,72.61,71.99,70.83,64.95,64.33,62.89,62.11,61.52,56.89,56.28,41.41,36.79,30.80,29.13,24.15,17.98,17.89,17.23,14.23；esi-ms m/z：对于c
34h38o14
na[m na]
计算值693.2154，实测值693.2143。
[0381]
实施例6
[0382]
化合物6的合成
[0383]
[0384][0385]
向雷公藤甲素(50mg,0.14mmol)在吡啶(2ml)中的溶液中添加戊二酸酐(63mg,4mmol)和dmap(24mg,0.556mmol)。在搅拌过夜之后，将混合物用乙酸乙酯稀释，然后分别用饱和的硫酸铜、水和盐水洗涤。将有机层经na2so4干燥并过滤。滤液使用旋转蒸发器浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(ch2cl2/ch3oh,15:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体产物6-1(48mg,0.10mmol,73％)；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.08(s,1h),4.67(s,2h),3.83(d,j＝3.1hz,1h),3.53(d,j＝2.7hz,1h),3.47(d,j＝5.6hz,1h),2.68(d,j＝13.1hz,1h),2.61
–
1.81(m,14h),1.04(s,3h),0.95(d,j＝7.0hz,3h),0.84(d,j＝6.9hz,3h)；esi-ms(m/z)：497.3[m na]
。
[0386]
在氮气下，将三氯乙酰亚胺酯供体中间体2-2(103mg,0.15mmol)和酸性中间体6-1(48mg,0.1mmol)溶解在ch2cl2(2ml)中。添加粉末状新鲜活化的分子筛(200mg)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约8h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体产物6-2α(12mg,0.012mmol,12％)和6-2β(15mg,0.015mmol,15％)。
[0387]
中间体6-2α：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.43
–
7.00(m,21h),6.39(d,j＝3.4hz,1h),5.08(s,1h),4.96(d,j＝10.9hz,1h),4.82(t,j＝10.2hz,2h),4.76
–
4.41(m,7h),4.02
–
3.81(m,2h),3.81
–
3.56(m,5h),3.45(dd,j＝14.9,4.1hz,2h),2.63(d,j＝13.1hz,1h),2.52(dt,j＝17.8,7.2hz,4h),2.33
–
2.17(m,1h),2.17
–
1.92(m,4h),1.92
–
1.73(m,2h),1.67
–
1.44(m,2h),1.34
–
1.05(m,3h),1.00(s,3h),0.94(d,j＝7.0hz,3h),0.81(d,j＝6.9hz,3h)；esi-ms m/z：对于c
59h64o14
na[m na]
计算值1019.4188，实测值1019.4183。
[0388]
中间体6-2β：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.43
–
7.04(m,21h),5.61(d,j＝8.1hz,1h),5.08(s,1h),4.79(d,j＝24.9hz,5h),4.63(d,j＝12.1hz,5h),3.73(s,5h),3.67
–
3.52(m,2h),3.48(d,j＝3.0hz,1h),3.44(d,j＝5.5hz,1h),2.65(d,j＝13.3hz,1h),2.59
–
2.22(m,5h),2.04(s,7h),1.66
–
1.47(m,2h),1.33
–
1.12(m,3h),1.01(s,3h),0.94(d,j＝7.0hz,3h),0.82(d,j＝6.9hz,3h)；esi-ms m/z：对于c
59h64o14
na[m na]
计算值1019.4188，实测值1019.4183。
[0389][0390]
化合物6：将碳载钯(10％,5mg)添加到中间体化合物6-2β(10mg,0.010mmol)在ch3oh中的溶液。将混合物在氢气气氛下放置持续约4h。将混合物过滤并且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(ch2cl2/ch3oh,15:1)纯化，以给出作为白色固体的化合物6(5mg,0.008mmol,82％)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ5.49(d,j＝8.1hz,1h),5.09(s,1h),4.83
–
4.78(m,1h),3.96(d,j＝3.2hz,1h),3.83(dd,j＝12.1,1.7hz,1h),3.70
–
3.57(m,2h),3.48(d,j＝5.6hz,1h),3.45
–
3.35(m,3h),2.78(d,j＝15.3hz,1h),2.60
–
2.42(m,4h),2.27(dt,j＝15.0,5.9hz,2h),2.15
–
1.81(m,5h),1.51(dd,j＝12.7,4.5hz,1h),1.39
–
1.19(m,3h),1.04(s,2h),0.95(d,j＝7.0hz,2h),0.85(d,j＝7.0hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ176.11,173.91,173.68,163.89,125.54,93.47,75.99,74.81,72.77,72.30,71.99,70.98,64.92,64.15,62.84,62.27,61.15,56.79,56.24,41.45,36.83,34.17,33.87,30.79,29.62,24.17,21.28,17.95,17.11,14.25；esi-ms(m/z)：659.5[m na]
。
[0391]
实施例7
[0392]
化合物7的合成
[0393]
[0394][0395]
方案6.化合物7的合成。
[0396]
化合物7：将碳载钯(10％,5mg)添加到中间体化合物6-2α(10mg,0.01mmol)在ch3oh中的溶液。将混合物在氢气气氛下放置持续约4h。将混合物过滤并且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(ch2cl2/ch3oh,15:1)纯化，以给出作为白色固体的产物化合物7(5mg,0.008mmol,82％)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ6.04(d,j＝3.7hz,1h),4.99(s,1h),4.73
–
4.68(m,2h),3.86(d,j＝3.1hz,1h),3.70
–
3.63(m,1h),3.62
–
3.51(m,4h),3.45(dd,j＝9.7,3.8hz,1h),3.38(d,j＝5.6hz,1h),3.33
–
3.24(m,2h),2.76
–
2.29(m,6h),2.22
–
2.09(m,2h),2.06
–
1.72(m,6h),1.46
–
1.38(m,1h),0.95(s,3h),0.85(d,j＝7.0hz,3h),0.75(d,j＝7.0hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ176.11,173.91,173.68,163.89,125.54,93.47,75.99,74.81,72.77,72.30,71.99,70.98,64.92,64.15,62.84,62.27,61.15,56.79,56.24,41.45,36.83,34.17,33.87,30.79,29.62,24.17,21.28,17.95,17.11,14.25；esi-ms(m/z)：659.5[m na]
。
[0397]
实施例8
[0398]
化合物8的合成
[0399]
[0400][0401]
方案7.化合物8的合成。
[0402]
将酸性中间体10-5(60mg,0.13mmol)、中间体化合物8-1(92mg,0.20mmol)、dmap(催化剂)和edci(50mg,0.26mmol)在ch2cl2(4ml)中的溶液在室温搅拌持续8h。将所得到的混合物用ch2cl2稀释，然后分别用水和盐水洗涤。将有机层经na2so4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,3:2)纯化，以给出作为白色固体的中间体化合物8-2(97mg,0.11mmol,82％)。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ5.04(d,j＝0.9hz,1h),4.96(d,j＝3.0hz,1h),4.63(s,2h),4.32(dd,j＝11.8,2.3hz,1h),4.01(dd,j＝11.8,5.4hz,1h),3.86(ddd,j＝9.8,5.3,2.2hz,1h),3.78(d,j＝3.2hz,1h),3.74(t,j＝8.8hz,1h),3.49(dd,j＝3.1,0.9hz,1h),3.41(d,j＝5.8hz,1h),3.40
–
3.36(m,1h),3.32(dd,j＝9.1,3.0hz,1h),2.80
–
2.60(m,5h),2.31
–
2.02(m,4h),1.93
–
1.81(m,2h),1.52(dd,j＝11.9,5.8hz,1h),1.01(s,3h),0.90(d,j＝6.9hz,3h),0.79(d,j＝6.9hz,3h),0.11(s,3h),0.11(s,3h),0.10(s,3h),0.09(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ173.25,172.00,171.70,160.11,125.54,93.91,73.93,73.84,72.38,71.23,70.02,69.91,64.16,63.52,63.35,61.19,59.70,55.36,55.02,40.38,35.69,29.86,29.14,29.00,27.99,23.46,17.53,17.09,16.74,13.79,1.27,0.96,0.48,0.17；esi-ms m/z：对于c
42h70o14
nasi[m na]
计算值933.3735，实测值933.3740。
[0403]
将中间体化合物8-2(25mg,0.027mmol)溶解在dcm(1.5ml)中，并且冷却至0℃。然后添加tfa(0.15ml)。在此温度搅拌持续约45min之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(dcm/甲醇＝10:1)色谱分离，以产生作为白色固体的产物化合物8(15mg,0.024mmol,89％)。1h nmr(500mhz,cd3od)δ5.51(s,0.37h),5.11(d,j＝3.7hz,0.66h),5.09(d,j＝1.1hz,1h),4.86
–
4.76(m,2h),4.50(d,j＝7.8hz,0.33h),4.49
–
4.43(m,0.32h),4.39(dd,j＝11.7,2.2hz,0.63h),4.29
–
4.17(m,1h),4.03
–
3.98(m,0.57h),3.98(dd,j＝3.3,1.2hz,1h),3.69(t,j＝9.3hz,0.62h),3.65(td,j＝3.5,1.0hz,1h),3.52(ddd,j＝9.5,6.1,2.1hz,0.35h),3.48(d,j＝5.7hz,1h),3.37(s,1h),3.31
–
3.26(m,1.45h),3.16(dd,j＝9.0,7.8hz,032h),2.84
–
2.76(m,1h),2.76
–
2.65(m,4h),2.27(ddt,j＝17.0,11.0,5.7hz,2h),2.16
–
2.04(m,1h),1.99
–
1.85(m,2h),1.53(ddd,j＝12.5,5.6,1.5hz,1h),1.34(ddd,j＝21.7,10.8,5.2hz,2h),1.26(t,j＝7.1hz,0h),1.06(s,3h),0.96(d,j＝7.0hz,3h),0.85(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ176.10,173.92,173.85,173.35,173.31,163.91,125.50,98.22,93.96,77.93,76.16,75.31,74.73,73.73,73.06,73.05,
72.00,71.96,71.71,70.60,65.35,65.27,64.87,64.27,62.70,61.00,56.74,56.18,41.45,36.79,30.82,30.06,29.84,29.82,29.11,24.16,17.91,17.87,17.08,14.21,14.19；esi-ms m/z：对于c
30h38o14
na[m na]
计算值645.2154，实测值645.2159。
[0404]
实施例9
[0405]
化合物9的合成
[0406][0407][0408]
方案8.化合物9的合成。
[0409]
将酸性中间体10-5(25mg,0.054mmol)、中间体化合物9-1(50mg,0.11mmol)、dmap(2mg,0.011mmol)和dcc(22mg,0.11mmol)在ch2cl2(2ml)中的溶液在室温搅拌持续8h。将所得到的混合物用ch2cl2稀释，然后分别用水和盐水洗涤。将有机层经na2so4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,3:2)纯化，以给出作为白色固体的中间体产物9-2(41mg,0.045mmol,83％)。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.46
–
7.13(m,13h),5.04(s,1h),4.99(d,j＝10.8hz,1h),4.86(d,j＝10.8hz,1h),4.82(d,j＝10.8hz,1h),4.78(d,j＝12.1hz,1h),4.70
–
4.53(m,5h),4.35(dd,j＝11.9,4.5hz,1h),4.26(dd,j＝11.9,2.1hz,1h),3.99(t,j＝9.2hz,1h),3.84
–
3.75(m,2h),3.54(dd,j＝9.6,3.6hz,1h),3.51
–
3.45(m,2h),3.39(d,j＝5.6hz,1h),3.36(s,3h),2.30(d,j＝15.1hz,1h),1.54(dd,j＝12.5,4.7hz,1h),1.02(s,3h),0.90(d,j＝7.0hz,3h),0.80(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ173.32,171.95,171.77,160.05,138.75,138.16,128.61,128.55,128.24,128.18,128.12,128.10,127.98,127.80,125.70,98.19,82.16,80.03,77.47,75.95,75.19,73.52,71.34,70.06,68.70,63.62,63.42,63.35,61.30,59.76,55.47,55.38,55.10,40.46,35.77,29.96,29.16,29.03,28.16,23.51,17.58,17.18,16.81,
13.88；esi-ms(m/z)：930.4[m na]
。
[0410]
将碳载钯(10％,10mg)添加到中间体化合物9-2(17mg,0.019mmol)在ch3oh中的溶液。将混合物在氢气气氛下放置持续约14h。将混合物过滤并且浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(ch2cl2/ch3oh,15:1)纯化，以给出作为白色固体的化合物9(7mg,0.011mmol,60％)：1h nmr(400mhz,cd3od)δ5.07(s,1h),4.87
–
4.72(m,2h),4.65(d,j＝3.7hz,1h),4.41(dd,j＝11.7,2.0hz,1h),4.26
–
4.14(m,1h),3.96(d,j＝3.2hz,1h),3.80
–
3.69(m,1h),3.63(d,j＝3.0hz,1h),3.60(d,j＝9.2hz,1h),3.46(d,j＝5.6hz,1h),3.45
–
3.38(m,4h),2.71(t,j＝3.6hz,6h),2.37
–
1.83(m,5h),1.04(s,3h),0.94(d,j＝7.0hz,3h),0.83(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ176.08,173.82,173.27,163.89,125.51,101.25,75.04,73.45,73.07,71.98,71.89,71.02,65.23,64.87,64.27,62.69,61.00,56.73,56.19,55.63,41.46,36.80,30.83,30.09,29.86,29.10,24.17,17.92,17.87,17.08,14.19；esi-ms(m/z)：659.6[m na]
。
[0411]
实施例10
[0412]
化合物10的合成
[0413][0414][0415]
方案9.化合物10的合成。
[0416][0417]
中间体10-2：向中间体10-1(参见das等人(1996)j.am.chem.soc.296:275-77；barry等人(2013)j.am.chem.soc.135:16895-903.)(2.1g,5.3mmol)在甲醇(20ml)中的溶液中添加naome(29mg,0.5mmol)。继续搅拌，直到起始材料完全转化(通过tlc监测，约2小时)。将混合物用酸性树脂中和，过滤并且浓缩。然后将混合物与甲苯共蒸发三次并且在真空中干燥。
[0418]
将混合物溶解在干燥的dmf(27ml)中并且冷却至0℃。经5min缓慢添加nah(1.28g,60％悬浮液,32.1mmol)。在10min之后，添加pmbcl(5.8ml,42.8mmol)并且将反应搅拌持续另外10min，此时将温度升高至室温持续4h。将反应再冷却至0℃，并且添加水以使反应猝灭。将有机层用乙酸乙酯稀释，并且用水洗涤两次，用盐水洗涤一次，经na2so4干燥。然后，将混合物过滤并且浓缩。柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)提供作为白色固体的中间体产物10-2(3.4g,4.8mmol,对于两个步骤为91％)；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.43
–
7.26(m,6h),7.11
–
7.03(m,2h),6.91
–
6.79(m,8h),4.90
–
4.41(m,9h),3.84
–
3.78(m,13h),3.72
–
3.59(m,3h),3.54(dd,j＝10.0,8.5hz,1h),3.47
–
3.36(m,2h),2.87
–
2.68(m,2h),1.33(t,j＝7.4hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ159.45,159.39,159.29,159.28,130.93,130.37,130.10,129.75,129.56,129.49,113.96,113.93,113.90,113.85,86.53,85.21,81.63,79.23,77.85,77.37,75.52,75.24,74.79,73.16,68.84,55.39,25.16,15.32；esi-ms m/z：对于c
40h48
o9na[m na]
计算值727.2911，实测值727.2919。
[0419][0420]
中间体10-3：将硫代糖苷中间体10-2(3.0g,4.25mmol)溶解在丙酮(50ml)和水(5ml)中，并且冷却至0℃。添加n-溴代琥珀酰亚胺(1.9g,10.7mmol)，其产生亮橙色。在0℃继续搅拌，直到tlc指示起始材料消失(约1h)。将反应浓缩，然后溶解在乙酸乙酯中并且用水和盐水洗涤。将有机层经na2so4干燥。然后，将混合物过滤并且浓缩。柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝2/1至1/1)提供了作为白色固体的中间体产物10-3(1.95g,3.0mmol,71％)。esi-ms(m/z)：683.6[m na]
。
[0421][0422]
中间体10-4：将内半缩醛中间体10-3(380mg,0.58)溶解在ch2cl2(5ml)中并且冷却至0℃。依次添加三氯乙腈(0.3ml,2.88mmol)和dbu(催化剂)。在室温搅拌持续约2h之后，将
反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(石油醚/etoac＝4:1，包含1％ et3n)色谱分离，以产生作为无色油的亚氨酸酯中间体10-4(400mg,86％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.57(s,1h),7.42
–
6.69(m,16h),6.47(d,j＝3.4hz,1h),4.87(d,j＝10.6hz,1h),4.79
–
4.71(m,2h),4.66(d,j＝11.3hz,1h),4.60(d,j＝11.3hz,1h),4.56(d,j＝11.7hz,1h),4.40(d,j＝2.9hz,1h),4.37(d,j＝4.4hz,1h),4.03
–
3.89(m,2h),3.80(s,3h),3.79(s,3h),3.78(s,3h),3.76(s,3h),3.75
–
3.66(m,3h),3.60(dd,j＝10.8,2.1hz,1h)。
[0423][0424]
中间体10-3：在氮气下，将三氯乙酰亚胺酯供体中间体10-4(2.7g,3.35mmol)和酸性中间体10-5(1.03g,2.24mmol)溶解在ch2cl2(100ml)中。添加粉末状新鲜活化的分子筛(200mg)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约8h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体化合物10-6(2.43g,2.2mmol,98％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.42
–
6.71(m,16h),5.58(d,j＝8.0hz,1h),5.08(s,1h),4.93
–
4.50(m,9h),4.46
–
4.26(m,2h),3.74
–
3.26(m,10h),2.72(m,6h),1.04(s,3h),0.95(d,j＝7.0hz,3h),0.83(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ173.43,171.55,170.70,160.18,159.36,159.29,130.72,130.37,130.27,130.03,129.81,129.67,129.62,129.56,125.66,113.90,113.86,94.49,84.57,80.68,75.60,75.44,74.70,73.17,71.44,70.11,67.65,63.61,63.41,61.28,59.72,55.45,55.37,55.32,55.08,40.44,35.74,29.90,29.22,28.95,28.00,23.50,17.58,17.13,16.79,13.85；esi-ms m/z：对于c
62h70o18
na[m na]
计算值1125.4454，实测值1125.4471。
[0425][0426]
合成中间体10-6的可选择的路线：在氮气下，将四-o-对甲氧基苄基-葡萄糖中间体10-7(1.32g,2.0mmol)和琥珀酸酐(800mg,8.0mmol)溶解在甲苯(40ml)中。在搅拌持续15min之后，添加nah(120mg,3.0mmol)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约8h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体化合物10-8(1.48g,1.96mmol,98％)。
[0427]
在氮气下，将酸性中间体10-8(1.14g,1.5mmol)和雷公藤甲素(360mg,1.0mmol)溶解在ch2cl2(15ml)中。添加粉末状新鲜活化的分子筛(2g)。继续搅拌，直到tlc指示供体消失(约6h)。混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空中浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚/etoac,1:1)纯化，以给出作为白色固体的中间体化合物10-6(938mg,0.85mmol,85％)。
[0428][0429]
化合物10：将中间体化合物10-6(2.0g,1.81mmol)溶解在dcm(36.0ml)中，并且冷
却至0℃。然后添加tfa(3.6ml)。在此温度搅拌持续约10min之后，将反应混合物在真空中浓缩。残余物经硅胶(dcm/甲醇＝10:1)色谱分离，以产生作为白色固体的产物化合物10(1.1g,1.77mmol,98％)。1h nmr(500mhz,cd3od)δ5.54
–
5.43(d,j＝8.0,1h),5.08(s,1h),3.97(d,j＝3.1hz,1h),3.90
–
3.77(m,1h),3.68(dd,j＝12.0,4.4hz,1h),3.64(d,j＝2.7hz,1h),3.48(d,j＝5.7hz,1h),3.46
–
3.35(m,4h),2.85
–
2.67(m,4h),2.39
–
2.18(m,2h),2.07(m,1h),1.91(m,2h),1.50(dd,j＝12.4,4.9hz,1h),1.34(td,j＝12.1,5.8hz,1h),1.03(s,3h),0.93(d,j＝7.0hz,3h),0.84(d,j＝6.9hz,3h)；
13
c nmr(125mhz,cd3od)δ176.01,173.23,172.72,163.85,125.46,111.34,95.88,78.72,77.83,73.91,73.05,71.98,70.97,64.90,64.26,62.72,62.28,61.00,56.76,56.15,41.41,36.76,30.79,29.87,29.77,29.16,24.12,17.92,17.13,14.24；esi-ms m/z：对于c
30h38o14
na[m na]
计算值645.2154，实测值645.2166。
[0430]
实施例11
[0431]
葡萄糖-雷公藤甲素缀合物的测试
[0432]
细胞和培养条件.将原代星形胶质细胞(lonza,walkersville,md；具有agm
tm singlequots
tm
补充包的abm
tm
基础培养基)、成纤维细胞(atcc；具有成纤维细胞生长试剂盒-无血清(pcs-201-040
tm
)的成纤维细胞基础培养基(pcs-201-030
tm
))、气道上皮细胞(atcc；具有支气管上皮细胞生长试剂盒(pcs-300-040
tm
)的气道上皮细胞基础培养基(pcs-300-030
tm
))、肾近端小管(atcc；具有肾上皮细胞生长试剂盒(pcs-400-040
tm
)的肾上皮细胞基础培养基(pcs-400-030
tm
))、前列腺上皮细胞(lonza；pregm
tm bulletkit
tm
)和乳腺上皮细胞(lonza；mebm
tm bulletkit
tm
)保持在37℃、调节至5％ co2的加湿培养箱中。前列腺癌细胞系(pc3、lncap、du-145)、乳腺癌细胞系(mda-mb-231、mda-mb-453、sk-br-3)、头颈癌细胞系(a253、detroit 562、scc-25)、黑素瘤细胞系(sk-mel-3、sk-mel-1、rpmi-7951)、胰腺癌细胞系(cfpac-1、bxpc3、sw1990)、肺癌细胞系(a549、nci-h1299、nci-h1437)和肝癌细胞系(snu-475、sk-hep-1、snu-387)获自atcc，并且在它们相应的培养基(前列腺细胞：rpmi-1640，mda-mb-231：rpmi-1640，mda-mb-453：leibovitz’s l-15，sk-br-3：mccoy’s 5a，a253：mccoy’s5a，detroit 562：emem，scc-25：dmem，sk-mel-3：mccoy’s 5a，sk-mel-1：emem，rpmi-7951：emem，cfpac-1：imdm，bxpc3：rpmi-1640，sw1990：leibovitz’s l-15，a549：f-12k，nci-h1299：rpmi-1640，nci-h1437：rpmi-1640，snu-475：rpmi-1640，sk-hep-1：emem，snu-387：rpmi-1640)中培养。所有培养基均补充有10％(体积/体积)过滤的胎牛血清(fbs,invitrogen,carlsbad,ca)、1％青霉素/链霉素(invitrogen)，并且保持在37℃和5％ co2的加湿培养箱中，除了在没有co2控制的情况下在37℃生长的mda-mb-453和sw1990之外。将人类胚肾293t(hek293t)、hela(atcc)的野生型(atcc)和c342t xpb敲入细胞(命名为t7115)在具有10％(体积/体积)过滤的胎牛血清(fbs,invitrogen,carlsbad,ca)、1％青霉素/链霉素(invitrogen)的dmem(gibco)中培养。
[0433]
体内肿瘤异种移植物测定.动物实验遵循由约翰
·
霍普金斯大学动物护理和使用委员会(johns hopkins university animal care and use committee)批准的协议进行。本研究中使用的人类前列腺癌转移的实验性鼠模型如先前描述地产生。(bhatnagar等人
(2014)cancer res.74:5772-81)。简言之，四至六周龄的雄性nod/scid/il2rγnull(nsg,购自animal resources core,jhu)经由尾静脉注射一百万个pc3/ml/fluc细胞。在注射之后三周，使用ivis光谱成像系统(caliper life sciences,hopkinton,ma)通过生物发光成像(bli)来确认肿瘤形成，并且小鼠每天一次(腹膜内注射)被给予指示剂量的药物持续30天。然后每周通过bli监测肿瘤进展，并且同时监测存活。
[0434]
试剂.雷公藤甲素和wzb117购自sigma，而螺内酯获自acros organics。多柔比星来自apexbio。
[0435]
增殖和生存力测定.[3h]-胸苷并入。将hek293t细胞(10,000个细胞/孔)接种到96孔板中，然后在37℃和5％ co2在dmem加10％ fbs和1％青霉素/链霉素中培养过夜。以指示浓度添加药物，并且继续孵育持续另外的24h。对于低氧，在药物暴露持续48h之前，将pc3(5,000个细胞/孔)在37℃在加湿低氧室(billups-rothenberg)中暴露于1％ o2(airgas)持续48h。然后使用每孔1μci的[3h]-胸苷(perkin elmer)的等分试样将经处理的细胞脉冲持续另外的6h。使用tomtec采集器96mach iii m将放射性标记的细胞采集到印刷的filtermat a玻璃纤维过滤器(perkin elmer)上。将betaplate scint(perkin elmer)闪烁液添加到放射性标记的过滤器中，随后在microbeta2 lumijet微板计数器(perkin elmer)上进行闪烁计数。
[0436]
xtt测定.将五千个细胞/孔铺板在全生长培养基中的平底、透明的96孔板上，并且在适当的培养条件下孵育。在接种之后二十四小时，将细胞用指示的药物处理，并且孵育持续47小时。使用r&d systems
tm tacs xtt细胞增殖/生存力测定(r&d systems,minneapolis,mn)测量细胞生存力。
[0437]
atp酶活性测定.将tfiih复合物纯化，并且其dna依赖性atp酶测定如先前描述地进行(titov等人(2011)nat.chem.biol.7:182-88)。简言之，10μl反应混合物包含20mm tris(ph 7.9)、4mm mgcl2、1μm的atp,0.1μci[γ-32
p]atp(3000ci/mmol)、100μg/ml bsa、100nm rna聚合酶ii启动子阳性对照dna、1nm tfiih和指示浓度的雷公藤甲素或其类似物。反应通过添加tfiih持续2小时开始并且通过添加2μl的0.5m edta停止。将1μl反应混合物的等分试样点在pei-纤维素(sigma)上，并且色谱图用0.5m licl和1m hcooh显色。使用typhoon fla 9500变量成像仪(ge healthcare)来定量atp水解的百分比。
[0438]
糖化雷公藤甲素在人类血清中的稳定性.将人类血清(sigma,在dmem培养基中的10％)在室温用10μm药物(雷公藤甲素或糖化雷公藤甲素)处理持续不同的时间点。通过将样品放置在干冰上，随后在-80℃过夜储存来停止孵育。然后将冷冻样品冻干并在室温在dmso中重构持续1小时。将样品以12,000rpm离心持续10分钟，并且用以下条件将上清液加载到hplc-ms中：(varian pursuit xr5 diphenyl 150
×
4.6mm；a相：具有0.1％ hcooh的millipore水；b相：具有0.1％ hcooh的乙腈；0-6min：95％ b；6-24min：5％ b-100％ b；24-28min：100％ b；28-29min：100％b5％ b；29-30min：5％ b)。
[0439]
蛋白质印迹分析.全细胞裂解物通过以下来制备：在冰中将裂解缓冲液[4％ sds、20％甘油、10％2-巯基乙醇、0.004％溴酚蓝、0.125m tris-hcl(ph 6.8)]添加到细胞沉淀物中持续30分钟，随后以12,000
×
g离心持续10分钟，然后煮沸持续5分钟。为了分离细胞色素c的细胞溶质级分和线粒体级分，将细胞沉淀物再悬浮在clami缓冲液(250mm蔗糖、70mm kcl、在1x pbs中的50mg/ml毛地黄皂苷、蛋白酶抑制剂混合物(1片剂/10ml clami缓冲液))
中，然后在冰上孵育持续5分钟。在4℃以12,000
×
g离心持续5分钟之后，收集上清液(细胞质级分)，并且将沉淀物再悬浮在如上文描述的裂解缓冲液中。然后通过sds-page分离蛋白质并转移到硝化纤维素膜(bio-rad)。在室温封闭持续1h之后，将膜在4℃用包括抗rpb1抗体(santa cruz biotechnology)、抗xpb抗体(biotechne)、抗肌动蛋白抗体(developmental studies hybridoma bank)、抗gapdh抗体(santa cruz biotechnology)、抗细胞色素c抗体(santa cruz biotechnology)、抗parp1抗体(santa cruz biotechnology)、抗裂解的胱天蛋白酶3抗体(cell signaling technology)、抗vdac抗体(proteintech)、抗hif-1α抗体(bd sciences)和抗glut1抗体(santa cruz biotechnology)的一级抗体孵育过夜，随后用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或抗兔igg(ge healthcare)在室温孵育持续2小时。使用增强的化学发光(ecl)免疫印迹检测试剂(emd millipore)检测抗体-蛋白质复合物。
[0440]
免疫细胞化学和细胞化学.将hela细胞或pc3细胞(2
×
105个)接种在mattek玻璃底培养皿(fisher scientific,pittsburgh,pa,usa)上，并且允许附着持续24h。然后将细胞用dmso或药物处理持续6h或24h，然后用4％多聚甲醛固定，使用具有0.5％triton x 100的1x pbs透性化，然后分别使用抗rnapii抗体(santa cruz biotechnology)和抗hif-1α抗体(bd sciences)探测内源性rna聚合酶ii催化亚基rpb1或hif-1α。然后使用抗小鼠alexa fluor 488(invitrogen)进行检测。对于核染色，在成像之前将固定的且透性化的细胞在dapi(thermofisher)或hoechst 33258(sigma)中孵育持续30分钟。通过在固定之前将细胞在200μm 2-nbdg(thermofisher)中孵育持续6小时来监测葡萄糖摄取。在nikon eclipse te200倒置的显微镜(nikon instruments inc.,melville,ny,usa)下观察荧光。imagej软件(nih,bethesda,md,usa；http://imagej.nih.gov/ij/index.html)用于测量免疫-细胞化学样品中细胞内蛋白质水平(li等人(2015)toxicological sciences:an official journal of the society of toxicology 143:196-208)。使用imagej的measure特征测量rpb1水平，其中从核rpb1的综合密度中减去所有背景信号。
[0441]
定量和统计学分析.使用mac,graphpad softward(www.graphpad.com)的graphpad prism进行对剂量曲线的数据拟合。统计值在附图和表中报告。除非另外说明，否则结果被表示为平均值和sem，并且使用双尾学生t检验(不等方差)确定统计学显著性。使用kaplan-meier方法估计存活曲线，并且卡方检验用于确定组之间的显著差异，如先前描述的(sullivan等人(2017)essentials of biostatistics for public health第3版,johnes and bartlett publishers)。
[0442]
表3.所公开的化合物对hek 293t细胞的抗增殖活性。
[0443]
[0444][0445]
表3示出雷公藤甲素(tpl)和所公开的葡萄糖缀合的雷公藤甲素对hek 293t细胞的抗增殖活性。
[0446]
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文描述的特定的组合物和程序的许多等效物。这样的等效物被认为是在本公开内容的范围内并且被所附权利要求覆盖。
再多了解一些
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