多巴胺D3部分激动剂用于治疗中枢神经系统疾病的用途的制作方法

多巴胺d3部分激动剂用于治疗中枢神经系统疾病的用途


背景技术：

1.不安腿综合征(rls，或willis ekbom氏病，wed)是一种与睡眠相关的行动疾病，在人群中的患病率从9.4％到15％不等。它主要发生在病人躺着的时候，表现为动腿的冲动。这与肢体的异常感觉有关，这些感觉在运动活动中减弱，并与昼夜节律模式有关，在夜间出现高峰。
2.这是一种致残的中枢神经系统(cns)疾病，有证据支持使用多巴胺激动剂。有趣的是，下丘脑多巴胺有昼夜节律，在rls出现的夜间观察到的浓度最低(carlsson等人，psychopathology of affective disorders，75-85，1980)。此外，rls的主要治疗包括多巴胺d2/d3完全激动剂：刺激多巴胺受体对rls是有益的第一个证据是对五名患者的一项试验，该试验表明，使用左旋多巴加苄丝肼(一种间接的完全多巴胺激动剂，已知可以补偿帕金森病患者的多巴胺缺乏)的治疗完全解决了这五名患者的rls症状(akpinar,s.arch.neurol.，1982，39(11)，739)。此外，使用溴隐亭(一种直接的完全多巴胺激动剂)的治疗也有类似的效果。hening等人(sleep，vol.27，3，2004，560-583)也报道了使用d2受体激动剂对rls进行多巴胺能的治疗。
3.此后，几种其他用作抗帕金森病药物的完全d2/d3多巴胺激动剂被开发出来，目前用于rls的治疗：普拉克索、罗匹尼罗和罗替戈汀(clemens等人，advances in pharmacology，2019，84，79)。目前用于治疗rls的所有多巴胺能的药物都是d3和d2这两种受体的完全激动剂。
4.神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病，有一个共同的细胞和分子致病机制，该机制涉及异常错误折叠的蛋白质或肽聚集和沉积。
5.帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病是由于中枢神经系统(cns)神经元中聚集了帕金蛋白、亨廷顿蛋白或β-淀粉样蛋白等有毒蛋白而引起的退行性疾病。这些蛋白质可以通过多种细胞过程清除，其中自噬是一种非常有效的过程(wang等人，international journal of molecular sciences，2018，19，1422-0067)。
6.自噬是降解聚集的细胞蛋白质和功能失调的细胞器的主要途径。最近的研究表明，自噬的上调可导致这些有毒蛋白水平的降低，并在衰老和各种神经退行性疾病模型的背景下是有益的。了解参与自噬调控的信号通路对开发新的治疗方法至关重要。
7.自噬在上述疾病中可能不够有效，但在药理上刺激自噬有明显优势。在此背景下，一些作者已经报道了多巴胺d2和d3受体被普拉克索和喹吡罗激活可以促进几种细胞系(包括原代神经元)的自噬激活(luis-ravelo等人，experimental neurology，2018，299，137-147；wang等人，autophagy，2015，11，2057-2073)。
8.特别是，已经表明普拉克索(一种完全d3/d2激动剂)能增强自噬作用，并且其作用被纯d3-受体拮抗剂阻断。尽管这表明d3受体的完全刺激会刺激自噬，从而防止神经元变性，但部分d3受体激动剂的作用尚未被揭示(wang等人，2018(同上)；barroso-chinea等人，autophagy，2019，1-17)。
9.这些疾病需要长期治疗。据报道，该病的长期治疗中存在一些问题，包括随着时间
的推移疗效丧失以及若干副作用，这些与d2和/或d3完全激动剂相关。
10.恶心和呕吐是由d2激动剂刺激d2受体所致的常见不良事件，目前使用的d2/d3完全多巴胺激动剂促进行为控制的丧失，导致赌博或性欲亢进等疾病。此外，亢进，即长期使用上述药物后的症状加重，大概是由于d2或d3受体过度刺激所致，这是目前使用的多巴胺d2/d3完全激动剂的一个严重缺点。
11.因此，仍然需要提供一种对中枢神经系统(cns)的疾病的有效治疗，而没有上述副作用。
12.wo 2007/148208公开了d3受体配体，其可以是拮抗剂，或反向激动剂，或部分激动剂或完全激动剂。di ciano等人(neuropsychopharmacology，44，1284-1290，2019)报道了其中公开的化合物之一(bp1.4979)是d3部分激动剂，也具有d2拮抗剂性质。
13.现已令人惊讶地发现，这种具有d3部分激动剂活性和d2拮抗活性的化合物虽然是部分d3激动剂，但对中枢神经系统(cns)的疾病完全有效。事实上，从来没有人认为d3受体的部分激动剂能够像d3完全激动剂一样有效地治疗这些疾病。


技术实现要素：

14.根据第一目的，本发明涉及下式的化合物bp1.4979，或其药学上可接受的盐，或其水合物，或其水合盐，或其多晶形的晶体结构，用于预防或治疗中枢神经系统(cns)的疾病的用途，
[0015][0016]
n-(4-{2-[4-(3-氰基苯基)哌嗪-1-基]乙基}环己基)-3-甲氧基丙酰胺。
[0017]
根据一种实施方式，所述疾病选自不安腿综合征(rls)、特发性震颤、暴食症和神经退行性疾病。
[0018]
根据一种实施方式，所述疾病是不安腿综合征。
[0019]
根据一种实施方式，所述疾病是特发性震颤。
[0020]
根据一种实施方式，所述疾病是暴食症。
[0021]
根据一种实施方式，所述疾病是神经退行性疾病。
[0022]
根据一种实施方式，所述神经退行性疾病选自帕金森病(pd)、阿尔茨海默病(ad)和亨廷顿病(hd)。
[0023]
bp1.4979为d3部分激动剂和d2拮抗剂。bp1.4979的结构和制备工艺公开于wo 2007/148208。
[0024]
已经发现它是一种强效、选择性但部分的d3受体激动剂：当在功能测试(即有丝分裂)中评估时，它对克隆的人多巴胺d3受体具有活性，解离常数为1.2nm，内在活性为30％。相比之下，它对人d2受体仅显示661nm的ki值，对该受体，它表现为一种纯拮抗剂。此外，它对160个其他受体、通道或酶没有活性。
[0025]
然而，尽管它显示出d3部分激动剂的特性，令人惊讶地发现它与多巴胺本身或完
全多巴胺d3激动剂一样有效。
[0026]
因此，d3部分激动剂的活性，特别是达到与d3完全激动剂相同的程度，是出乎意料的。
[0027]
此外，d3部分激动剂涉及较少的副作用，如d3完全激动剂所涉及的那些副作用(尤其是亢进)。
[0028]
此外，d2拮抗剂是止吐剂，因此没有所报道的目前用于治疗rls的d2激动剂的副作用，如恶心和呕吐。
[0029]
此外，d3受体相对于d2受体的选择性是非常出乎意料的，因为d2和d3受体是高度同源的蛋白质，在跨膜区域内具有78％的序列同一性。因此，众所周知，获得相对于d2受体的d3选择性化合物是困难的(chien等人，science，330，1091(2010))。
[0030]
就rls而言，已经发现，bp1.4979对rls与多巴胺本身或完全多巴胺激动剂一样有效。
[0031]
d3部分激动剂/d2拮抗剂的活性非常出乎意料，因为到目前为止，对rls的活性大概是仅通过优先完全刺激d3受体来实现的：
[0032]-抑制性d3受体在脊髓(背角)的感觉处理区域中占高度优势，这些区域是rls患者睡眠期间发生的肢体不自主运动所涉及的感觉处理的通道；
[0033]-非选择性多巴胺激动剂用作d3受体激动剂的浓度低于针对d2受体的浓度，并且与治疗帕金森病的剂量相比，在相对较低的剂量下对rls也有效(在帕金森病中，大概是通过刺激d2受体)；
[0034]-d3-受体基因敲除的动物表现出rls的一些症状。
[0035]
因此，根据这些观察结果，只能预期对rls的活性取决于对d3受体的亲和力，以及d3完全激动剂会比d3部分激动剂具有更高的活性。更重要的是，部分激动剂也可以作为拮抗剂，因此不利于它们对rls的活性。
[0036]
因此，bp1.4979的活性完全是出乎意料的。
[0037]
类似地，pd、ad和hd都是需要针对d3受体具有持续活性的慢性疾病。
[0038]
正如上面所报道的，d3受体完全激动剂促进自噬机制，导致有毒蛋白如帕金蛋白、亨廷顿蛋白或β-淀粉样蛋白的聚集减少，这种作用被d3受体拮抗剂阻断。由于部分d3激动剂所能提供的最大效果的活性远低于完全激动剂，因此很难预测到部分激动剂如bp1.4979在这些病症中的功效与完全激动剂相似。
[0039]
有利的是，bp1.4979作为一种部分激动剂，比完全激动剂相比不易引起受体脱敏。
[0040]
特发性震颤是一种以不自主的节律性收缩和放松为特征的医学病症。它要么是一种动作性(意向性)震颤——当一个人试图在随意运动(例如吃饭和写字)中使用受影响的肌肉时，它会加剧；——要么是一种姿势性震颤，表现为持续的肌肉紧张。这意味着它不同于静止性震颤，比如由与运动无关的帕金森病引起的。
[0041]
暴食症(bed)已作为一种新的疾病被引入dsm-v(美国精神病学协会(2013)。feeding and eating disorders。在diagnostic and statistical manual of mental disorders(5th ed.)中)。bed的特征是在缺乏规律的代偿行为(如呕吐或滥用泻药)的情况下反复发作暴饮暴食。相关的特征包括吃到不舒服的饱、在身体不饿的时候吃、独自吃以及沮丧或内疚的感觉。bed与包括抑郁和人格障碍在内的精神病理学增加有关。
[0042]
目前的药物治疗是使用利地美(lisdexamfetamine)来进行的，它通过释放中枢神经系统中的多巴胺来发挥作用。因此，它的作用方式就像多巴胺能的完全激动剂。
[0043]
如本文所用：
[0044]“拮抗剂”是指能与受体结合但不能激活所述受体生理反应的配体。
[0045]“激动剂”定义了一种配体，它能与受体结合并触发所述受体的生理反应。
[0046]
术语“完全激动剂”指的是一种激动剂，它结合并激活受体，使受体产生激动剂能在受体上引起的最大反应。
[0047]
术语“部分激动剂”指一种激动剂，它也结合并激活给定的受体，但相对于完全激动剂，即使在最大的受体占用率下，它对该受体只有部分功效。
[0048]
激动剂的效力定义了引起所需反应的所述激动剂的量：它与半最大有效浓度(ec50)成反比，即在特定的暴露时间后，诱导反应介于基线和最大值中间的所述激动剂的浓度。
[0049]
典型地，相对于针对所述d3受体的参照完全激动剂，d3完全激动剂引发100％的功效(或内在活性)。
[0050]
典型地，相对于针对d3受体的参照完全激动剂，根据本发明的部分激动剂产生的功效(或内在活性)低于100％，通常在10％和90％之间，特别是在20％和80％之间。
[0051]
针对d3受体的参照完全激动剂一般选自内源性激动剂，如多巴胺。它也可以在已知的参照完全激动剂中选择，如喹洛雷(quinelorane)或7-ohdpat。
[0052]
化合物对受体的内在活性可以通过体外试验来测量，例如有丝分裂(chio等人，mol.pharmacol，45:51-60，1994)、基因报告分析(fitzgeral等人，anal.biochem.275:54-61，1999)，或钙通量(moreland等人，biochem.pharmacol.68:761-772，2004)。
[0053]“配体”是指化合物与多巴胺能的d2和/或d3受体结合形成配合物的能力。
[0054]
术语“亲和力”说明了配体(化合物)和受体之间的分子间驱动力。特别是，高亲和力的配体结合意味着相对低浓度的配体足以最大限度地占据d2和/或d3受体的配体结合位点，而低亲和力的结合意味着需要相对高浓度的配体，才能最大程度地占据结合位点。
[0055]
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐而被修饰。药学上可接受的盐包括母体化合物常规的无毒盐或季铵盐，它们例如由无毒无机或有机酸形成。例如，这种传统的无毒盐包括那些衍生自无机酸的盐，这些无机酸例如为盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸等有机酸制备的盐。进一步的加成盐包括铵盐，如氨丁三醇、葡甲胺、n-羟乙基吡咯烷(epolamine)等，和金属(如钠、钾、钙、锌或镁)盐。优选盐酸盐和草酸盐。
[0056]
本发明的药学上可接受的盐可以由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当的碱或酸，在水中或有机溶剂中或在两者的混合物中，反应来制备。通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表见remington's pharmaceutical sciences，17
th ed.，mack publishing company，easton，pa，1985年，第1418页，其公开内容通过引用并入于此。
[0057]
化合物对rls的活性可以通过其在相关动物模型中的功效来预测。ondo wg等人
(movement disorders，2000，15，154-158)和clemens等人(j.neurosci.2004，24，11337-11345)描述了针对rls进行预测的动物模型。
[0058]
特别地，本发明提供了一种预测针对rls活性的体内检测，例如在啮齿类动物中。本发明公开了一种用于预测测试化合物对rls的活性的方法，包括在大鼠单突触脊髓反射的电生理模型中运行所述化合物。
[0059]
更具体地说，本发明公开了一种用于识别治疗rls的候选药物的体内筛选方法，所述方法包括进行体内试验，包括：
[0060]-用测试化合物和参照化合物在啮齿类动物中运行单突触脊髓反射的电生理模型；
[0061]-在所述测试中，在给定浓度下，对测试化合物的测量响应与参照化合物的测量响应进行比较；
[0062]-如果所述测试化合物的活性高于所述测试化合物，则选择所述测试化合物。
[0063]
根据一种实施方式，该模型包括：
[0064]-刺激敏感根并记录运动根中由此产生的动作电位；
[0065]-在背角中应用参照化合物或测试化合物
[0066]-用参照化合物和测试化合物评估对单突触反射的抑制。
[0067]
根据一种实施方式，测量的响应是对突触传递的抑制。
[0068]
更具体地说，该测试中测量的响应反映了下丘脑-背脊髓多巴胺能的神经元下行通路的抑制性调制输入，该通路在rls中出现缺陷，导致在该疾病中反射夸大。
[0069]
根据一种实施方式，参照化合物是完全多巴胺d2/d3受体激动剂，例如多巴胺或普拉克索(目前用于rls)，或7-ohdpat，一种d3受体完全激动剂。
[0070]
根据一个实施方式，所述测试化合物是d3部分激动剂。
[0071]
在一项双盲对照安慰剂临床试验中，bp1.4979(部分d3激动剂)抗rls的活性与罗替戈汀(混合的d2和d3完全激动剂)的活性相当。在这项临床试验中，没有发现与目前的治疗相关的常见副作用(恶心和呕吐)。
[0072]
根据另一目的，本发明涉及一种在有需要的患者中治疗和/或预防rls的方法，包括向所述患者给药如上所述的d3部分激动剂。
[0073]
bp1.4979(部分d3激动剂)对抗暴食症的活性已使用这种疾病的啮齿动物模型被证明，即大鼠的蔗糖暴食。
[0074]
bp1.4979(部分d3激动剂)对抗与暴食症相关的过度食物消耗的活性已经在与戒烟相关的临床试验中进行了测量。戒烟过程中，接受bp1.4979的吸烟者志愿者比接受安慰剂的吸烟者体重增加更少。这是剂量相关的，表明上述效果与化合物有关。
[0075]
根据另一目的，本发明涉及一种在有需要的患者中治疗和/或预防暴食症的方法，包括向所述患者给药如上所述的d3部分激动剂。
[0076]
根据另一目的，本发明还涉及一种在有需要的患者中治疗和/或预防如上文所定义的中枢神经系统(cns)疾病的方法，包括向所述患者给药如上所述的d3部分激动剂。
[0077]
需要治疗本文描述的疾病和病症的那些受试者的识别完全在本领域技术人员的能力和知识范围内。本领域熟练的临床医生可以通过使用临床测试、体格检查、基因测试和医疗/家族史来容易地识别需要这种治疗的受试者。
[0078]
根据一种实施方式，bp1.4979的推荐剂量可包含在10至100mg之间，优选为10至15mg，每日两次(bis in die)。然而，bp1.4979的替代治疗有效量可以由主治诊断医生作为本领域技术人员，通过使用常规技术和通过观察在类似情况下获得的结果而容易地确定。在确定治疗有效量时，主治诊断医生考虑许多因素，包括但不限于：受试者的种族；其体重、年龄和一般健康状况；所涉及的具体疾病；病情的程度或疾病的严重程度；个体受试者的响应；给药的特定化合物；给药模式；给药制剂的生物利用度特性；选择的剂量方案；配合用药的使用；以及其他有关情形。实现所需生物效果所需的bp1.4979的量将根据许多因素而变化，包括待给药的药物的剂量、所用化合物的化学特性(例如疏水性)、化合物的效力、疾病类型、患者的患病状态和给药途径。
[0079]“药学上”或“药学上可接受”是指当适当地对动物或人给药时不会产生不利、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。
[0080]
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域是众所周知的。除了与活性成分不相容的任何常规介质或药剂之外，其在治疗组合物中的用途也在考虑之列。还可以将补充活性成分掺入组合物中。
[0081]
在本发明的上下文中，本文使用的术语“治疗(treating或treatment)”是指逆转、缓解、抑制该术语所应用于的疾病或病症的进程，或这种疾病或病症的一种或多种症状的进程，或预防该术语所应用于的疾病或病症，或这种疾病或病症的一种或多种症状。
[0082]“治疗有效量”是指有效产生所需治疗效果的本发明化合物/药物的量。
[0083]
根据本发明，术语“患者”或“有需要的患者”是指患有或可能患有神经心理疾病的人类或非人类哺乳动物。优选地，患者是人类。
[0084]
一般而言，本发明的化合物可以在含有0.1-10％w/v化合物的生理缓冲水溶液中提供，用于肠胃外给药。典型的剂量范围是每天1μg/kg体重至0.1g/kg体重；优选的剂量范围是每天0.01mg/kg体重至10mg/kg体重。成人的优选日剂量包括5、50、100和200mg，儿童的剂量与此相当。待给药的药物的优选剂量可能取决于诸如疾病或障碍的进展类型和程度、特定患者的总体健康状况、所选化合物的相对生物学功效、复合赋形剂的配方及其给药途径等变量。
[0085]
本发明的化合物能够以单位剂量形式给药，其中术语“单位剂量”是指能够给药至患者的单剂量，并且可以容易地处理和包装，保持为物理和化学稳定的单位剂量，包含活性化合物本身，或者作为药学上可接受的组合物，如下文所述。因此，典型的每日剂量范围为0.01至10mg/kg体重。作为一般指南，人类的单位剂量范围为每天1mg至100mg。优选地，单位剂量范围为1至500mg，每天给药1至4次，甚至更优选地，单位剂量范围为10至300mg，每天给药2次。本文提供的化合物可以通过与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合而配制成药物组合物。这些组合物可以制备用于口服给药，特别是片剂或胶囊形式；或肠胃外给药，特别是以液体溶液、悬浮液或乳剂的形式；或鼻内给药，特别是以散剂、滴鼻剂或气雾剂的形式；或者经皮给药，例如局部给药或经由透皮贴剂给药。
[0086]
所述组合物可以方便地以单位剂型给药，并且可以通过药学领域中公知的任何方法制备，例如，如remington:the science and practice of pharmacy，20
th
ed.；gennaro,
a.r.，ed.；lippincott williams&wilkins:philadelphia，pa，2000中所述。药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分。口服组合物通常包括惰性稀释剂载体或可食用载体。
[0087]
片剂、丸剂、散剂、胶囊、锭剂等可以含有一种或多种以下成分或类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素或黄蓍胶；稀释剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊的形式，其通常由任选地与增塑剂混合的明胶混合物以及淀粉胶囊制成。此外，单位剂量形式可以包含改变单位剂量的物理形式的各种其他材料，例如糖、虫胶或肠溶剂的包衣。其他口服剂型糖浆或酏剂可以含有甜味剂、防腐剂、染料、色素和调味剂。此外，可以将活性化合物掺入快速溶解、调节释放或持续释放的制剂和配方中，并且这些持续释放的配方优选是双峰的。
[0088]
优选的配方包括药物组合物，其中本发明的化合物被配制成口服或肠胃外给药，或更优选地，其中本发明的化合物被配制成片剂。优选的片剂含有乳糖、玉米淀粉、硅酸镁、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、硬脂酸镁或滑石的任意组合。本发明的化合物可以掺入食品或液体中也是本发明的一个方面。
[0089]
用于给药的液体制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。液体组合物还可以包括粘合剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。非水溶剂包括醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括醇和水的混合物、缓冲介质和盐水。特别地，生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是控制活性化合物释放的有用赋形剂。静脉注射的载体可以包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂等。这些活性化合物的其他潜在有用的胃肠外递送系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。
[0090]
替代的给药方式包括吸入制剂，包括干粉、气雾剂或滴剂。它们可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐和脱氧胆酸盐的水性溶液，或者以滴鼻剂的形式给药的油性溶液，或者作为用于鼻内施用的凝胶。用于口腔给药的配方包括例如糖锭剂(lozenge)或软锭剂(pastille)，并且还可以包括调味基料，例如蔗糖或阿拉伯胶，以及其他赋形剂，例如甘胆酸盐。适合直肠给药的配方优选地以单位剂量栓剂形式呈现，具有固体基载体，例如可可脂，并且可以包括水杨酸盐。用于皮肤局部施用的配方优选地采用软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油的形式。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇或它们的组合。适用于透皮给药的配方可以呈现为离散的贴剂，并且可以是亲脂性乳液或缓冲的水性溶液，溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中。
附图说明
[0091]
图1示出了bp1.4979(30nm)对背根的阈上刺激(40v，50μs)所引起的腹根的响应幅度的影响，示出了对照和bp1.4979灌注条件下的动作电位，平均每个记录15次。
[0092]
图2示出了bp1.4979(30nm)对背根的阈上刺激(40v，50μs)所引起的腹根的响应幅度的影响，示出了峰值响应幅度随时间的变化。
具体实施方式
[0093]
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明：
[0094]
实施例
[0095]
在以下系统上评估了bp1.4979和三种目前使用的多巴胺激动剂对人多巴胺d2和d3受体的功效。
[0096]
d3受体激活的有丝分裂试验
[0097]
将稳定表达人多巴胺d3受体的中国仓鼠卵巢(cho)细胞铺在96孔板中过夜。然后用无血清培养基洗涤细胞，并与不同浓度的配体一起孵育20小时。加入氚化胸苷，脉冲4小时。然后，用胰蛋白酶/edta分离细胞，转移到gf/c多筛微孔板中，用冰冷的pbs和乙醇冲洗并干燥。[3h]-胸苷掺入量在微贝塔计数器中用液体闪烁法测定。
[0098]
结果表示为用完全激动剂喹洛雷产生的最大[3h]-胸苷掺入量的百分比。
[0099]
在该测试中，bp1.4979表现为部分激动剂(内在活性为30％，ec50为0.7nm)，而普拉克索和罗匹尼罗是完全激动剂，ec50分别为0.6和0.7nm。
[0100]
对d3多巴胺受体的gtpγ
35
s结合试验
[0101]
将来自稳定表达人d3受体的cho细胞的解冻膜，以5μg/180μl/孔的最终浓度稀释在含有hepes 50mm，mgcl
2 3mm，nacl 140mm，gdp 4m，ph＝7.4的结合缓冲液中，并分布在96孔聚苯乙烯微孔板中。gtpγ[
35
s]标记的配体(0.2-0.3nm)在室温下再加入30分钟。转移到millipore gf/c微孔板中后，过滤反应混合物，然后进行三次250μl洗涤，结束反应。在装有70μl闪烁液的微贝塔液体闪烁计数器中测量过滤器结合的放射性。
[0102]
在该测试中，bp1.4979显示出太弱的部分活性(《5％)，无法测量。这表明bp1.4979显然不是完全激动剂。完全激动剂普拉克索与多巴胺一样有效，多巴胺是gtpγ[
35
s]试验中的完全激动剂参照。
[0103]
此外，还比较了这些化合物对人多巴胺d2受体激活的功效。
[0104]
d2受体激活/抑制的钙通量试验
[0105]
表达人多巴胺d2短亚型的hek293细胞用于评估测试化合物的潜在激动剂特性。细胞加载了补充有磺吡酮的fluo-4-am溶液，然后铺在96孔板中，并引入到flex站中，用于钙瞬变后的荧光测量。
[0106]
响应计算为最大荧光计数减去最小荧光计数(f
最大-f
最小
)。结果以参照完全激动剂喹洛雷引起的最大响应的百分比给出。
[0107]
在该测试中，普拉克索、罗替戈汀和罗匹尼罗表现为完全激动剂，ec50值分别为5.4、0.3和20nm。相比之下，bp1.4979在高达1000nm的浓度下不能激活受体，甚至能够完全阻断多巴胺或激动剂的作用。
[0108]
总之，bp1.4979明显不同于目前用于治疗rls的三种多巴胺配体：它们是有效的d3r和d2r完全激动剂，而bp1.4979是部分d3r激动剂，作为激动剂对d2r无活性。
[0109]
bp1.4979对rls大鼠模型的影响
[0110]
rls被认为反映了脊柱拉伸反射的异常敏感性。这些反射受到在背角中释放的多巴胺的抑制性调节，该多巴胺源于由下丘脑的a11多巴胺细胞产生的下行多巴胺能的投射。
[0111]
因此，研究bp1.4979在离体脊髓单突触响应中的作用是有意义的，这是一种拉伸反射的电生理模型，可以解释rls中隐含的机制的某些方面。分析了电生理响应，即刺激背
根后在大鼠幼仔离体脊髓腹根上记录的运动动作电位。
[0112]
使用阈值刺激强度(40v，50μs)，在3种浓度(30、100和300nm)下测试bp1.4979，并记录响应。
[0113]
结果如图1和图2所示。在30nm浓度下，bp1.4979完全抑制这些纤维的突触传递，即达到与多巴胺或完全多巴胺d2/d3受体激动剂(如普拉克索和7-ohdpat)相同的程度。
[0114]
多巴胺、普拉克索和7-ohdpat导致单突触反射的完全或几乎完全抑制。令人惊讶的是，应用纳摩尔浓度的bp1.4979代替多巴胺或完全多巴胺激动剂引起与后者相同幅度的抑制。
[0115]
在另一系列实验中，bp1.4979剂量依赖性地抑制在背根的阈上刺激后在脊髓的腹根上测量的突触后响应的幅度，并且该作用在多巴胺d3拮抗剂bp1.4096(wo 2007/148208实施例107)的存在下被阻止，该拮抗剂本身没有作用。
[0116]
总之，尽管它是一种部分d3受体激动剂和d2受体拮抗剂，这使其有别于通常用于rls的药物，但bp1.4979出人意料地在该疾病的模型中表现出完全活性。
[0117]
临床研究：bp1.4979对不安腿综合征的疗效(随机、双盲平行组序列、安慰剂对照、临床试验)
[0118]
双盲试验对29名患者进行。bp1.4979以每天两次15mg的剂量给药，持续两周，并与安慰剂的效果进行比较。
[0119]
使用plms指数(每小时睡眠周期性肢体运动的发作次数)证明与安慰剂相比，bp1.4979在rls患者中显示出显著的疗效。
[0120]
在bp1.4979治疗后，周期性肢体运动指数显著降低。
[0121]
这与罗替戈汀进行了比较，罗替戈汀是一种用于治疗rls的现有参照化合物(bogan等人，clinical therapeutics/第36卷，第3期，2014)。
[0122]
wu等人(2018)，plos one 13(4):e0195473报道了用罗替戈汀的plms指数。
[0123]
结果表明用bp1.4979获得的值(plms指数降低)与wu等人在罗替戈汀组中报道的值相似。
[0124]
这是非常令人惊讶的，因为它表明bp1.4979在rls病理学中与d3r和d2r完全激动剂一样有效。
[0125]
此外，没有患者报告任何与恶心相关的症状，也没有呕吐发作。通常在用普拉克索、罗匹尼罗和罗替戈汀时观察到的这些副作用不存在，这显著改善了用bp1.4979治疗rls的获益/风险比。
[0126]
总之，临床研究证实了d3r部分激动剂对rls的意义。
[0127]
bp1.4979在暴食症啮齿动物模型中的活性
[0128]
每天给予雌性sprague-dawley大鼠(225-250g)12小时获取10％蔗糖水溶液和实验室食物，随后剥夺12小时(即每天间歇性供给蔗糖和食物)，持续三周或更长时间。对照动物随意获取蔗糖溶液和实验室食物。在这样的给食方案之后，间歇性饮食的这些大鼠发展为暴食行为，并在几个维度上进入类似于药物依赖的状态：每日蔗糖摄入量的增加、孤僻行为、饮食冲动，和交叉致敏(n.m.avena，p.rada和b.g.hoebel，“evidence for sugar addiction:behavioral and neurochemical effects of intermittent，excessive sugar intake”，neurosci biobehav rev.2008；32(1)：20-39)。在实验当天，在重新引入蔗
糖和食物前30分钟，大鼠腹腔注射0.3和1mg/kg的bp1.4979或载媒(每组n＝8)，随后测量蔗糖和食物的消耗量。
[0129]
接受bp1.4979的志愿者在戒烟期间体重没有增加
[0130]
在一项双盲临床试验中，健康的吸烟者必须在每天一次接受安慰剂(n＝55)或bp1.4979 3mg(n＝52)、10mg(n＝53)或15mg(n＝58)的同时戒烟。
[0131]
12周后，接受安慰剂的志愿者体重增加1.0kg，而接受bp1.4979的志愿者，体重增加很少：对3mg(相应的10mg)组，体重增加0.9kg(相应的0.5kg)；或者体重不增加(0.0kg，对15mg组)。
[0132]
治疗结束后12周，观察到类似的趋势。与治疗前的体重相比，接受安慰剂的志愿者增加了2.3kg，而接受bp1.4979的志愿者，在接受3mg、10mg和15mg的组中，分别经历了2.0kg、1.4kg和0.2kg的较低体重增加。