重症药疹的蛋白质诊断生物标记物的制作方法

j pathol.2012apr；180(4):1653-62.
13.非专利文献5：田丸淳一.cd30.modern media 61卷11号2015,临床检测进展、323,11-14
14.专利文献
15.专利文献1：日本特开2012-39970公报


技术实现要素：

16.发明要解决的问题
17.本发明的目的在于提供：辅助以高精度诊断史-约综合征/中毒性表皮坏死松解症(sjs/ten)、药物超敏反应综合征(dihs)的方法、客观地评价它们的治疗有效性的方法、以及辅助鉴别不会重症化的可治愈的轻症药疹病例与会重症化的病例的方法。
18.用于解决问题的方案
19.由基于somascan法的重症药疹患者的血浆蛋白质组测定结果，探索了被认为对诊断史-约综合征/中毒性表皮坏死松解症(sjs/ten)、药物超敏反应综合征(dihs)的重症化或病情变化有用的生物标记物蛋白质。基于1310种蛋白质的测定值，探索在这些重症药疹的急性期示出显著变动的蛋白质，除了已经报道的tarc(趋化因子ccl17)、颗粒溶素(gnly)之外，鉴定了分层蛋白(sfn,14-3-3 protein sigma)、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)这4种蛋白质。利用elisa法进行了验证，结果dihs的病情诊断能力(急性期与恢复期的识别)、重症化判别能力(与轻症药疹的鉴别)最高的蛋白质为cd30，示出比已经报道的颗粒溶素、tarc更优异的结果。另外，在sjs/ten的病情诊断、重症化诊断中，sfn示出最优异的生物标记物性能。另外，通过组合这些蛋白质，从而能够提高dihs、sjs/ten的阳性率、或能够良好地区分开治疗方针不同的sjs/ten与dihs，特别是使用sfn/tarc比的情况对于sjs/ten的特异性诊断(与dihs的鉴别诊断)是有用的。
20.本发明是基于这些见解而完成的。本发明的主旨如下所述。
21.(1)一种重症药疹的检测方法，其包括如下步骤：对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达。
22.(2)根据(1)所述的方法，其还包括如下步骤：对于选自由颗粒溶素(gnly)和cc基序趋化因子17(tarc/ccl17)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达。
23.(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，测定表达的蛋白质为选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定值辅助重症药疹的重症化诊断。
24.(4)根据(1)或(2)所述的方法，其中，测定表达的蛋白质为选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定值辅助重症药疹的病情诊断。
25.(5)根据(1)或(2)所述的方法，其中，测定表达的蛋白质为分层蛋白，测定值辅助药物超敏反应综合征和/或史-约综合征/中毒性表皮坏死松解症的诊断。
26.(6)根据(1)或(2)所述的方法，其中，测定表达的蛋白质为tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)，测定值辅助药物超敏反应综合征和/或史-约综合征/中毒性表皮坏死松解症的诊断。
27.(7)根据(1)或(2)所述的方法，其中，测定表达的蛋白质为选自由分层蛋白与cc基序趋化因子17(tarc/ccl17)的组合及分层蛋白与tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)的组合组成的组中的至少1组蛋白质的组合，测定值辅助药物超敏反应综合征或史-约综合征/中毒性表皮坏死松解症的特异性诊断。
28.(8)一种重症药疹的诊断方法，其包括如下步骤：
29.a3.由被检者得到试样；
30.b3.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；以及
31.c3.基于b3的测定值，判断药疹的重症度。
32.(9)一种重症药疹的诊断方法，其包括如下步骤：
33.a2.由被检者得到试样；
34.b2.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；以及
35.c2.基于b2的测定值，判断重症药疹的病情。
36.(10)一种重症药疹的诊断方法，其包括如下步骤：
37.a4.由被检者得到试样；
38.b4.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；以及
39.c4.基于b4的测定值，判断重症药疹的疾病类型。
40.(11)一种重症药疹的诊断和治疗方法，其包括如下步骤：
41.a3.由被检者得到试样；
42.b3.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；
43.c3.基于b3的测定值，判断药疹的重症度；以及
44.d3.中止被判定为要发生或已发生重症药疹的可能性高的被检者正在服用的可疑药的服用，根据药疹的重症度，开始进行适合的治疗。
45.(12)一种重症药疹的诊断和治疗方法，其包括如下步骤：
46.a2.由被检者得到试样；
47.b2.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；
48.c2.基于b2的测定值，判断重症药疹的病情；以及
49.d2.中止被判定为处于重症药疹的急性期的可能性高的被检者正在服用的可疑药的服用，开始进行适合的治疗。
50.(13)一种重症药疹的诊断和治疗方法，其包括如下步骤：
51.a4.由被检者得到试样；
52.b4.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；
53.c4.基于b4的测定值，判断重症药疹的疾病类型；以及
54.d4.中止进行了重症药疹的疾病类型的判定的被检者正在服用的可疑药的服用，根据重症药疹的疾病类型，开始进行适合的治疗。
55.(14)一种用于检测重症药疹的试剂盒，其包含试剂，所述试剂对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，能够测定在被检者来源的试样中的表达。
56.发明的效果
57.对于重症药疹而言，尽可能早期开始进行治疗最为重要。本发明人等所发现的蛋白质成为用于鉴别dihs、sjs/ten与轻症患者的新的血中标记物(重症化判别标记物)，进而成为对dihs、sjs/ten患者是否进入恢复期等病情的诊断有用的标记物(病情诊断标记物)。另外，成为对判定患者的疾病类型是dihs还是sjs/ten有用的标记物(疾病类型判定标记物)。特别是，分层蛋白、cd30示出比现有的作为标记物候补的tarc、颗粒溶素更高的精度，进而，通过与现有的tarc、颗粒溶素等组合来进行测定，从而能够实现dihs、sjs/ten患者的早期检测、特异性诊断。
58.本说明书包括作为本技术的优先权基础的日本专利申请-特愿2020-73955的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
59.图1是探索中进行的somascan的测定结果和基于elisa的验证结果。disc是指探索组(discovery-set，探索用待检体组)、vali是指验证组(validation-set，验证用待检体组)。hc：健康、mild：轻症药疹、dihs：dihs急性期、sjs/ten：sjs/ten急性期、其它：其它重症药疹(急性泛发性发疹性脓疱病和多形红斑重症型)的急性期、all-r：恢复期。
60.图2是健康人、轻症药疹、重症药疹、和各种皮肤疾病中的各生物标记物的血中浓度的分布。示出联合组的测定结果。hc：健康、mild：轻症药疹、dihs：dihs急性期、sjs/ten：sjs/ten急性期agep：急性泛发性发疹性脓疱病急性期、em-major：多形红斑重症型急性期、all-r：恢复期组、特应性皮炎：特应性皮炎、银屑病：银屑病、自身免疫：自身免疫性疱症、感染：感染性皮肤疾病。
具体实施方式
61.以下对本发明的实施方式进行详细说明。
62.本发明提供一种重症药疹的检测方法，其包括如下步骤：对于选自由分层蛋白、
1淋巴瘤的标记物进行了细胞性免疫检测。报道了：可溶性cd30通过cd30l的结合被切断并被释放，在氧化应激状态下上升。uniprot编号为p28098。
70.白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)是il1rn基因编码的159个氨基酸的细胞外分泌蛋白。与受体il-1r1结合，抑制白细胞介素-1α、-1β的活化。观察到在骨髄和免疫系统的细胞、消化道的细胞中高表达。已知：在皮肤组织中参与调节皮肤老化。uniprot编号为p18510。
71.对于tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)，正式名称注册为tnf受体超家族成员6b，是基因tnfrsf6编码的245个氨基酸的蛋白质，已知是属于tnf受体家族的诱饵受体。具有通过作为诱饵受体(decoy receptor)与fas配体结合而抑制fas诱导性的凋亡信号的作用。已知在类风湿性关节炎患者中，血中dcr3上升。uniprot编号为o95407。
72.分层蛋白、cd30、il-1ra、和dcr3/tnfrsf6b作为重症药疹的生物标记物是新型的，且是有用的。
73.本发明的方法中，优选：测定表达的蛋白质为分层蛋白，测定值辅助药物超敏反应综合征(dihs)和/或史-约综合征/中毒性表皮坏死松解症(sjs/ten)的诊断。诊断包括病情诊断、重症化诊断、疾病类型的特异性诊断等。
74.或者，本发明的方法中，优选：测定表达的蛋白质为cd30，测定值辅助dihs和/或sjs/ten的诊断。诊断包括病情诊断、重症化诊断、疾病类型的特异性诊断等。
75.本发明的方法中，进而，可以对于颗粒溶素(gnly)、tarc等作为重症药疹的血液中蛋白标记物而已知者，测定被检者来源的试样中的表达。通过组合这些新型的标记物彼此或新型的标记物和已知的标记物，可以提高重症药疹的阳性率，可以提高特异性。
76.本发明中，被检者是怀疑发生重症药疹的哺乳动物，但也可以将认为有发病危险性的所有哺乳动物作为对象。典型的是人。作为被检者来源的试样，可以示例出由被检者获得的细胞、组织、体液等、具体而言被检者的血液(例如，全血、血清、血浆、血浆交换外液等)、支气管肺泡清洗液等。可以使用通常的血液检测(临床检测)中得到的全血、血清或者血浆作为血液样品。
77.本发明的方法中，被检者来源的试样中的表达的测定对试样中的上述蛋白质或其片段的存在量进行测定即可。作为测定的手段，可以没有特别限定地使用公知的方法。优选以蛋白质水平测定，但也可以以核酸水平测定。
78.为了以蛋白质水平测定上述蛋白质的表达，可以使用特异性识别上述蛋白质的抗体。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体中的任意者。这些抗体可以利用公知的方法制造，另外也可以使用市售者。作为典型的方法，可列举出elisa法、免疫色谱法等免疫测定法。免疫测定法无需特殊的装置、技术，能够简便迅速地对靶蛋白进行检测、定量，因此本发明中也优选用于上述蛋白质的测定。上述蛋白质的抗体是公知的，也存在市售品。另外，如上所述，上述蛋白质的氨基酸序列和编码这些的碱基序列也是公知的，因此通过制作通常的杂交瘤，从而也可以制作针对各蛋白质的特异性抗体。
79.免疫测定法本身在本领域是公知的。根据反应形式，有夹心法、竞争法、凝集法、免疫印迹法等，另外，基于标记，有酶免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析等。本发明中，可以使用能进行定量检测的免疫测定法中的任意种。没有特别限定，例如，可以优选使用夹心elisa等夹心法。夹心法中，将与靶蛋白结合的抗体固相化，使其与试样反应。与固相化抗体结合的靶蛋白使用用酶等标记的检测抗体进行测定。检测抗体优选使用
以与固相化抗体不同的部位结合于靶蛋白的抗体。固相化抗体和检测抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，也可以使用该抗体的抗原结合性片段。使与固相化抗体结合的靶蛋白跟检测抗体反应，进行清洗后，通过来自抗体上标记的物质的信号测定所结合的检测抗体的量。例如，使用用碱性磷酸酶标记的抗体作为检测抗体时，将该酶的底物添加至反应体系内，用应对由酶反应产生的显色、荧光、发光的量的装置进行测定即可。对于包含靶蛋白的浓度已知的标准试样，进行免疫测定，预先制作绘制了标记物质的信号与浓度的关系的标准曲线，对于靶蛋白的浓度未知的试样，也进行相同的操作，通过将得到的信号测定值代入该标准曲线，从而能够对试样中的靶蛋白进行定量。
80.为了以核酸水平测定上述蛋白质的表达，可以使用能够与上述蛋白质的mrna特异性杂交的核酸探针(利用rna印迹法测定的情况)。或者也可以使用能够对以上述蛋白质的mrna作为模板合成的cdna进行特异性扩增的至少1对核酸引物(利用rt-pcr法测定的情况)。核酸探针和核酸引物可以基于上述蛋白质的基因信息(上述)设计。关于核酸探针，通常为约15～1500碱基者是适合的。核酸探针可以用放射性元素、荧光色素、酶等进行标记。关于核酸引物，通常为约15～30碱基者是适合的。也可以用放射性元素、荧光色素、酶等标记核酸引物。
81.测定表达的蛋白质或基因可以为1种，也可以为多种。通过参照多种基因表达、多种蛋白表达数据，从而能够实现更准确的评价。为了同时检测多种基因表达、多种蛋白表达，也可以使用dna阵列(将探针固定于基板)(nature reviews,drug discovery,volume 1,december2002,951-960)、蛋白质芯片(将抗体固定于基板)(nature reviews,drug discovery,volume 1,september2002,683-695)、luminex(nature reviews,drug discovery,volume 1,june 2002,447-456)等检测法。
82.作为测定表达的蛋白质或基因的组合，可以示例出后述的实施例的表10中记载的组合、比(cd30 tarc,cd30 sfn,cd30 gnly,cd30 il-1ra,sfn/tarc比、sfn/cd30比)等，但不限定于这些。
83.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定被检者来源的试样中的表达，基于该表达水平，能够进行重症药疹的病情判别、重症化判别、疾病类型的鉴别。
84.因此，本发明的方法能够辅助重症药疹的诊断(病情诊断、重症化诊断、疾病类型的特异性诊断)。
85.作为本发明的一个例子，重症药疹的诊断可以基于以下那样的基准进行。测定从被检者采集的血浆中的上述蛋白质中的至少1种的表达，在得到比预先设定的截止值、基准值更高的值的情况，评价被检者已经发生重症药疹。该预先设定的截止值，本领域技术人员可以适宜设定。例如，可以以未发生重症药疹的健康者的定量值的95％置信区间作为基准值、或基于roc曲线设定截止值。或者与过去的测定值相比，在上述蛋白质中的至少一种出现上升倾向的情况下，怀疑有可能发生重症药疹。对于后述的实施例的表5～表8所示的各生物标记物候补的截止值，进行dihs或sjs/ten的急性期和对象组(总恢复期组、轻症组、或者各种皮肤疾病组)的roc曲线解析，参照youden index(灵敏度 特异性-100)进行设定。
86.本发明的方法可以用于重症药疹的重症化诊断。本说明书中，“重症化诊断”是指
对sjs/ten、dihs等重症药疹与散播型红色斑丘疹型皮疹、多形红斑等轻症药疹进行判别。对于选自由分层蛋白、cd30、il-1ra、和dcr3组成的组中的至少1种蛋白质，被检者来源的试样中的表达水平高的情况下，可以判定将来发生重症药疹或已经发生重症药疹的可能性高。
87.作为用于鉴别例如dihs、sjs/ten与轻症药疹的截止值，可以设定为分层蛋白：2～8ng/ml(优选3.7ng/ml)、dcr3：1.5～3ng/ml(优选2.6ng/ml)、il-1ra：1000～2000pg/ml(优选1600pg/ml)、cd30：50-150ng/ml(优选82ng/ml)等。
88.本发明提供一种重症药疹的诊断方法，其包括如下步骤：
89.a3.由被检者得到试样；
90.b3.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；以及
91.c3.基于b3的测定值，判断药疹的重症度。
92.另外，本发明的方法可以用于重症药疹的病情诊断。本说明书中，“病情诊断”是指sjs/ten、dihs等重症药疹的急性期和恢复期的识别。对于选自由分层蛋白、cd30、il-1ra、和dcr3组成的组中的至少1种蛋白质，被检者来源的试样中的表达水平高的情况下，可以判定为处于重症药疹的急性期的可能性高。
93.作为用于诊断例如dihs、sjs/ten的病情的截止值，可以设定为分层蛋白：1～3ng/ml(优选1.0ng/ml)、dcr3：0.3～2ng/ml(优选1.1ng/ml)、il-1ra：500～1500pg/ml(优选930pg/ml)、cd30：50-150ng/ml(100ng/ml)等。
94.本发明提供一种重症药疹的诊断方法，其包括如下步骤：
95.a2.由被检者得到试样；
96.b2.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；以及
97.c2.基于b2的测定值，判断重症药疹的病情。
98.sfn尤其对sjs/ten、cd30尤其对dihs的检测性能高。dcr3和il-1ra对其两者具有检测力。
99.进而另外，本发明的方法可以用于重症药疹的特异性诊断。本说明书中，“特异性诊断”是指重症药疹的疾病类型的鉴别。sjs/ten、dihs等重症药疹有时导致严重的后遗症、或导致死亡，因此能用于重症药疹的特异性诊断在临床上的意义很大。例如，被检者来源的试样中的分层蛋白的表达水平高的情况下，可以判定疾病类型为sjs/ten的可能性高。另外，被检者来源的试样中的cd30的表达水平高的情况下，可以判定疾病类型为dihs的可能性高。为了提高重症药疹的检测率，可以组合生物标记物，通过分层蛋白与tarc的组合，可以提高sjs/ten的鉴别性能。鉴别sjs/ten的情况，可以使用sfn/tarc比。另外，通过cd30与tarc的组合、cd30与分层蛋白的组合、cd30与颗粒溶素(gnly)的组合、cd30与il-1ra的组合，从而能够提高dihs的检测性能。
100.例如，作为用于特异性诊断sjs/ten的截止值，可以设定为分层蛋白：3～7ng/ml(优选4.3ng/ml)，作为用于特异性诊断dihs的截止值，可以设定为cd30：60～240ng/ml(优
选124ng/ml)、dcr3：1～3ng/ml(优选2.6ng/ml)、il-1ra：1000～4000pg/ml(优选2040pg/ml)等，为了提高dihs、sjs/ten的检测性能，也可以将各标记物以这些截止值组合而利用。另外，即使与已经报道的tarc(作为例子，截止值：5500pg/ml)、gnly(作为例子，截止值：10.7ng/ml)组合也能够提高dihs、sjs/ten的检测性能。作为用于提高sjs/ten的鉴别性能的sfn/tarc比的截止值，可以设定为4～7(优选5.6)。
101.本发明提供一种重症药疹的诊断方法，其包括如下步骤：
102.a4.由被检者得到试样；
103.b4.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；以及
104.c4.基于b4的测定值，判断重症药疹的疾病类型。
105.本发明的方法除了可以用于诊断重症药疹的病情之外，还可以用于预后的检测、治疗效果的确认。例如，对于选自由分层蛋白、cd30、il-1ra、和dcr3组成的组中的至少1种蛋白质，对判定为处于重症药疹的重症化急性期的可能性高的被检者来源的试样中的表达测定1次或在不同的时期测定多次，在表达水平降低至接近截止值或基准值的水平时，判定通过治疗由重症药疹得到恢复，前述水平高或未降低时，判定为通过治疗未由重症药疹恢复、或者恢复不充分。关于用于判定通过治疗而恢复的截止值，用于病情诊断的截止值是有效的。
106.在判定被检者要发生或已发生重症药疹的可能性高的情况下，中止可疑药的服用，根据患者的病情、疾病类型的各症状，开始进行适合的治疗。作为dihs的药物疗法，全身给予甾体(以强的松龙换算计，自0.5～1mg/kg/天开始，适宜地逐渐减少)是有效的，注意由hhv-6的再活化所致的症状的复发而减量。sjs/ten的情况，根据重症度推荐全身给予用量不同的甾体(以强的松龙换算计，中度症为0.5～1mg/kg/天、重病例为1～2mg/kg/天、最重病例为甲基强的松龙，自1g/天
×
3天开始，根据症状适宜逐渐减少)，此外，可列举出高用量人免疫球蛋白(ivig)静脉注射疗法(以400mg/kg/天连续给予5天、原则上仅为1个疗程)、血浆交换疗法、针对眼病变的眼表面炎症(倍他米松或者地塞米松的滴眼(1天4次左右))、抑制眼睑粘连进行眼表面上皮的温存、眼表面的感染症预防等。
107.在美国，重症药疹也是严重的副作用。关于sjs/ten，由国立卫生研究所(nih)出资设立的“遗传性和罕见病信息中心(the genetic and rare diseases information center,gard)”公布了症状、原因、治疗法、预后(https://rarediseases.info.nih.gov/diseases/7700/stevens-johnson-syndrometoxic-epidermal-necrolysis)。作为治疗，除了需要住院、和中止已给予的药品之外，有维持疗法、药物疗法。作为维持疗法，通常皮肤症状的治疗与重度烧伤的治疗同样，包括创伤护理、疼痛管理、体液和电解质、营养支持、体温管理、和二次感染的监测或治疗。另外，关于眼症状，有利用生理盐水的清洗。关于药物疗法，可列举出系统性皮质类固醇、静脉内免疫球蛋白(ivig)、环孢霉素、血浆交换、抗肿瘤坏死因子(tnf)单克隆抗体，但记载了并未通过随机试验进行充分研究。关于眼药物治疗，可列举出：利用不包含防腐剂的滴眼药或软膏的1天多次的润滑、包括局部皮质类固醇药和光谱抗生素的眼科药治疗。另外，在2018年发表的22所大学医院的调查中，作为针对377名sjs/ten患者的治疗，仅维持疗法的情况为29.3％，仅甾体的情况为30.0％，ivig疗法为
24.9％，甾体和ivig疗法这两者的治疗为14.3％(michaeletti rg et al.,j invest dermatol.,2018；138:2315-2321)。
108.关于dihs(又称drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms、dress，药物反应伴嗜酸性粒细胞增多和全身性症状)，gard中虽然记载了症状、临床研究，但没有记载治疗法(https://rarediseases.info.nih.gov/diseases/13629/drug-reaction-with-eosinophilia-and-systemic-symptoms)。在使用了波士顿的partners healthcare system公司的电子医疗信息的解析报告中，3,162,562例患者中，69例给予了dress，51例给予了皮质类固醇药。其中，35例使用局部甾体药，36例使用经口甾体药，26例使用静脉给予的甾体药(wolfson ar et al.,j allergy clin immunol pract.,2019；7:633-640)
109.本发明提供一种重症药疹的诊断和治疗方法，其包括如下步骤：
110.a3.由被检者得到试样；
111.b3.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；
112.c3.基于b3的测定值，判断药疹的重症度；以及
113.d3.中止被判定为要发生或已发生重症药疹的可能性高的被检者正在服用的可疑药的服用，根据药疹的重症度，开始进行适合的治疗。
114.另外，本发明提供一种重症药疹的诊断和治疗方法，其包括如下步骤：
115.a2.由被检者得到试样；
116.b2.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；
117.c2.基于b2的测定值，判断重症药疹的病情；以及
118.d2.中止被判定为处于重症药疹的急性期的可能性高的被检者正在服用的可疑药的服用，开始进行适合的治疗。
119.进而，本发明提供一种重症药疹的诊断和治疗方法，其包括如下步骤：
120.a4.由被检者得到试样；
121.b4.对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，测定在被检者来源的试样中的表达；
122.c4.基于b4的测定值，判断重症药疹的疾病类型；以及
123.d4.中止进行了重症药疹的疾病类型的判定的被检者正在服用的可疑药的服用，根据重症药疹的疾病类型，开始进行适合的治疗。
124.本发明还提供一种用于检测重症药疹的试剂盒，其包含试剂，所述试剂对于选自由分层蛋白、tnf受体超家族成员8(cd30/tnfrsf8)、白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)、和tnf受体超家族成员6b(dcr3/tnfrsf6b)组成的组中的至少1种蛋白质，能够测定在被检者来源的试样中的表达。
125.作为一个例子，本发明的试剂盒包含能够特异性识别上述蛋白质的抗体作为试
剂。抗体可以固定于微量滴定板、磁珠、纤维素膜、基板上。试剂盒可以进一步包含用于采集被检者来源的试样的器具、抗凝剂、一套用于检测上述蛋白质的试剂、操作说明书等。操作说明书中除了试剂盒的使用方法之外，也可以预先记载重症药疹的重症化急性期的评价和/或鉴别基准等。
126.作为另一例，本发明的试剂盒中包含能够与上述蛋白质的mrna特异性杂交的核酸探针作为试剂。核酸探针也可以固定于基板上。试剂盒中可以进一步包含用于采集生物体试样的器具、抗凝剂、用于从被检者来源的试样中提取rna的试剂类、用于检测rna的试剂类、操作说明书等。操作说明书中除了试剂盒的使用方法之外，也可以预先记载重症药疹的重症化急性期的评价和/或鉴别基准等。
127.作为再另一例，本发明的试剂盒中，作为试剂，包含能够对以上述蛋白质的mrna作为模板合成的cdna进行特异性扩增的至少1对核酸引物。试剂盒中还可以进一步包括用于采集被检者来源的试样的器具、抗凝剂、用于从被检者来源的试样中提取rna的试剂类、用于检测rna的试剂类、操作说明书等。操作说明书中除了试剂盒的使用方法之外，也可以预先记载重症药疹的重症化急性期的评价和/或鉴别基准等。
128.本发明的试剂盒中此外可以包含标准蛋白质、缓冲夜、底物(对抗体进行酶标记的情况)、反应终止液、清洗液、反应容器等。
129.本发明的试剂盒除了能诊断重症药疹之外，还可以诊断由支原体等感染症所致的sjs，可以作为用于诊断疾病的药品使用。
130.实施例
131.以下通过实施例对本发明进行进一步详细说明。
132.〔实施例1〕
133.(1)待检体
134.对于用于解析的重症药疹待检体，得到各定点医院、国立药品食品卫生研究所、木原财团、astellas pharma inc.、和第一三共的各研究伦理委员会的许可而收集。在横浜市立大学、岛根大学、市立岛田市民医院、磐田市立总合医院、奈良县立医科大学、新泻大学，针对怀疑发生轻症药疹(多形红斑、散播型红色斑丘疹型皮疹、湿疹型皮疹)的患者、和相关皮肤疾病患者进行采血。另外，也进行药疹以外的皮肤疾病(特应性皮炎、银屑病、自身免疫性疱症、感染性皮肤疾病(不包括麻疹、风疹、水痘))的患者的收集，将它们的血浆和血清冷冻保存在-80℃下。健康人待检体使用在noyes公司收集所得者。
135.将待检体的详细情况示于表1。将直至2017年11月为止收集的75个发病例待检体和12个健康人待检体用于基于somascan解析的探索和elisa试剂盒的验证(探索组、表1)。接下来，作为与探索组不同的独立的其它组试样，将2017年12月之后收集的待检体(163个发病例待检体、和探索中未使用的38个健康人待检体)用于生物标记物的验证(validation set，验证组)。进而，结合探索组和验证组这两组，还使用了加入相关疾病的联合组来进行生物标记物性能的评价。
136.表1.用于解析的待检体的详细情况
[0137][0138]
(2)生物标记物候补的探索
[0139]
通过使用了somalogic公司的somascan系统的蛋白质组解析，进行针对在临床上被认为是特别重要的重症药疹的疾病类型即sjs/ten和dihs的生物标记物探索。somascan系统是通过适体(基于单链核酸的人工配体)检测1,310种蛋白质的测定法。以冷冻状态将探索组的血浆待检体送至美国somalogic公司，供于somascan测定。
[0140]
基于1,310种蛋白质的somascan测定值，对dihs、sjs/ten的(1)能够判别病情的标记物候补(重症化急性期与恢复期的比较)、及(2)能够与轻症组加以识别的重症化相关标记物候补(重症化急性期与轻症组的比较)进行探索。将各探针的测定值(荧光信号强度)进行对数变换后，分为轻症药疹组(mild,n＝29)、dihs急性期组(dhis,n＝14)、sjs/ten急性期组(n＝9)、全部病例的恢复期组(all-r,n＝19)、健康人组(hc,n＝12)，dihs或sjs/ten的急性期组的任意者中，效果量hedge’s g值和/或平均值倍率(fold change：fc)进入前10位以内，进而在聚焦roc曲线解析中示出auc 0.85以上的值的蛋白质时，结果发现包含作为已经报道的重症药疹标记物而已知的tarc、颗粒溶素(gnly)，同时包含以往并不知晓作为重症药疹标记物有用的分层蛋白、cd30、dcr3，il-1ra。表2示出这些生物标记物候补、及之后的验证实验中使用的elisa测定系统。
[0141]
表2.生物标记物候补蛋白质及用于验证的elisa测定系统
[0142]
生物标记物候补uniprot idelisa试剂盒基质分层蛋白(sfn)p31947自制elisa血清cd30/tnfrsf8p28908invitrogen公司血清dcr3/tnfrsf6bo95407r&d公司duoset血浆il-1rap18510r&d公司quantikine血浆颗粒溶素(gnly)[已经报道]p22749自制elisa血清tarc/ccl17[已经报道]q92583sysmex公司，hiscl tarc血清
[0143]
(3)测定结果的比较
[0144]
图1是6种生物标记物候补的somascan和elisa的测定值的变动模式。somascan解析中，6种蛋白质与健康组、轻症药疹组相比，均观察到在重症药疹的各疾病类型中显著上升，在恢复期组中降低至接近健康组的水平。其结果，elisa中也得到同样的结果，探索组和验证组中的健康组的浓度范围、dihs、在sjs/ten病例的急性期的上升幅度、总恢复期组的浓度范围近似(图1)。
[0145]
(4)作为病情诊断、和重症化的诊断的有用性
[0146]
4-1)基于探索组的评价
[0147]
表3是将探索组中观察到的各候补蛋白质的dihs、sjs/ten的病情判别性能(重症化急性期与恢复期的鉴别)和重症化判别能力(重症药疹组与轻症组的鉴别性能)与由roc曲线解析计算出的auc值进行比较的结果。预测sfn、dcr3、il-1ra对dihs和sjs/ten这两者具有高鉴别性能，sfn尤其对sjs/ten显示出高检测性能。与这些相对地，cd30的dihs的检测性能高，其病情判别能力(auc 0.93)、重症化诊断性能(auc 0.87)比已经报道的tarc(auc 0.89和0.82)还高。
[0148]
表3.各生物标记物候补的与dihs和sjs/ten的病情判别和重症化判别能力相关的auc值的比较(探索组)
[0149][0150]
用粗体示出0.85以上的数值.
[0151]
4-2)基于验证组的验证
[0152]
表4是示出验证组的roc解析结果的结果。与探索组同样地，在验证组中，sfn尤其对sjs/ten示出高鉴别性能，cd30对dihs示出高鉴别性能，dcr3和il-1ra对其两者示出鉴别性能。若对dihs的病情判别能力和重症化诊断能力进行比较，则dcr3(auc 0.99和0.86)和cd30(auc 0.94和0.89)高于已经报道的tarc(auc 0.91和0.78)、gnly(auc 0.86和0.81)。在sjs/ten的病情判别能力方面，sfn(auc 0.92)示出最高的值。探索组中观察到的sfn的sjs/ten的重症化判别能力(auc 0.91，表3)在验证组中稍稍降低(auc 0.79)，在组合了探索组和验证组的联合组中，sfn最高(auc 0.84)，继而是il-1ra(auc 0.80)，也高于已经报道的gnly(auc 0.76)(表4)。
[0153]
表4.各生物标记物候补的与dihs和sjs/ten的病情判别和重症化判别能力相关的auc值的比较(验证组).
[0154][0155]
用粗体示出0.85以上的数值.
[0156]
4-3)基于联合组的评价结果
[0157]
4-3-1)疾病特异性
[0158]
图2是使用联合组的数据、对包括药疹在内的各种皮肤疾病中的各候补蛋白质的测定值的分布进行比较的结果。对于任意的候补蛋白质，在dihs和/或者sjs/ten中均观察到强烈的上升，特别是sfn示出sjs/ten特征性的上升，在包括dihs、em-major在内的其它疾病类型、或者自身免疫性疱症中仅中等程度地上升。另一方面，cd30与tarc同样地观察到dihs特异性的上升，在em-major的一部分中观察到轻度的上升，但在自身免疫性疱症中几乎没有上升。dcr3和gnly与sfn、cd30不同，在dihs、sjs/ten这两者中观察到上升倾向。
[0159]
4-3-2)dihs和sjs/ten的病情判别
[0160]
表5是联合组的数据的解析结果，示出各候补蛋白质的dihs和sjs/ten的病情判别性能。设定用于识别dihs和sjs/ten的急性期和总恢复期(all-r)的截止值，对灵敏度和特异性进行比较。在dihs的病情判别中，dcr3(auc 0.96)和cd30(auc 0.94)优异，dcr3将1.1ng/ml设为截止值的情况，cd30将100ng/ml设为截止值的情况，灵敏度80％以上且特异性90％以上，均能够将dihs的急性期与总恢复期组鉴别开。dcr3和sfn的sjs/ten的病情判别性能优异(两auc均为0.9以上)，dcr3使用0.55ng/ml作为截止值的情况，灵敏度90％以上且特异性85％以上，能够将sjs/ten的急性期与总恢复期鉴别开，sfn为截止值1.0ng/ml时，灵敏度和特异性均为80％以上，能够sjs/ten的急性期与总恢复期鉴别开。
[0161]
表5.用于判别dihs和sjs/ten的病情的截止值及其性能(联合组).
[0162][0163]
根据对dihs和sjs/ten的急性期与总恢复期(all-r)进行比较时的roc曲线解析的结果，将特异性80％以上且youden index成为最高的浓度设定为截止值。用粗体标记auc 0.85以上的数值。auc 0.7以下的识别性能低的蛋白质未对截止值进行评价。
[0164]
4-3-3)dihs和sjs/ten的重症化判别
[0165]
表6是联合组的数据的解析结果，示出各候补蛋白质的dihs和sjs/ten的重症化判
别性能。设定用于识别dihs和sjs/ten的急性期和轻症组(mild)的截止值，对灵敏度和特异性进行比较。dihs的重症化判别中，cd30(auc 0.88)最优异，高于已经报道的gnly(auc 0.85)、tarc(auc 0.79)。将cd30的截止值设为82ng/ml时，灵敏度和特异性分别为80％以上(表6)。另一方面，sjs/ten的重症化判别中，sfn最优异(auc 0.84)，截止值3.7ng/ml时，灵敏度为约70％、特异性为约90％，鉴别了sjs/ten的急性期与轻症组。
[0166]
表6.用于判别dihs和sjs/ten的重症化的截止值及其性能(联合组).
[0167][0168]
根据dihs和sjs/ten的急性期和轻症组进行比较时的roc曲线解析的结果，将特异性80％以上且youden index成为最高的浓度设定为截止值。用粗体标记出auc 0.8以上的80％以上的灵敏度、特异性的数值。auc 0.7以下的识别性能低的蛋白质未对截止值进行评价。
[0169]
4-3-4)重症药疹的疾病类型的特异性诊断
[0170]
重症药疹中，特别是sjs/ten和dihs为严重的疾病类型，由于它们的治疗方针不同，因此在早期诊断是sjs/ten还是dihs尤为重要。因此，对各蛋白质的从各种皮肤疾病中检测dihs的性能(dihs特异性诊断性能)、和特异性检测sjs/ten的性能(sjs/ten特异性诊断性能)进行比较。
[0171]
表7是：基于dihs与除此以外的皮肤疾病(包括轻症药疹、dihs以外的重症药疹、其它皮肤疾病)的比较、和sjs/ten与除此以外的皮肤疾病(包括轻症药疹、dihs以外的重症药疹、其它皮肤疾病)的比较，设定适于dihs和sjs/ten的特异性诊断的截止值，对灵敏度和特异性进行比较的结果。dihs的特异性诊断性能中，cd30最优异(auc 0.87)、截止值124ng/ml的情况，灵敏度和特异性均为80％左右，sjs/ten的特异性诊断性能中sfn最高(auc 0.79)，截止值4.3ng/ml的情况，灵敏度为60.9％、特异性为81.8％。
[0172]
表7.用于特异性诊断dihs和sjs/ten的截止值及其性能的比较
[0173][0174]
根据dihs与除此以外的皮肤疾病(包括轻症药疹、dihs以外的重症药疹、其它皮肤
疾病)、和sjs/ten与除此以外的皮肤疾病(包括轻症药疹、sjs/ten以外的重症药疹、其它皮肤疾病)进行比较时的roc曲线解析的结果，将特异性80％以上且youden index成为最高的浓度设定为截止值。用粗体标记出auc 0.8以上的80％以上的灵敏度、特异性的数值。auc 0.7以下的识别性能低的蛋白质未评价截止值。
[0175]
sfn虽然示出sjs/ten特异性，但特异性诊断的灵敏度为稍低的60.9％(表7)。因此着眼于在sjs/ten中上升低的cd30和tarc，对通过与这些进行组合而sjs/ten的特异性诊断性能是否提高进行了研究。sfn单独的sjs/ten特异性诊断性能为auc 0.79(表7)，若使用与tarc值的比(sfn/tarc比)，则auc的值提高至0.87。将sfn/tarc比5.6设为截止值的情况，灵敏度提高至70％以上，特异性提高至87％以上，可知能够以高精度识别sjs/ten与除此以外的皮肤疾病(表8)。
[0176]
表8.基于sfn与tarc的组合的sjs/ten的诊断性能的提高
[0177][0178]
根据sjs/ten与除此以外的皮肤疾病(包括轻症药疹、sjs/ten以外的重症药疹、其它皮肤疾病)进行比较时的roc曲线解析的结果，将特异性80％以上且youden index成为最高的浓度设定为截止值。
[0179]
4-3-5)各皮肤疾病中的阳性率的比较
[0180]
表9示出使用了表7中设定的截止值时的各疾病中的阳性率。sfn在sjs/ten中示出最高的阳性率(61％)，但在em-major(45％)、自身免疫性疱症(47％)中也存在阳性例。cd30是针对dihs的阳性率(79％)最高的候补蛋白质，而且与tarc不同，在自身免疫性疱症中没有阳性例。dcr3和gnly与sfn、cd30不同，在dihs和sjs/ten这两者中观察到高阳性率。
[0181]
表9.各种皮肤疾病中的各生物标记物候补的阳性率的比较。
[0182]
[0183]
sfn时使用用于特异性诊断sjs/ten的截止值、其它蛋白质时使用dihs特异性诊断的截止值(表7)计算出各阳性率。用粗体示出阳性率50％以上。hc：健康、mild：轻症药疹、dihs：dihs急性期、sjs/ten：sjs/ten急性期、agep：急性泛发性发疹性脓疱病、em-major：多形红斑重症型、特应性皮炎：特应性皮炎、银屑病：银屑病、自身免疫：自身免疫性疱症、感染：感染性皮肤疾病。
[0184]
表10是对组合了各生物标记物时的阳性率进行比较的结果。在各组合中，若将两者或任意一者示出截止值以上时判断为阳性，则将cd30与tarc的组合的情况，针对dihs的阳性率提高至90％以上，cd30与gnly、cd30与il-1ra的组合中观察到提高至85％以上。另外，针对sjs/ten的阳性率，在使用了sfn/tarc比的情况下最高(阳性率74％)。这些的结果示出组合使用该生物标记物候补蛋白质的有用性。
[0185]
表10.基于各生物标记物候补的组合的重症药疹的阳性率的提高。
[0186][0187]
sfn时使用用于特异性诊断sjs/ten的截止值进行评价，其它蛋白质时使用特异性诊断dihs的截止值进行评价。用粗体示出阳性率60％以上。hc：健康、mild：轻症药疹、dihs：dihs急性期、sjs/ten：sjs/ten急性期、agep：急性泛发性发疹性脓疱病、em-major：多形红斑重症型、特应性皮炎：特应性皮炎、银屑病：银屑病、自身免疫：自身免疫性疱症、感染：感染性皮肤疾病。
[0188]
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请作为参考直接引入本说明书中。
[0189]
产业上的可利用性
[0190]
本发明可以用于体外诊断药、临床检测等。