Feingold综合征Ι型治疗药物及其应用的制作方法

feingold综合征
ι
型治疗药物及其应用
1.本发明要求申请日为：2022年10月31日，申请号为：202211348553.7，申请名称为“feingold综合征ι型治疗药物及其应用”的专利申请的优先权，其内容通过引用结合在本发明中。
技术领域
2.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及feingold综合征ι型治疗药物及其应用，具体公开了feingold综合征ι型治疗药物，以及mtor激活剂在制备用于治疗feingold综合征ι型药物上的应用。


背景技术：

3.feingold综合征是一种常染色体显性遗传疾病，根据所引起的基因不同分为两种类型，两种类型都具有相似的特征，但最终的症状可能因受影响的个体而异。feingold综合征ι型是由2p24染色体上的mycn基因杂合突变或缺失引起的，而feingold综合征2型是由i3q3i染色体上的mir17hg基因突变引起的。这两种基因都与生长发育相关，尤其是在胚胎发育时期。
4.feingold综合征的主要特征包括小头畸形、肢体发育不全、以及学习障碍/智力迟钝等。其中最常见的畸形为手和脚的发育异常，通常包括拇指发育不良、第二和第五手指斜指畸形、并指畸形(一般发生在第二和第三、第四和第五脚趾之间)、中指骨缩短或缺失。不过在少数患者中也有心脏和肾脏发育不良、脊椎异常以及耳聋等症状。
5.但在feingold综合征i型的患者中常常在消化系统的某部分发生肠道闭锁。在大多数情况下，阻塞发生在食道或小肠中。这也是feingold综合征在早期婴儿中致死的主要原因。目前，由于在哺乳动物中纯合致死的原因，目前对于feingold综合征i型仍然没有有效地治疗方法，寻找治疗效果更好的方法和药物，十分的有必要。


技术实现要素：

6.本发明旨在解决现有技术中存在的缺乏feingold综合征ι型治疗药物和方法效果明显的问题，提出的feingold综合征ι型治疗药物及其应用。具体是指mtor激活剂在制备feingold综合征ι型治疗药物上的应用，通过注射l-leu或rheb mrna处理，拯救mycn基因引起的肠道狭窄表型。
7.mycn是feingold综合征1型的关键基因，目前哺乳动物小鼠的纯合突变致死导致其机制研究成为一个难题，斑马鱼作为一种脊椎动物模式生物，其肠道结构、功能和发育机制与人均较保守，因此用斑马鱼作为模型研究人类疾病，通过crispr-cas9以及其他基因敲除的方法缺失斑马鱼的mycn基因，从而可以成功构建feingold综合征模型。
8.crispr-cas9系统敲除斑马鱼的mycn基因，通过chopchop网站预测敲除斑马鱼mycn基因敲除的grnas，并体外合成三条grnas，然后将其与cas9蛋白共同注射到1细胞的斑马鱼胚胎中，待其长大后鉴定其基因型，从而确定突变情况并通过杂交获得纯合子。敲除方
法不限于crispr-cas9，还可以采用talen等敲除策略。通过原位杂交、转基因报告鱼、he染色以及阿尔新蓝染色等发现斑马鱼模型与人的病症类似，故可以作为feingold综合征的新动物模型。
9.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
10.mtor激活剂在制备feingold综合征ι型治疗药物上的应用，所述mtor激活剂包括但不限于l-leu或rheb mrna中的一种。
11.本发明还提出了feingold综合征ι型治疗药物，包括用于激活mtor信号通路的mtor信号激活剂，所述mtor信号激活剂包括但不限于l-leu或rheb mrna中的一种，l-leu是二十种蛋白质氨基酸内的脂肪族类氨基酸之一，也是人体八种必需氨基酸之一，在细胞水平上可以激活mtor信号通路，rheb mrna是一种小h-ras-样gtpase，是溶酶体表面雷帕霉素复合物1(mtorc1)机制靶点的直接和必要激活剂，本发明以斑马鱼为模型，通过各种实验以及组学分析首次得出激活mtor信号通路可以部分拯救feingold综合征中的肠道狭窄表型，而且实验中通过l-leu处理或rheb mrna注射斑马鱼去激活mtor信号通路确实能够改善肠道的狭窄表型，从而首次证明激活mtor信号通路可以有效地缓解feingold综合征的病症。
12.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
13.i、本发明中，建立feingold综合征的斑马鱼模型,并通过各种实验手段发现其表型与feingold综合征的相似，证据充分,具有很强的理论支撑。能够很好并方便地展示feingold综合征的症状以及治疗效果。
14.2、本发明中，使用的方法是目前比较成熟的基因敲除手段，容易操作。通过多组学分析发现采用mtor激活剂l-leu以及通过注射rheb mrna激活mtor信号通路，对feingold综合征中肠道狭窄的表型具有明显的缓解效果，其具体效果可以从feingold综合征斑马鱼模型的原位杂交中可以看出，同时，在后期的临床试验中，需要进行进一步地验证。
附图说明
15.图1为斑马鱼受精4天和5天的野生型和mycn突变体胚胎；
16.图2为斑马鱼野生型和mycn突变体中软骨发育的情况；
17.图3为通过肠道荧光报告系统et33j1：egfp观察野生型和mycn突变体5天的肠道发育情况；
18.图4为dcfh-da处理条件下观察7天的野生型和mycn突变体斑马鱼的肠道发育情况；
19.图5为通过原位杂交的方法观察野生型和mycn突变体斑马鱼在3天的肠道发育情况；
20.图6为在mycn突变体斑马鱼中通过内胚层启动子sox17驱动过表达mycn基因拯救mycn缺失导致的肠道表型；
21.图7为通过切片he染色观察野生型和mycn突变体斑马鱼在4天的肠道发育情况；
22.图8为通过rapamycin抑制mtor信号通路导致的斑马鱼产生肠道表型；
23.图9为通过注射rheb mrna激活mtor信号通路后对mycn突变体肠道的拯救情况；
24.图10为通过注射l-leu处理激活mtor信号通路后对mycn突变体肠道的拯救情况。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明的技术方案是发明人通过大量的实验，反复地研究而获得的。feingold综合征1型是由于mycn缺失或缺陷导致的一种综合性疾病。由于小鼠及其他哺乳动物mycn纯合致死的原因，目前缺乏合适的模型去系统研究其发病机制以及潜在的治疗途径。
27.实施例一
28.如图1-7所示，为斑马鱼feingold综合征的模型以及各方面的表型，其呈现出来的表型与人的症状类似。
29.为了更好地验证mtor激活剂对feingold综合征ι型肠道闭锁的治疗作用，首先，通过crispr-cas9基因敲除斑马鱼的mycn基因，从而获得feingold综合征模型，其中，基因敲除的方法不限于crispr-cas9，还包括talen等方法。后期的机制研究以及拯救治疗方案则主要通过探针ifabp原位杂交观察其肠道的变化来评估治疗的效果。
30.具体的，通过向斑马鱼受精后30小时的胚胎中注射l-leu。
31.如图9所示，我们运用斑马鱼的feingold综合征模型发现通过l-leu处理可以拯救mycn引起的肠道狭窄表型，l-leu可以激活mtor信号通路。
32.实施例二
33.如图1-7所示，为斑马鱼feingold综合征的模型以及各方面的表型，其呈现出来的表型与人的症状类似。
34.为了更好地验证mtor激活剂对feingold综合征ι型肠道闭锁的治疗作用，首先，通过crispr-cas9基因敲除斑马鱼的mycn基因，从而获得feingold综合征模型，其中，基因敲除的方法不限于crispr-cas9，还包括talen等方法。后期的机制研究以及拯救治疗方案则主要通过探针ifabp原位杂交观察其肠道的变化来评估治疗的效果。
35.具体的，通过向斑马鱼1细胞的胚胎中注射100-150pg rheb mrna。
36.如图10所示，我们运用斑马鱼的feingold综合征模型发现rheb mrna过表达可以拯救mycn引起的肠道狭窄表型，过表达rheb mrna可以直接激活mtor信号通路。
37.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。