癃清制剂指纹图谱的构建方法及其应用与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种癃清制剂指纹图谱的构建方法及其应用。


背景技术：

2.癃清片(国药准字z10920030)处方由泽泻、车前子、败酱草、金银花、牡丹皮、白花蛇舌草、赤芍、仙鹤草、黄连和黄柏组成，具有清热解毒，凉血通淋的作用。主要用于下焦湿热所致的热淋，症见尿频、尿急、尿痛、腰痛、小腹坠胀等。癃清片具有抗菌、抗炎、镇痛和抗前列腺增生的药理作用，临床研究表明其对于慢性前列腺炎、前列腺增生、尿路感染等疾病具有较好的治疗作用。但对于癃清片的质量评价和质量控制方法研究还极为薄弱。现行质量标准中除片剂通则检查外仅规定了泽泻显微鉴别，黄连、牡丹皮、赤芍薄层鉴别以及盐酸小檗碱含量测定。单纯依靠成品质量标准，无法充分反映产品内在质量，也不能及时发现产品质量发生的波动和变化，难以真正有效地控制中药质量，存在着很大的局限性，不利于企业的生产过程控制和质量风险防控。因此亟待开展相关研究对癃清片的内在质量进行评价，提高癃清片的质量评价和控制水平。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种癃清制剂指纹图谱的构建方法，以缓解缺乏一种癃清制剂质量评价和质量控制方法的技术问题。
5.本发明的第二目的在于提供上述癃清制剂指纹图谱的构建方法在评价癃清制剂中的应用。
6.为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
7.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种癃清制剂指纹图谱的构建方法，包括采用高效液相色谱分析待测样品，得到癃清制剂指纹图谱。
8.本发明所述的癃清制剂指的是处方由泽泻、车前子、败酱草、金银花、牡丹皮、白花蛇舌草、赤芍、仙鹤草、黄连和黄柏组成的药物制剂，本发明不限制所述药物制剂的剂型，例如可以为但不限于为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或丸剂等本领域可接受的任何剂型。所述癃清制剂优选为癃清片或癃清胶囊。
9.所述癃清制剂采用高效液相色谱法构建，包括获取至少四个波长条件下的高效液相色谱指纹图谱，具体的包括检测波长230
±
2nm的指纹图谱，检测波长274
±
2nm的指纹图谱，检测波长327
±
2nm的指纹图谱和检测波长345
±
2nm的指纹图谱。
10.在一些优选的实施方式中，所述癃清制剂指纹图谱由检测波长230nm的指纹图谱，检测波长274nm的指纹图谱，检测波长327nm的指纹图谱和检测波长345nm的指纹图谱构成。
11.采用如下高效液相色谱分析条件分析待测样品：
12.流动相：流动相a为乙腈，流动相b为甲酸水溶液。癃清制剂含有较大量的生物碱，
在流动相中加入适量酸可以改善分离。
13.在一些优选的实施方式中，按照体积百分数计，流动相b为0.1％～0.2％甲酸溶液，例如可以为但不限于为0.1％、0.12％、0.15％、0.18％或0.2％，优选为0.1％甲酸溶液。
14.按体积百分数计，梯度洗脱程序如下：
15.0min，流动相a 5
±
2％，流动相b 95
±
2％；50min，流动相a 45
±
5％，流动相b 55
±
5％；60min，流动相a 100％，流动相b 0％。
16.在一些优选的实施方式中，按体积百分数计，梯度洗脱程序如下：
17.0min，流动相a 5
±
1％，流动相b 95
±
1％；50min，流动相a 45
±
1％，流动相b 55
±
1％；60min，流动相a 100％，流动相b 0％；
18.在一些更优选的实施方式中，按体积百分数计，梯度洗脱程序如下：
19.0min，流动相a 5％，流动相b 95％；50min，流动相a 45％，流动相b 55％；60min，流动相a 100％，流动相b 0％。
20.在一些优选的实施方式中，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱型号优选如下：aglient extend c18 250mm
×
4.6mm，5μm。
21.在一些可选的实施方式中，待测样品为癃清制剂，按照如下方法将癃清制剂制备成供试品溶液进行液相色谱分析：将癃清制剂制成粉末，经提取溶剂提取后使用所述提取溶剂补足失重，然后取滤液作为供试品溶液；其中提取溶剂优选为乙醇水溶液。以体积百分比计，提取溶剂优选为30％～60％的乙醇水溶液，例如可以为但不限于为30％、40％、50％或60％，优选为60％的乙醇水溶液。提取方式可选择超声处理或加热回流，优选更为简便的超声处理方法。
22.在一些可选的实施方式中，所述待测样品还包括对照品溶液，所述对照品溶液包括分别含有绿原酸、芍药苷、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和丹皮酚，各对照品的浓度范围可选如下，按照如下浓度范围配制对照品溶液，可获得较成功的色谱图：绿原酸0.1800～0.2100mg/ml；芍药苷0.4000～0.5050mg/ml；盐酸药根碱0.2200～0.2500mg/ml；盐酸黄连碱0.1900～0.2100mg/ml；盐酸巴马汀0.3000～0.3600mg/ml；盐酸小檗碱0.3700～0.4500mg/ml；和，丹皮酚0.4500～0.4700mg/ml。
23.各对照品溶液的优选浓度分别独立的为：绿原酸0.2016mg/ml；芍药苷0.5020mg/ml；盐酸药根碱0.2495mg/ml；盐酸黄连碱0.2060mg/ml；盐酸巴马汀0.3594mg/ml；盐酸小檗碱0.4400mg/ml；和，丹皮酚0.4672mg/ml。
24.上述各对照品溶液的溶剂优选为甲醇。
25.在一些优选的实施方式中，所述构建方法包括采用高效液相色谱分析待测样品，待测样品包括供试品溶液和对照品溶液。
26.所述供试品溶液按照如下方法制得：将癃清制剂制成粉末，加入60％的乙醇水溶液，超声提取，使用60％的乙醇水溶液补足失重，然后取滤液作为供试品溶液；
27.所述对照品溶液包括：浓度为0.2016mg/ml的绿原酸对照物溶液，浓度为0.5020mg/ml的芍药苷对照物溶液，浓度为0.2495mg/ml的盐酸药根碱对照物溶液，浓度为0.2060mg/ml的盐酸黄连碱对照物溶液，浓度为0.3594mg/ml的盐酸巴马汀对照物溶液，浓度为0.4400mg/ml的盐酸小檗碱对照物溶液，浓度为0.4672mg/ml的丹皮酚对照物溶液；所述对照品溶液以甲醇作为溶剂；所述高效液相色谱的分析条件为：
28.流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸溶液；
29.按体积百分数计，梯度洗脱程序为：
30.0min，流动相a 5％，流动相b 95％；
31.50min，流动相a 45％，流动相b 55％；
32.60min，流动相a 100％，流动相b 0％；色谱柱为aglient extend c18 250mm
×
4.6mm，5μm；检测波长分别为230nm、274nm、327nm和345nm。
33.在一些可选的实施方式中，所述构建方法包括采用高效液相色谱法对供试品溶液和对照品溶液进行测定，依据对照品溶液高效液相色谱图谱中的色谱峰对供试品溶液高效液相色谱图谱中的主要色谱峰进行确认并确定参照物峰，得到主要色谱峰相对参照物峰的相对保留时间。
34.在一些可选的实施方式中，所述构建方法还包括提供不同批次的癃清制剂的指纹图谱，标定共有峰并合成对照指纹图谱。
35.在一些可选的实施方式中，所述对照指纹图谱由检测波长230nm的对照指纹图谱，检测波长274nm的对照指纹图谱，检测波长327nm的对照指纹图谱和检测波长345nm的对照指纹图谱构成；所述对照指纹图谱中以盐酸小檗碱峰为参照物峰，共有峰的相对保留时间rsd不大于1％。所述对照指纹图谱的特征如下：
36.检测波长230nm的对照指纹图谱包含19个共有峰，峰16为参照物峰，共有峰的平均相对保留时间如下：峰1:0.345；峰2：0.353；峰3：0.370；峰4：0.499；峰5：0.511；峰6：0.559；峰7：0.644；峰8：0.655；峰9：0.720；峰10：0.734；峰11：0.855；峰12：0.864；峰13：0.873；峰14：0.885；峰15：0.979；峰16：1.000；峰17：1.060；峰18：1.234；峰19：1.513；
37.检测波长274nm的对照指纹图谱包含16个共有峰，峰15为参照物峰，共有峰的平均相对保留时间如下：峰1:0.124；峰2：0.251；峰3：0.345；峰4：0.371；峰5：0.499；峰6：0.553；峰7：0.560；峰8：0.644；峰9：0.655；峰10：0.855；峰11：0.864；峰12：0.873；峰13：0.885；峰14：0.979；峰15：1.000；峰16：1.234；
38.检测波长327nm的对照指纹图谱包含18共有峰，峰17为参照物峰，共有峰的平均相对保留时间如下：峰1:0.251；峰2：0.323；峰3：0.345；峰4：0.371；峰5：0.405；峰6：0.499；峰7：0.644；峰8：0.683；峰9：0.711；峰10：0.720；峰11：0.757；峰12：0.855；峰13：0.864；峰14：0.873；峰15：0.885；峰16：0.979；峰17：1.000；峰18：1.234；
39.检测波长345nm的对照指纹图谱包含16共有峰，峰15为参照物峰，共有峰的平均相对保留时间如下：峰1:0.251；峰2：0.323；峰3：0.345；峰4：0.371；峰5：0.499；峰6：0.644；峰7：0.683；峰8：0.710；峰9：0.720；峰10：0.855；峰11：0.864；峰12：0.873；峰13：0.885；峰14：0.979；峰15：1.000；峰16：1.234。
40.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述癃清制剂的指纹图谱的构建方法在评价癃清制剂中的应用，优选应用于评价癃清片或癃清胶囊，经测定，上述指纹图谱用于评价癃清片效果更佳。
41.在一些可选的实施方式中，采用如下方式对癃清制剂进行评价：将待评价癃清制剂的指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，计算待评价癃清制剂的指纹图谱与对照指纹图谱间的相似度。
42.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
43.本发明提供的癃清制剂指纹图谱的构建方法采用液相色谱法，对检测波长和色谱条件进行优化，建立癃清制剂230
±
2nm、274
±
2nm、327
±
2nm和345
±
2nm四个检测波长下的高效液相色谱指纹图，由于各药材指标成分检测波长差别较大，采用单一波长检测很容易遗漏样品信息特征，而多波长检测在显示样品的细微差别方面更为有效，结合处方药指标成分的检测波长以及不同检测波长下色谱图信息可以发现230
±
2nm、274
±
2nm、327
±
2nm、345
±
2nm作为检测波长，色谱图上化合物的信息较为丰富，基线平稳，且在周围一定波长范围内具有较好的代表性。
44.采用本发明的检测波长和色谱条件构建指纹图谱，癃清制剂供试品相对保留时间具有较好的重现性，各共有峰相对保留时间rsd均小于1.0％。本发明提供的构建方法得到的指纹图谱能够比较全面的反应癃清制剂的化合物信息，各主要色谱峰能够达到基本分离，对本发明提供的构建方法验证进行验证，其精密度、重复性和稳定性实验结果符合要求。
45.本发明提供的癃清制剂的指纹图谱的构建方法制备得到的指纹图谱能够对癃清制剂内在质量进行综合评价，建立了一种可行的癃清制剂质量控制方法，提高了产品的内部质量控制水平，进而为中药质量综合评价、质量控制和质量风险评估提供实践依据并探索一种可能的思路。
附图说明
46.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
47.图1a为实施例1癃清片(批号150120)高效液相色谱三维紫外(210-400nm)图；
48.图1b～1k为实施例1癃清片(批号150120)检测波长考察高效液相色谱图，图1b～1k检测波长依次为210nm、230nm、254nm、274nm、300nm、327nm、345nm、360nm、380nm和400nm；
49.图2a～2d为癃清片(批号150120)指纹图谱色谱条件考察高效液相色谱图。图2a～2d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm；
50.图2e为实施例1癃清片(批号150120)高效液相色谱图，检测波长为230nm、274nm、327nm和345nm；
51.图3a～3d为实施例3癃清片(批号150120)提取溶剂考察高效液相色谱图，图3a～3d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm；
52.图4a～4d为实施例4癃清片(批号150120)提取方法考察高效液相色谱图，图4a～4d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm；
53.图5a为实施例5中检测波长345nm盐酸小檗碱对照品高效液相色谱图；
54.图5b为实施例5中检测波长345nm癃清片(批号150120)高效液相色谱图；
55.图5c为实施例5中盐酸小檗碱对照品色谱峰全波长(210-400nm)扫描图；
56.图5d为实施例5中癃清片(批号150120)与盐酸小檗碱色谱图中对应位置色谱峰(rt＝34.231)全波长(210-400nm)扫描图；
57.图5e～5k为实施例5中对照品高效液相色谱图，图5e～5k依次为绿原酸对照品
(327nm)，芍药苷对照品(230nm)，盐酸药根碱(345nm)，盐酸黄连碱(345nm)，盐酸巴马汀(345nm)，盐酸小檗碱(345nm)和丹皮酚对照品(274nm)；
58.图5l为实施例5中绿原酸对照品全波长(210-400nm)扫描图；
59.图5m为实施例5中癃清片(批号150120)与绿原酸色谱图中对应位置色谱峰(rt＝11.711)全波长(210-400nm)扫描图；
60.图5n为实施例5中芍药苷对照品全波长(210-400nm)扫描图；
61.图5o为实施例5中癃清片(批号150120)与芍药苷色谱图中对应位置色谱峰(rt＝17.370)全波长(210-400nm)扫描图；
62.图5p为实施例5中盐酸药根碱对照品全波长(210-400nm)扫描图；
63.图5q为实施例5中癃清片(批号150120)与盐酸药根碱色谱图中对应位置色谱峰(rt＝29.914)全波长(210-400nm)扫描图；
64.图5r为实施例5中盐酸黄连碱对照品全波长(210-400nm)扫描图；
65.图5s为实施例5中癃清片(批号150120)与盐酸黄连碱色谱图中对应位置色谱峰(rt＝30.301)全波长(210-400nm)扫描图；
66.图5t为实施例5中盐酸巴马汀对照品全波长(210-400nm)扫描图；
67.图5u为实施例5中癃清片(批号150120)与盐酸巴马汀色谱图中对应位置色谱峰(rt＝33.543)全波长(210-400nm)扫描图；
68.图5v为实施例5中丹皮酚对照品全波长(210-400nm)扫描图；
69.图5w为实施例5中癃清片(批号150120)与丹皮酚色谱图中对应位置色谱峰(rt＝42.260)全波长(210-400nm)扫描图；
70.图5x为实施例5中癃清片(批号150120)色谱峰确认高效液相色谱图；
71.图6a～6d为实施例6中癃清片(批号150015)及处方药材高效液相色谱图，图6a～6d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm；
72.图7a～7d为实施例7中癃清片13批次样品指纹图谱高效液相色谱图，图7a～7d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm；
73.图8a～8d为实施例9中癃清片高效液相色谱对照指纹图谱，图8a～8d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm；
74.图9a～9d为实施例10中癃清胶囊与癃清片对照指纹图谱对比，图9a～9d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm。
75.图10为效果例1中癃清片(批号150120)指纹图谱完整性考察高效液相色谱图(记录120分钟)；
76.图11a～11d为效果例2中癃清片(批号150120)阴性干扰实验高效液相色谱图，图11a～11d检测波长依次为230nm、274nm、327nm和345nm。
具体实施方式
77.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
78.实施例使用的实验材料如下：
79.1.仪器
80.ms105电子天平，梅特勒公司；
81.al204ic电子天平，梅特勒公司；
82.kq-400vde双频数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器公司；
83.waters e2695/2998高效液相色谱仪，美国waters公司。
84.2.试剂试药
85.2.1供试品
86.癃清片(批号150120、150186、150058、fk15482、gd15554、gd15553、ga15514、150093、gd15539、150015、150233、ga15522、150024)，由天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂生产。
87.癃清胶囊a(批号20150704、20190804)，购自亮健好大药房。
88.癃清胶囊b(批号835036、418024)，购自亮健好大药房。
89.2.2药材
90.泽泻(批号y08324)、车前子(批号y03098)、败酱草(批号y08334)、金银花(批号y11375)、牡丹皮(批号y08333)、白花蛇舌草(批号y09347)、赤芍(批号y11390)、仙鹤草(批号y08327)、黄连(批号y10362)、黄柏(批号y08323)，均由天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂提供。
91.2.3对照品
92.丹皮酚对照品(批号110708-200506)，含量以99.0％计。盐酸巴马汀对照品(批号110732-201510)，含量以87.4％计。盐酸小檗碱对照品(批号110713-201613)，含量以86.8％计。芍药苷对照品(批号110736-201741)，含量以95.7％计。绿原酸对照品(批号110753-201716)，含量以99.3％计。盐酸药根碱对照品(批号110733-201609)，含量以89.5％计。盐酸黄连碱对照品(批号112026-201802)，含量以94.0％计。盐酸黄柏碱对照品(批号111895-201805)，含量以94.9％计。以上对照品均为供含量测定用，均购自中国食品药品检定研究院。
93.2.4试剂试药
94.甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸、乙醇等均为分析纯，水为纯化水。
95.实施例1
96.癃清片处方由泽泻、车前子、败酱草、金银花、牡丹皮、白花蛇舌草、赤芍、仙鹤草、黄连、黄柏组成。药材质量标准收载情况及其中规定的含量测定成分、检测波长见表1。
97.表1癃清片处方药材标准收载情况及指标成分、检测波长
98.药材标准收载指标成分检测波长(nm)泽泻《中国药典》2015年版一部23-乙酰泽泻醇b203车前子《中国药典》2015年版一部京尼平苷酸254败酱草《四川省中药材标准》
‑‑
金银花《中国药典》2015年版一部绿原酸327牡丹皮《中国药典》2015年版一部丹皮酚274白花蛇舌草《山东省中药材标准》
‑‑
赤芍《中国药典》2015年版一部芍药苷230仙鹤草《中国药典》2015年版一部
‑‑
黄连《中国药典》2015年版一部小檗碱等345黄柏《中国药典》2015年版一部小檗碱、黄柏碱265、284
99.注：
“‑”
表示质量标准中无含量测定项。
100.由表中明显可见各药材指标成分检测波长差别较大，采用单一波长检测很容易遗漏样品信息特征，而多波长检测在显示样品的细微差别方面更为有效，能较为有效解决这一问题。通过光电二极管阵列检测器对各个色谱峰进行紫外扫描，高效液相色谱三维紫外图见图1a。以约20nm为间隔提取210nm-400nm波长下的不同检测波长色谱图进行对比，色谱图如图1b～1k所示。
101.结合处方药指标成分的检测波长以及不同检测波长下色谱图信息可以发现230nm、274、327、345nm作为检测波长，色谱图上化合物的信息较为丰富，基线平稳，且在周围一定波长范围内具有较好的代表性，同时与癃清片处方主要药味的指标成分芍药苷(230nm)、绿原酸(327nm)、丹皮酚(274nm)、盐酸小檗碱(345nm)等检测波长具有对应关系，因此选择这4个波长作为检测波长，进行数据统计和相似度分析。
102.实施例2-1
103.取癃清片，粉碎，过三号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放置至室温，用60％乙醇补足失重，滤过，取续滤液，即得。
104.采用水-极性溶剂系统进行梯度洗脱，考虑到样品中含有较大量的生物碱，故在流动相中加入适量酸以改善分离。采用0.1％甲酸溶液-乙腈作为流动相体系，在以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(aglient extend c18 250mm
×
4.6mm,5μm)上进行洗脱，流速1.0ml/min，检测波长分别为230nm、274nm、327nm和345nm，洗脱条件如表2c所示。色谱图如图2a～图2d所示，图2a～图2d中每张色谱图自下至上依次为表2a、2b和2c所示洗脱条件。其中2c为本实施例的洗脱条件。
105.表2c
106.时间(min)乙腈(％)0.1％甲酸溶液(％)0595504555601000
107.采用本实施例的方法检测癃清片(批号150120)，色谱图如图2e所示，图2e中(a)为检测波长为345nm，(b)为检测波长为327nm，(c)为检测波长为274nm，(d)为检测波长为230nm。
108.实施例2-2
109.实施例2-2与实施例2-1的区别仅在于洗脱程序不同，洗脱程序如表2a所示。色谱图如图2a～图2d所示，图2a～图2d中色谱图自下至上依次为表2a、2b和2c所示洗脱条件。其中2a为本实施例的洗脱条件。
110.表2a
111.时间(min)乙腈(％)0.1％甲酸溶液(％)
0595504060601000
112.实施例2-3
113.实施例2-3与实施例2-1的区别仅在于洗脱程序不同，洗脱程序见表2d
114.表2d
115.时间(min)乙腈(％)0.1％甲酸溶液(％)0397505050601000
116.实施例2-4
117.实施例2-4与实施例2-1的区别仅在于洗脱程序不同，洗脱程序见表2e
118.表2e
119.时间(min)乙腈(％)0.1％甲酸溶液(％)0793504060601000
120.实施例2-5
121.实施例2-5与实施例2-1的区别仅在于流动相不同，本实施例流动相a为乙腈，流动相b为0.2％甲酸溶液。
122.实施例2-6
123.实施例2-6与实施例2-1的区别仅在于流动相不同，本实施例流动相a为乙腈，流动相b为0.5％甲酸溶液。
124.对比例1
125.对比例1与实施例2-1的区别仅在于流动相和洗脱程序不同，采用0.1％冰乙酸溶液-乙腈作为流动相体系，洗脱程序如表2a所示。色谱图如图2a～图2d所示，图2a～图2d中色谱图自下至上依次为表2a、2b和2c所示洗脱条件。其中2b为本对比例的洗脱条件。
126.表2b
127.时间(min)乙腈(％)0.1％冰乙酸溶液(％)0595509010601000
128.比较实施例2-1～2-6和对比例1的实验结果：
129.实施例2-1和实施例2-2为采用相同的流动相，不同的洗脱程序的两种色谱方案：实施例2-1和实施例2-2的色谱图如图2a～图2d所示，图2a～图2d中每张色谱图最上方的色谱图为实施例2-2(表2a所示洗脱程序)的色谱图，最下方的色谱图为实施例2-1(表2c所示洗脱程序)的色谱图。比较二者色谱图可以看出：实施例2-1(表2a所示洗脱程序)的洗脱程序得到的色谱图具有更少的杂峰，主要色谱峰峰型对称性更好、分离度更高；大部分主要色
谱峰具有更宽的峰宽。
130.对比例1的流动相b中添加的酸为冰乙酸，以及不同于实施例2-1和2-2的洗脱程序。对比例1的色谱图如图2a～图2d所示，图2a～图2d中位于中间的色谱图为对比例1(表2b所示洗脱程序)的色谱图，从图中可以看出，相较于实施例2-1和2-2，对比例1的色谱条件保留时间更短，各主峰的分离度较差，杂峰更多，这些特征都表明对比例1的色谱条件不能达到分离各主要峰的要求，无法构建指纹图谱。
131.基于实施例2-1和2-2以及对比例1的实验结果，发明人还尝试了实施例2-3～2-6的色谱条件：
132.实施例2-3和2-4与实施例2-1的区别仅在于洗脱程序不同，相比于实施例2-1的洗脱程序，实施例2-3(表2d所示洗脱程序)和2-4(表2e所示洗脱程序)的色谱图类似于实施例2-2的洗脱程序得到的色谱图，相较于实施例2-1的色谱图杂峰更多，但是远少于对比例1的杂峰更少，仍然可以在确保获得足够化合物信息的情况下，过滤干扰，因此实施例2-3和2-4的洗脱条件也可以实现本发明的技术方案。
133.进一步的，发明人还尝试通过调整流动相b中的甲酸含量来研究甲酸的含量对色谱图的影响，发明人尝试了将流动相b中的甲酸浓度调整至0.2％v/v(实施例2-5)和0.5％v/v(实施例2-6)，发现随着甲酸浓度的增高并不能进一步减少杂峰的数量，无法进一步排除干扰成分，其色谱图效果类似于实施例2-2的色谱图；因此流动相b中的甲酸浓度以0.1％v/v更佳。
134.实施例3
135.取癃清片(批号150120)，粉碎，过三号筛，取约1.0g，精密称定，平行四份，置具塞三角瓶中，分别精密加入纯水、30％乙醇、60％乙醇、无水乙醇各25ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放置至室温，用提取溶剂补足失重，滤过，取续滤液，即得。
136.分别精密吸取以上各供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件测定，色谱图见图3a～3d，图3a～3d中(a)为无水乙醇，(b)为60％乙醇，(c)为30％乙醇，(d)为水。结果表明采用60％乙醇提取效果最好，能够获得更多的色谱峰，显示的信息更为全面，因此优选60％乙醇作为癃清片的提取溶剂。
137.实施例4
138.取癃清片(批号150120)，粉碎，过三号筛，取约1.0g，精密称定，平行两份，置具塞三角瓶中，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，加热回流和超声处理各30分钟，取出，放置至室温，用60％乙醇补足失重，滤过，取续滤液，即得。
139.分别精密吸取以上各供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，按照拟定的色谱条件测定，色谱图见图4a～4d，图4a～4d中(a)为采用加热回流处理，(b)为采用超声处理。结果表明加热回流和超声处理获得的供试品溶液，获得的色谱峰基本一致，因此优选更为简便的超声处理方法作为提取方法。
140.下述实施例5～实施例15癃清制片的前处理方法为：取癃清片，粉碎，过三号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放置至室温，用60％乙醇补足失重，滤过，取续滤液，即得。
141.色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱aglient extend c18 250mm
×
4.6mm,5μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，按表1c中的规定进行
梯度洗脱；检测波长为230nm、274nm、327nm、345nm；流速1.0ml/min。
142.实施例5
143.色谱峰的指认：分别使用甲醇作为溶剂配置绿原酸(浓度0.2016mg/ml)、芍药苷(浓度0.5020mg/ml)、盐酸药根碱(浓度0.2495mg/ml)、盐酸黄连碱(浓度0.2060mg/ml)、盐酸巴马汀(浓度0.3594mg/ml)、盐酸小檗碱(浓度0.4400mg/ml)、丹皮酚(浓度0.4672mg/ml)对照品溶液。将上述对照品溶液及供试品溶液进行高效液相色谱分析，对供试品液相指纹图谱中的主要色谱峰进行确认。
144.癃清片供试品及盐酸小檗碱对照品色谱见图5a和5b，色谱峰全波长扫描图见图5c和5d。由图中可见，盐酸小檗碱对照品(rt＝34.363)色谱峰与癃清片供试品色谱图中对应位置色谱峰(rt＝34.231)保留时间基本一致，且与该色谱峰全波长扫描图整体趋势及最大吸收波长均一致，可以确认该色谱峰为盐酸小檗碱。其他各色谱峰确认方法相同，其他对照品高效液相色谱图如图5e～5k所示，其他对照品色谱峰与癃清片供试品色谱图中对应位置色谱峰全波长(210-400nm)扫描图如图5l～5w所示。
145.根据以上实验结果，最终确认色谱峰见图5x，图中(a)为检测波长为345nm，(b)为检测波长为327nm，(c)为检测波长为274nm，(d)为检测波长为230nm。为准确描述癃清片中各色谱峰的位置，选择其中峰面积较大，分离度较好的盐酸小檗碱峰为参照物峰。
146.实施例6
147.色谱峰药材归属：
148.1.癃清片供试品溶液的制备：取癃清片，粉碎，取约1g，精密称定，分别置于100ml锥形瓶中，分别精密加入60％乙醇50ml，称定重量，超声处理30min，取出，放置至室温，再次称定重量，用60％乙醇补足减失重量，滤过，即得。
149.药材供试品溶液的制备：按照处方量称取处方中各药味，按癃清片质量标准中规定的提取工艺进行提取，提取液分别浓缩、干燥，制得各药材提取物，精密称定，分别置于100ml锥形瓶中，精密加入60％乙醇50ml，称定重量，超声处理30min，取出，放置至室温，再次称定重量，用60％乙醇补足减失重量，滤过，即得。
150.2.测定及结果：分别精密吸取以上供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件测定。对比癃清片及药材色谱图，同时结合色谱图中各色谱峰的紫外全波长扫描图及指纹图谱色谱峰化学成分的指认结果，对癃清片色谱图中的各色谱峰的药材来源进行归属，结果见下表，色谱图见图6a～6d所示，色谱图中自下至上依次为：黄连、黄柏、牡丹皮、赤芍、金银花、败酱草、仙鹤草、白花蛇舌草、泽泻、车前子、癃清片。
151.表3癃清片指纹图谱色谱峰的药材归属
[0152][0153][0154]
注：“ ”表示在该检测波长下，有该色谱峰存在。
[0155]
实施例7
[0156]
共有峰的标定：取13批次癃清片(批号150120、150186、150058、fk15482、gd15554、gd15553、ga15514、150093、gd15539、150015、150233、ga15522、150024)按照确定的供试品溶液的制备方法进行制备，并依据上述色谱条件进样分析，记录13批次样品在230nm、274nm、327nm及345nm四个检测波长下60min的色谱图。根据13批供试品液相色谱图所给出的信息，确定共有峰数量，并计算非共有峰峰面积占总峰面积比例。对各共有峰依次标号为1、2、
…
、n，选择其中稳定性好、含量高的盐酸小檗碱峰作为参照物峰。各检测波长下共有峰数量、峰面积比例及参照物峰编号见表4，色谱图见图7a～7d，图中癃清片样品批号如下：s1：150120；s2：150186；s3：150058；s4：fk15482；s5：gd15554；s7：gd15553；s7：ga15514；s8：150093；s9：gc15539；s10：150015；s11：150233；s12：ga15522；s13：150024。
[0157]
表4癃清片各检测波长下共有峰及参照物峰
[0158]
检测波长共有峰数量非共有峰面积比例(％)参照物峰编号
230nm1914.516(s)274nm1614.115(s)327nm185.617(s)345nm167.715(s)
[0159]
实施例8
[0160]
共有峰相对保留时间及峰面积相对比值范围：以盐酸小檗碱峰作为参照峰，计算13批癃清片供试品230nm、274nm、327nm及345nm四个不同检测波长下各共有峰相对保留时间比值及峰面积相对比值范围，结果如表5～12所示。结果表明各癃清片供试品相对保留时间具有较好的重现性，各共有峰相对保留时间rsd均小于1.0％。
[0161]
表5共有峰相对保留时间(230nm)
[0162][0163]
表6共有峰峰面积相对比值(230nm)
[0164][0165][0166]
表7共有峰相对保留时间(274nm)
[0167][0168]
表8共有峰峰面积相对比值(274nm)
[0169][0170]
表9共有峰相对保留时间(327nm)
[0171][0172][0173]
表10共有峰峰面积相对比值(327nm)
[0174][0175]
表11共有峰相对保留时间(345nm)
[0176][0177]
表12共有峰峰面积相对比值(345nm)
[0178][0179][0180]
实施例9
[0181]
对照指纹图谱及相似度计算：
[0182]
通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本”对癃清片13批样品的
色谱图进行计算和处理，得到癃清片高效液相色谱对照指纹图谱，见图8a～8d。计算各批次癃清片供试品与对照指纹图谱间的相似度均≥0.99。相似度结果见表13。
[0183]
表13癃清片13批图谱与对照指纹图谱相似度结果
[0184][0185]
相似度计算结果表明，13批次癃清片样品的hplc指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.99，说明拟合得到的hplc对照指纹图谱“r”能够较全面的表述癃清片中有效成分的信息，且这13批样品在化学成分组成上差异性较小，但由相对峰面积计算结果可知，13批次癃清片中各组分的含量存在一定差异。
[0186]
实施例10
[0187]
癃清胶囊的测定:使用已建立的癃清片多波长对照指纹图谱检测方法测定市售癃清胶囊样品，考察相似度结果。取4个批次癃清胶囊(批号20150704、20190804、835036、418024)，取出内容物，粉碎，过三号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放置至室温，用60％乙醇补足失重，滤过，取续滤液，按照上述色谱条件进行测定。指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本”，与癃清片液相色谱对照指纹图谱进行比较。计算各批次癃清胶囊供试品与对照指纹图谱间的相似度，结果见表14，色谱图见图9a～9d，图中癃清片样品批号如下：s2：20190804；s3：20150704；s4：418024；s5：835036；r为癃清片对照指纹图谱。
[0188]
表14癃清胶囊图谱与对照指纹图谱相似度结果
[0189][0190]
相似度计算结果表明，癃清胶囊指纹图谱与癃清片对照指纹图谱在各波长下相似度均高于0.97，部分样品在345nm波长下高于0.99，表明癃清胶囊和癃清片具有很高的相似度，但低于癃清片各批次样品之间的相似度。
[0191]
效果例1
[0192]
指纹图谱完整性：取癃清片供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，照拟定方法检测，记录2小时的色谱图，显示60分钟以后无色谱峰流出，色谱图见图10，图中(a)为检测波长为345nm，(b)为检测波长为327nm，(c)为检测波长为274nm，(d)为检测波长为230nm。因此确定
色谱图记录时间为60分钟。
[0193]
效果例2
[0194]
指纹图谱分析方法验证-阴性干扰试验：取供试品制备中所使用的60％乙醇，按照上述色谱条件进行测定，并与供试品溶液进行对比，色谱图见图11a～11d，图中(a)为癃清片供试品，(b)为空白溶剂。结果表明在230nm、274nm、327nm及345nm四个不同检测波长下，溶剂空白对样品检测均没有干扰。
[0195]
效果例3
[0196]
指纹图谱分析方法验证-精密度：取癃清片(批号150120)，粉碎，过三号筛，取约1.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放置至室温，用60％乙醇补足失重，滤过，取续滤液，按照拟定的色谱条件进行测定，连续测定6次。记录分析230nm、274nm、327nm及345nm四个不同检测波长下各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以检测波长327nm下计算结果为例，详见表15和表16。
[0197]
表15癃清片指纹图谱分析方法验证精密度试验——相对保留时间(327nm)
[0198][0199]
表16癃清片指纹图谱分析方法验证精密度试验——峰面积相对比值(327nm)
[0200]
[0201][0202]
结果表明，各检测波长下癃清片供试品溶液各色谱峰的相对保留时间基本一致(rsd≤5％)，各峰的相对峰面积基本一致(rsd≤5％)，精密度试验符合要求。
[0203]
效果例4
[0204]
指纹图谱分析方法验证-重复性：取癃清片(批号150120)，粉碎，过三号筛，取约1.0g，精密称定，平行6份，置具塞三角瓶中，精密加入60％乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放置至室温，用60％乙醇补足失重，滤过，取续滤液，按照拟定的色谱条件进行测定。记录分析230nm、274nm、327nm及345nm四个不同检测波长下各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以检测波长327nm下计算结果为例，见表17和表18。
[0205]
表17癃清片指纹图谱分析方法验证重复性试验——相对保留时间(327nm)
[0206][0207]
表18癃清片指纹图谱分析方法验证重复性试验——峰面积相对比值(327nm)
[0208][0209]
结果表明，各检测波长下癃清片供试品各色谱峰的相对保留时间基本一致(rsd≤5％)，各峰的相对峰面积基本一致(rsd≤5％)，重复性试验符合要求。
[0210]
效果例5
[0211]
指纹图谱分析方法验证-稳定性：取本品(批号为120150)供试品溶液在室温下保存，分别于0、4、8、12、16、20、24小时测定，记录分析230nm、274nm、327nm及345nm四个不同检测波长下各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以检测波长327nm下计算结果为例，见表19和表20。
[0212]
表19癃清片指纹图谱分析方法验证稳定性试验——相对保留时间(327nm)
[0213][0214]
表20癃清片指纹图谱分析方法验证稳定性试验——峰面积相对比值(327nm)
[0215][0216]
结果表明，各检测波长下癃清片供试品溶液各色谱峰的相对保留时间基本一致(rsd≤5％)，各峰的相对峰面积基本一致(rsd≤5％)，表明供试品溶液在24小时内稳定。
[0217]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。