叶酸在延缓葡萄果实采后品质劣变方面的应用

1.本发明涉及叶酸在延缓葡萄果实采后品质劣变方面的应用，属于种植技术领域。


背景技术：

2.葡萄(vitis vinifera l.)属于葡萄科(vitaceae juss)葡萄属(vitis l.)，落叶藤本植物，浆果类水果，有“水果皇后”之美誉，营养丰富、味道甜美，具有很高的实用价值及医疗保健价值。
‘
巨峰’葡萄是我国主栽品种之一，其果粒硕大，果色艳丽，果实酸甜适口，果粒柔软多汁，是鲜食葡萄中的佳品，深受消费者和种植者青睐。
3.然而，
‘
巨峰’葡萄果实在采后极易发生脱粒、失水、衰老、腐烂等品质劣变，严重影响商品价值。目前通过冰温、防腐剂保鲜、辐射、气调等葡萄保鲜技术抑制采后的生理活动，延长贮藏期。但是探究采后果实品质劣变调控机制及有效的延缓劣变方法仍然是当前亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供叶酸在延缓葡萄果实采后品质劣变方面的应用。
5.使用叶酸处理液处理采后
‘
巨峰’葡萄可以有效地延缓其品质劣变，本发明的方法为延缓葡萄采后品质劣变的产品开发研究奠定基础。
6.本发明的第二个目的是提供叶酸在调节葡萄果实采后过氧化氢含量和相关酶活性方面的应用。
7.使用叶酸处理液处理采后
‘
巨峰’葡萄，经检测其h2o2含量显著降低，过氧化氢酶活性(catalase，cat)，超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase，sod)，过氧化物酶活性(peroxidase，pod)显著升高。
8.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
9.叶酸在延缓葡萄果实采后品质劣变方面的应用。
10.本发明将采后
‘
巨峰’葡萄果穗浸泡在叶酸处理液中，经检测果实落粒率和失水率明显低于对照组，而浆果硬度明显高于对照组，说明叶酸处理能够有效延缓葡萄果实采后品质劣变。
11.优选地，使用叶酸处理液处理采摘后的葡萄果穗；所述叶酸处理液中叶酸的浓度为1～3mg/l。
12.进一步优选地，所述叶酸处理液中还含有0.01～0.05％(v/v)silwet_l-77。
13.silwet_l-77是一种高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力，这使silwet-l77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有植物材料的表面，相对于传统助剂，显著提高了处理液的覆盖面。同时，silwet-l77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力，能显著提高处理液的有效利用率，使靶标物质充分发挥作用。为提高叶酸在葡萄果实表面的附着力及叶酸的作用效率，在叶酸处理液中添加0.01～0.05％(v/v)silwet_l-77。
14.进一步优选地，所述处理为浸泡，浸泡时间为15～30min。
15.优选地，所述品质劣变是果穗脱粒、果实失水、果实硬度下降中的一种或两种或三种。
16.进一步优选地，所述硬度下降与vvrboh基因表达量升高相关；所述vvrboh基因通过hub-vvwrky转录因子调节。
17.具体地，hub-vvwrky转录因子的筛选过程如下：
18.(1)对采后的葡萄果穗分别在1mg/l的叶酸溶液(含0.01％silwet_l-77)和水中浸泡15min，形成叶酸处理组和对照组，对叶酸处理组和对照组进行保存，从处理后第3、6、9天随机采集叶酸处理组和对照组处理的果实进行转录组测序；
19.(2)在处理后第3、6、9天分别检测落粒个数、失水率和浆果硬度，过氧化氢含量，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶的活性，活性氧生成基因vvrboh和活性氧清除系统相关基因的表达量；
20.(3)根据步骤(1)的转录组测序结果，分析叶酸处理组和对照组的差异表达基因，对差异表达基因进行基因富集分析；鉴定转录因子，分析叶酸处理组相对对照组的差异表达转录因子，对差异表达转录因子进行go富集分析；
21.(4)对步骤(2)获得差异表达基因与采后葡萄的浆果硬度变化进行加权基因共表达网络分析，确定与浆果硬度变化显著相关的基因模块；
22.(5)根据功能注释信息和富集分析结果，从步骤(4)确定的基因模块中筛选出备选转录因子以及与浆果硬度相关基因，并进行转录因子瞬时表达及功能分析；
23.(6)根据步骤(5)的分析结果进行顺式作用元件和转录因子结合位点验证，确定葡萄果实采后劣变的相关转录因子。
24.本发明对采后
‘
巨峰’葡萄进行叶酸(folic acid，fa)和对照(h2o，即ck)处理，测定浆果的采后品质相关指标，并通过基于转录组测序的wgcna分析，将转录组分析获得的差异表达基因(differential expressed genes，degs)与浆果硬度变化进行相关性分析，筛选出与硬度变化密切相关的差异表达基因模块，挖掘葡萄果实采后品质劣变进程中的核心差异表达转录因子(hub-tfs)——wvwrky31(hub-vvwrky31)。结合实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，rt-qpcr)和双荧光素酶报告系统(dual-luciferase reporter assay system)，进一步明确hub-vvwrky31在葡萄果实采后品质劣变过程中起关键作用的转录因子及其作用机制。
25.优选地，所述葡萄为巨峰葡萄。
26.叶酸在调节葡萄果实采后过氧化氢含量和过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性方面的应用，所述调节为降低葡萄果实采后过氧化氢含量和升高相关酶活性。
27.优选地，所述葡萄为巨峰葡萄。
28.使用叶酸处理液处理采后
‘
巨峰’葡萄，经检测其h2o2含量显著降低，过氧化氢酶活性(catalase，cat)，超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase，sod)，过氧化物酶活性(peroxidase，pod)显著升高。
附图说明
29.图1为本发明实施例1中fa处理对采后
‘
巨峰’葡萄品质的影响；
30.图2为本发明实施例1中fa处理对采后
‘
巨峰’葡萄活性氧代谢的影响；
31.图3为本发明实施例1中加权基因共表达网络分析(wgcna分析)和基因注释；
32.图4为本发明实施例1中核心转录因子(hub-tfs)的鉴定与分析；
33.图5为本发明实施例1中hub-vvwrky31的瞬时表达及功能分析；
34.图6为本发明实施例1中载体构建和双荧光素酶报告基因检测。
具体实施方式
35.以下是结合具体实施例对本发明做出的详细描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以了解本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改(这些改变和修改均应包含在本发明的保护范围之内)，以使其适用各种研究用途和实验条件。
36.实施例1叶酸在延缓葡萄果实采后品质劣变方面的应用
37.本实施例的叶酸在延缓葡萄果实采后品质劣变方面的应用，通过对采后
‘
巨峰’葡萄进行叶酸(folic acid，fa)和对照(h2o，即ck)处理，测定浆果的采后品质相关指标，并通过基于转录组测序的wgcna分析，将转录组分析获得的差异表达基因(differential expressed genes，degs)与浆果硬度变化进行相关性分析，筛选出与硬度变化密切相关的差异表达基因模块，挖掘葡萄果实采后品质劣变进程中的核心差异表达转录因子(hub-tfs)——wvwrky31(hub-vvwrky31)。具体操作步骤如下：
38.1、
‘
巨峰’葡萄的采后处理与样品采集
39.于商业采收期采集
‘
巨峰’葡萄(vitis vinifera cv.
‘
kyoho’)，选取果穗大小和果实颜色一致的葡萄进行处理。配置1mg/l fa溶液(含0.01％silwet_l-77)，以水为对照(ck)，将上述果穗在溶液中浸泡15min。随后放入保鲜盒，用保鲜膜覆盖，保存于25
±
1℃的贮藏室。从处理后第3、6、9天随机采集ck和fa处理的果实，用液氮充分冷冻后于-80℃保存，用于后续分析和实验。
40.2、fa处理对采后
‘
巨峰’葡萄品质的影响
41.统计果实落粒个数，计算落粒率；以收获后鲜重为起点，以各处理减重占起始鲜重的百分比计算失水率。随机选取ck和fa处理的葡萄果实30粒(每个处理设置3个重复，每个处理10粒果实)，用硬度计(fhm-5)(takemura electric work,ltd.,tokyo,japan)测量沿赤道线的三个等距点测定浆果硬度。用手持式糖度计(atc-32)测定葡萄汁中的可溶性固形物(total soluble solid，tss)含量。
42.结果如图1所示，采后随着贮藏时间的延长，果实落粒率和失水率逐渐升高，浆果硬度显著下降。fa处理组的落果率(图1a，图1b)和失水率(图1b)均明显低于ck组，而浆果硬度(图1b)明显高于ck组，说明fa处理能够有效延缓果实采后品质劣变。
43.3、fa处理对采后
‘
巨峰’葡萄活性氧代谢的影响
44.精确称取样品，进行各个处理果实中h2o2含量，过氧化氢酶活性(catalase，cat)、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase，sod)、过氧化物酶活性(peroxidase，pod)测定(具体测定方法参见曹建康、姜微波主编，果蔬采后生理生化实验指导.2017年.北京：中国轻工业出版)。同时利用荧光定量pcr对ros相关基因的表达量进行检测。
45.结果如图2所示，fa处理果实中，h2o2含量显著降低，过氧化氢酶活性(catalase，
cat)，超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase，sod)，过氧化物酶活性(peroxidase，pod)显著升高；对应地，fa处理显著降低ros生成基因vvrboh的表达，有效提高ros清除系统相关基因(vvcat、vvsod和vvpod)的表达。
46.4、fa和ck处理采后葡萄果实转录组分析
47.对实施例1所述样品进行转录组测序和基因差异表达分析。结果如图3所示，由图3a和3b可以看出，从ck_vs_fa(处理后3、6、9天)比较组合中分别鉴定到507、684和250个差异表达基因(differentially expressed genes，degs)。
48.基因本体论(gene ontology，go)和基因集富集分析(gene set enrichment analysis，gsea)结果表明，fa处理引起葡萄果实中“细胞过程”、“细胞组分或生物发生”、“细胞壁”和“细胞功能”相关基因的差异表达，结果如图3所示(图3c)。
49.5、核心转录因子(hub-tfs)的鉴定与分析
50.将转录组分析获得的degs与浆果硬度变化进行wgcna分析，显示这些degs被归类到6个模块，分别为“meturquoise”，“meblue”，“megreen”，“mebrown”，“meyellow”，“megrey”，结果如图3所示(图3a)，其中
‘
meyellow’模块中的基因与浆果硬度变化显著相关，从该模块中的degs中筛选出了核心转录因子——hub-vvwrky，进一步对葡萄wrkys进行聚类和表达模式分析，最终确定vvwrky31转录因子为hub-tf，结果如图4所示。基于此，对葡萄果实采后品质劣变进程中的hub-tf进行挖掘和后续分析。
51.6、hub-vvwrky31的瞬时表达及功能分析
52.利用同源重组法构建hub-vvwrky31的过表达载体，进行烟草叶片和葡萄果实切片的瞬时过表达，氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride，nbt)染色和rt-qpcr结果显示，瞬时过表达vvwrky31能够显著提高h2o2含量和vvrboh基因的表达水平，结果如图5所示。上述研究结果显示hub-vvwrky31在ros产生过程中发挥了重要功能。
53.7、fa通过hub-vvwrky31调控h2o2产生基因vvrboh延缓葡萄采后品质劣变
54.hub-vvwrky31转录因子的瞬时过表达表型显示，vvwrky31能够显著提高h2o2含量和vvrboh基因的表达水平，h2o2产生基因vvrboh可能是hub-vvwrky31转录因子的直接靶标基因，二者之间存在潜在的调控关系。因此，对h2o2产生基因vvrboh启动子的顺式作用元件和转录因子结合位点进行了分析。
55.启动子顺式作用元件分析(利用plant cis-acting regulatory elements，plantcare在线分析软件，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)结果显示，vvrboh基因启动子存在一个wrky转录因子结合位点——w-box顺式作用元件，推测hub-vvwrky31可能通过与vvrboh基因启动子区的w-box相互结合，从而对vvrboh基因进行表达调控。
56.为进一步验证分析结果，以62-sk-vvwrky31为效应载体，luc0800-provvrboh为报告载体，结果如图6所示(图6b)，参照hellens等(2005)的方法将效应载体和报告载体共转化至本氏烟草(nicotiana benthamiana l.)叶片中，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega，e1910)进行检测。
57.检测结果显示，vvwrky31能够结合启动子中的w-box元件并上调vvrboh基因的表达，结果如图6所示(图6c)。基于上述结果提出了fa延缓
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巨峰’葡萄果实采后品质劣变的调控机制，即fa通过hub-vvwrky31调控h2o2产生基因vvrboh，降低活性氧含量及活性氧引起的
不利影响，进而延缓葡萄采后品质劣变，结果如图6所示(图6d)。
58.综上，对采后
‘
巨峰’葡萄进行fa处理，具有能够有效延缓葡萄采后品质劣变的效果。以基于转录组测序的wgcna筛选出核心转录调控因子为特点，具有计算效率高、准确性高等优点。另一方面，结合实rt-qpcr、瞬时转化实验、nbt染色和双荧光素酶报告系统，进一步确证在葡萄果实采后品质劣变过程中起关键作用的转录因子。
59.本实施例中叶酸处理液中叶酸浓度为1.5mg/l或2mg/l或3mg/l，silwet_l-77的体积分数为0.02％或0.03％或0.04％或0.05％，叶酸处理液处理的时间为20min或25min或30min，均能达到实施例1中所述的效果。
60.实施例2叶酸在调节葡萄果实采后过氧化氢含量和相关酶活性方面的应用
61.本实施例的叶酸在调节葡萄果实采后过氧化氢含量和相关酶活性方面的应用，相关酶为为过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶，fa处理果实中，h2o2含量显著降低，过氧化氢酶活性(catalase，cat)，超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase，sod)，过氧化物酶活性(peroxidase，pod)显著升高，具体实施步骤见实施例1步骤3中。
62.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。