婴幼儿食品和特殊膳食用食品中母乳低聚糖的检测方法与流程

1.本发明涉及母乳低聚糖检测技术领域，具体地说是婴幼儿食品和特殊膳食用食品中母乳低聚糖的检测方法。


背景技术：

2.母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，hmos)是人类母乳中的第三丰富的固体组分，仅次于脂肪和乳糖。其具有重要的生物学功能，不仅能调节免疫，帮助大脑发育，调节肠道菌群，还有助于婴幼儿生长发育。母乳与婴幼儿食品和特殊膳食用食品的一个最大差异是母乳中含有结构复杂、浓度高的母乳低聚糖。因此，建立母乳低聚糖的检测方法，是开发更加营养健康的婴幼儿食品和特殊膳食用食品的主要保障(通常母乳低聚糖只添加在婴幼儿食品和特殊膳食用食品中)。
3.特殊膳食用食品是为满足某些特殊人群的生理需要，或某些疾病患者的营养需要，按特殊配方而专门加工的食品。这类食品的成分或成分含量，应与可类比的普通食品有显著不同。特殊膳食用食品需具备两个条件:第一，某一种或某一类食品最适宜特定(特殊)人群食用，如婴儿、幼儿、糖尿病患者、严重缺乏某些营养素的人等。这类人群由于生理原因，需要的膳食结构与一般人群的膳食结构有明显区别。第二，为这类人群制作的食品与可类比的普通食品的营养成分有显著不同，有些营养素含量很低或很高。如无母乳喂养的婴儿需要的婴儿配方乳粉，其营养成分和含量与成年人食用的乳粉有显著不同。两个条件同时具备，才能称为特殊膳食用食品。
4.目前，已经发展了多种母乳低聚糖的样品预处理方法，对母乳中的母乳低聚糖进行分析。例如，采用阴离子交换色谱结合脉冲安培法和基于荧光基团衍生的亲水液相色谱结合荧光检测两种方法，对婴儿配方奶粉中2-岩藻糖基乳糖(2'-fl)和乳糖-n-新四糖(lnnt)进行检测，但是其前处理方法复杂繁琐，色谱检测灵敏度低、易受干扰；又如公告号为cn113686992a专利申请中，公开了检测配方食品中目标母乳低聚糖的方法，该方法采用液质串联来检测，检测限达到了ppm级，但使用了易制爆且有毒的硼氢化钠作为还原剂，实验步骤复杂且危险，因此，现有的母乳低聚糖的检测方法需要进一步改进。


技术实现要素：

5.本发明之目的是弥补上述之不足，向社会公开一种简便高效安全、准确度高、适用范围广的婴幼儿食品和特殊膳食用食品中母乳低聚糖的检测方法。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种婴幼儿食品和特殊膳食用食品中母乳低聚糖的检测方法，包括以下步骤：
8.步骤一、将待测的液体样品或复溶后的固体样品加水稀释并定容，混匀后，转移到离心管中并超声；
9.步骤二、取稀释后的溶液，加入阿拉伯三糖作为内标，再加入carrez i溶液和carrez ii溶液用于沉淀蛋白质；
10.步骤三、高速离心后，将上层清液过膜，制得净化液，待上机分析；
11.步骤四、采用液相色谱-质谱串联系统对制得的净化液进行检测：采用两种流动相：流动相a为体积比为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为按照体积比配置0.1％的甲酸水溶液：乙腈＝7:3；采用如下分离梯度进行分离：0％-17％流动相b，分离0.5min；17％-20％流动相b，分离0.5min；20％-23％流动相b，分离6.5min；24％-26％流动相b，分离4.5min；26％-46％流动相b，分离2min；46％-100％流动相b，分离7.5min；100％-0％流动相b，分离3.5min；质谱采用负离子多反应监测模式采集数据，2-岩藻糖基乳糖定量离子对532.895/324.27m/z；2-岩藻糖基乳糖定性离子对532.895/408.37m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖定量离子对548.967/112.90m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖定性离子对548.967/502.48m/z；乳糖-n-新四糖定量离子对706.231/178.03m/z；乳糖-n-新四糖定性离子对706.231/262.02m/z；阿拉伯三糖定量离子对458.704/190.23m/z；阿拉伯三糖定性离子对458.704/413.09m/z。
12.进一步优化本技术方案的措施是：
13.作为改进，所述的步骤一中，超声提取的条件为超声频率60hz-120 hz，提取10min-30min。
14.作为改进，所述的复溶后的固体样品中，固体样品的质量与水的体积的比例为1g:4-20ml。
15.作为改进，所述的步骤一中，稀释并定容的过程为，取1g待测的液体样品或复溶后的固体样品至10ml-100ml容量瓶中，并用水定容。
16.作为改进，所述的步骤二中，加入内标的量为5μg-20μg，加入carrez i溶液和carrez ii溶液的体积比为1:1，稀释后的溶液与carrez i溶液的体积比为1:0.5-4。
17.作为改进，所述的步骤三中，高速离心的条件为离心转速10000rpm-15000rpm，时间5min-20min。
18.本发明与现有技术相比的优点是：
19.本发明无需进行荧光基团衍生，无需使用易制爆且有毒硼氢化钠进行还原，操作步骤简便安全；另外，在提取溶液中加入不被人体吸收的非母乳低聚糖——阿拉伯三糖作为内标，采用内标法检测，提高目标物——hmos检测的准确度。本发明的检测方法可以应用于各种婴幼儿食品和特殊膳食用食品，简便高效安全、准确度高、适用范围广。
附图说明
20.图1是本发明检测加标为4mg/100g的阴性液态奶中2'-fl的定量离子通道。
21.图2是本发明检测加标为4mg/100g的阴性液态奶中3'-gl的定量离子通道。
22.图3是本发明检测加标为4mg/100g的阴性液态奶中lnnt的定量离子通道。
具体实施方式
23.下面结合附图进一步详细描述本发明：
24.一种婴幼儿食品和特殊膳食用食品中母乳低聚糖的检测方法，包括以下步骤：
25.步骤一、将待测的液体样品或复溶后的固体样品加水稀释并定容，混匀后，转移到离心管中并超声，超声提取的条件为频率60hz-120 hz，提取10min-30min。所述的复溶后的固体样品中，固体样品的质量与水的体积的比例为1g:4-20ml。稀释并定容的过程为，取1g
待测的液体样品或复溶后的固体样品至10ml-100ml容量瓶中，并用水定容。
26.步骤二、取稀释后的溶液，加入阿拉伯三糖作为内标，再加入carrez i溶液和carrez ii溶液用于沉淀蛋白质。加入内标的量为5μg-20μg，加入carrez i溶液和carrez ii溶液的体积比为1:1，稀释后的溶液与carrez i溶液的体积比为1:0.5-4。
27.步骤三、高速离心后，将上层清液过膜，制得净化液，待上机分析。高速离心的条件为离心转速10000rpm-15000rpm，时间5min-20min。
28.步骤四、采用液相色谱-质谱串联系统对制得的净化液进行检测，其具体过程为采用两种流动相：流动相a为体积比为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为0.1％的甲酸水溶液：乙腈＝7:3(体积比)；采用如下分离梯度进行分离：0％-17％流动相b，分离0.5min；17％-20％流动相b，分离0.5min；20％-23％流动相b，分离6.5min；24％-26％流动相b，分离4.5min；26％-46％流动相b，分离2min；46％-100％流动相b，分离7.5min；100％-0％流动相b，分离3.5min；质谱采用负离子多反应监测模式采集数据，2-岩藻糖基乳糖(2'-fl)定量离子对532.895/324.27m/z；2-岩藻糖基乳糖定性离子对532.895/408.37m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖(3'-gl)定量离子对548.967/112.90m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖定性离子对548.967/502.48m/z；乳糖-n-新四糖(lnnt)定量离子对706.231/178.03m/z；乳糖-n-新四糖定性离子对706.231/262.02m/z；阿拉伯三糖(atr)定量离子对458.704/190.23m/z；阿拉伯三糖定性离子对458.704/413.09m/z。
29.待测样品为婴幼儿食品和特殊膳食用食品，可以是液体含水溶液形式、固体形式、或者固体-液体混合物形式；待测样品的用量一般为1g。
30.下面通过具体的实施例来进一步阐述本发明：
31.实施例1
32.称取均匀的液态奶1g(精确至0.01g)至10ml容量瓶中，对添加了4mg/100g、20mg/100g、40mg/100g母乳低聚糖标准工作液的阴性样品进行实验。用水定容，涡旋混匀，转移至离心管并超声30min(60hz)。
33.取2.5ml稀释后的溶液，加入5μg内标(阿拉伯三糖)、10ml carrez i溶液和10ml carrez ii溶液，用水定容至25ml，混匀。
34.将溶液转移到离心管中并以10000rpm高速离心20min。取上清液过0.22μm滤膜，制得净化液，待上机分析。
35.采用液相色谱-质谱串联系统对上述得到的净化液进行检测，具体过程为：采用两种流动相：流动相a为体积比为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为0.1％的甲酸水溶液：乙腈＝7:3(体积比)；采用如下分离梯度进行分离：0％-17％流动相b，分离0.5min；17％-20％流动相b，分离0.5min；20％-23％流动相b，分离6.5min；24％-26％流动相b，分离4.5min；26％-46％流动相b，分离2min；46％-100％流动相b，分离7.5min；100％-0％流动相b，分离3.5min；质谱采用负离子多反应监测模式采集数据，2-岩藻糖基乳糖(2'-fl)定量离子对532.895/324.27m/z；2-岩藻糖基乳糖定性离子对532.895/408.37m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖(3'-gl)定量离子对548.967/112.90m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖定性离子对548.967/502.48m/z；乳糖-n-新四糖(lnnt)定量离子对706.231/178.03m/z；乳糖-n-新四糖定性离子对706.231/262.02m/z；阿拉伯三糖(atr)定量离子对458.704/190.23m/z；阿拉伯三糖定性离子对458.704/413.09m/z。利用数据处理软件对质谱采集的数据进行分析，得到结果如
图1、图2和图3所示。
36.将得到的数据信息进行统计分析，结果如表1所示。
37.表1
[0038][0039]
从表1中可以看出，液态奶中，2-岩藻糖基乳糖、β-1,3-半乳糖基乳糖和乳糖-n-新四糖的加标回收率平均值为96％-104％，rsd小于7％，检测回收率和准确度达到检测要求。
[0040]
实施例2
[0041]
称取均匀的豆基粉1g(精确至0.01g)，加入4g水复溶，混匀。
[0042]
取1g稀释后复溶溶液至100ml容量瓶中，对添加了4mg/100g、20mg/100g、40mg/100g母乳低聚糖标准工作液的阴性样品进行实验。用水定容，涡旋混匀，转移至离心管并超声30min(120hz)。
[0043]
取5ml稀释后的溶液，加入20μg内标(阿拉伯三糖)、2.5ml carrez i溶液和2.5ml carrez ii溶液，用水定容至20ml，混匀。
[0044]
将溶液转移到离心管中并以15000rpm高速离心5min。取上清液过0.22μm滤膜，制得净化液，待上机分析。
[0045]
采用液相色谱-质谱串联系统对上述得到的净化液进行检测，具体过程为：采用两种流动相：流动相a为体积比为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为0.1％的甲酸水溶液：乙腈＝7:3(体积比)；采用如下分离梯度进行分离：0％-17％流动相b，分离0.5min；17％-20％流动相b，分离0.5min；20％-23％流动相b，分离6.5min；24％-26％流动相b，分离4.5min；26％-46％流动相b，分离2min；46％-100％流动相b，分离7.5min；100％-0％流动相b，分离3.5min；质谱采用负离子多反应监测模式采集数据，2-岩藻糖基乳糖(2'-fl)定量离子对532.895/324.27m/z；2-岩藻糖基乳糖定性离子对532.895/408.37m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖(3'-gl)定量离子对548.967/112.90m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖定性离子对548.967/502.48m/z；乳糖-n-新四糖(lnnt)定量离子对706.231/178.03m/z；乳糖-n-新四糖定性离子对706.231/262.02m/z；阿拉伯三糖(atr)定量离子对458.704/190.23m/z；阿拉伯三糖定
性离子对458.704/413.09m/z。
[0046]
将得到的数据信息进行统计分析，结果如表2所示。
[0047]
表2
[0048][0049]
从表2中可以看出，豆基粉中，2-岩藻糖基乳糖、β-1,3-半乳糖基乳糖和乳糖-n-新四糖的加标回收率平均值为92％-105％，rsd小于8％，检测回收率和准确度达到检测要求。
[0050]
实施例3
[0051]
称取均匀的婴儿配方奶粉1g(精确至0.01g)，加入20g水复溶，混匀。
[0052]
取1g稀释后复溶溶液至25ml容量瓶中，对添加了4mg/100g、20mg/100g、40mg/100g母乳低聚糖标准工作液的阴性样品进行实验。用水定容，涡旋混匀，转移至离心管并超声10min(120hz)。
[0053]
取2.5ml稀释后的溶液，加入10μg内标(阿拉伯三糖)、2.5ml carrez i溶液和2.5ml carrez ii溶液，用水定容至10ml，混匀。
[0054]
将溶液转移到离心管中并以12000rpm高速离心10min。取上清液过0.22μm滤膜，制得净化液，待上机分析。
[0055]
采用液相色谱-质谱串联系统对上述得到的净化液进行检测，具体过程为：采用两种流动相：流动相a为体积比为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为0.1％的甲酸水溶液：乙腈＝7:3(体积比)；采用如下分离梯度进行分离：0％-17％流动相b，分离0.5min；17％-20％流动相b，分离0.5min；20％-23％流动相b，分离6.5min；24％-26％流动相b，分离4.5min；26％-46％流动相b，分离2min；46％-100％流动相b，分离7.5min；100％-0％流动相b，分离3.5min；质谱采用负离子多反应监测模式采集数据，2-岩藻糖基乳糖(2'-fl)定量离子对532.895/324.27m/z；2-岩藻糖基乳糖定性离子对532.895/408.37m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖(3'-gl)定量离子对548.967/112.90m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖定性离子对548.967/502.48m/z；乳糖-n-新四糖(lnnt)定量离子对706.231/178.03m/z；乳糖-n-新四糖定性离子对706.231/262.02m/z；阿拉伯三糖(atr)定量离子对458.704/190.23m/z；阿拉伯三糖定
性离子对458.704/413.09m/z。
[0056]
将得到的数据信息进行统计分析，结果如表3所示。
[0057]
表3
[0058][0059]
从表3中可以看出，婴儿配方奶粉中，2-岩藻糖基乳糖、β-1,3-半乳糖基乳糖和乳糖-n-新四糖的加标回收率平均值为92％-105％，rsd小于6％，检测回收率和准确度达到检测要求。
[0060]
实施例4
[0061]
称取均匀的特殊医学用途配方食品1g(精确至0.01g)，加入8g水复溶，混匀。
[0062]
取1g稀释后复溶溶液至20ml容量瓶中，对添加了4mg/100g、20mg/100g、40mg/100g母乳低聚糖标准工作液的阴性样品进行实验。用水定容，涡旋混匀，转移至离心管并超声20min(60hz)。
[0063]
取2.5ml稀释后的溶液，加入10μg内标(阿拉伯三糖)、5ml carrez i溶液和5ml carrez ii溶液，用水定容至20ml，混匀。
[0064]
将溶液转移到离心管中并以10000rpm高速离心15min。取上清液过0.22μm滤膜，制得净化液，待上机分析。
[0065]
采用液相色谱-质谱串联系统对上述得到的净化液进行检测，具体过程为：采用两种流动相：流动相a为体积比为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为0.1％的甲酸水溶液：乙腈＝7:3(体积比)；采用如下分离梯度进行分离：0％-17％流动相b，分离0.5min；17％-20％流动相b，分离0.5min；20％-23％流动相b，分离6.5min；24％-26％流动相b，分离4.5min；26％-46％流动相b，分离2min；46％-100％流动相b，分离7.5min；100％-0％流动相b，分离3.5min；质谱采用负离子多反应监测模式采集数据，2-岩藻糖基乳糖(2'-fl)定量离子对532.895/324.27m/z；2-岩藻糖基乳糖定性离子对532.895/408.37m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖(3'-gl)定量离子对548.967/112.90m/z；β-1,3-半乳糖基乳糖定性离子对548.967/502.48m/z；乳糖-n-新四糖(lnnt)定量离子对706.231/178.03m/z；乳糖-n-新四糖定性离
子对706.231/262.02m/z；阿拉伯三糖(atr)定量离子对458.704/190.23m/z；阿拉伯三糖定性离子对458.704/413.09m/z。
[0066]
将得到的数据信息进行统计分析，结果如表4所示。
[0067]
表4
[0068][0069]
从表4中可以看出，婴儿配方奶粉中，2-岩藻糖基乳糖、β-1,3-半乳糖基乳糖和乳糖-n-新四糖的加标回收率平均值为92％-105％，rsd小于6％，检测回收率和准确度达到检测要求。
[0070]
本发明采用内标法检测，在提取溶液中加入不被人体吸收的非母乳低聚糖——阿拉伯三糖作为内标，如果没加内标，那在提取过程中的损失会导致回收率低，测量值与真实值之间存在偏差，加入内标后，在提取过程中的损失就不会产生影响，回收率接近100％，测量值更接近真实值，能够有效提高目标物——hmos检测的准确度。