一种柔性导电神经支架及其制备方法与流程

1.本发明涉及功能高分子材料技术领域，具体的说涉及一种柔性导电神经支架及其制备方法。


背景技术：

2.目前，各种车祸、战创伤导致的神经损伤依然是临床上亟需解决的难题，严重影响着患者的生活质量。自体神经移植被认为是修复缺损神经的金标准，但自体神经来源有限。近年来，组织工程与生物材料的发展为神经修复提供了新的方法。神经元是电兴奋细胞，神经轴突主要依靠电信号去传递相关信号。另外，大量的研究证实电刺激能够促进周围神经的修复和再生。因此，有关导电材料促进神经再生的设计不断被提出，如专利cn105920672a采用将导电材料聚吡咯复合进聚乳酸-聚己内酯纤维膜上，构建导电神经导管，用于传递电信号，促进神经修复。但这种导电导管具有坚硬的内壁结构，不利于细胞黏附，生长和功能的发挥。再如专利cn107474265a，描述了一种以聚乙烯醇为原料构建的导电水凝胶，但这种导电水凝胶制备过程中需加入甘油和氯化钠，构建的是高机械强度的导电水凝胶，这种水凝胶对细胞是否产生毒性犹未可知，且其高机械强度(mpa级)的特性与机械强度较弱的神经(kpa级)相差较大。这也限制了其在神经领域应用。再如专利cn107149699a描述了一种基于聚吡咯的一种导电水凝胶，但水凝胶其选用海藻酸钠，海藻酸钠的交联主要依靠钙离子的作用形成凝胶。因为交联剂钙离子也是液体，使得其操作起来相对麻烦。因此，目前急需设计并制备一种导电性能良好，机械性能仿生，且操作方便的导电神经支架，用于修复神经缺损。
3.但是，现有的导电神经支架常将导电材料复合进导电神经导管中，其导电导管坚硬的内壁不利于细胞的黏附，增殖和功能的发挥。且神经细胞均生活在三维的细胞外基质中，该结构不够仿生。还有一些材料构建了导电水凝胶，但水凝胶的机械强度无法达到正常神经的机械强度。另外，有些材料的交联方式较为复杂，交联的程度和方式不易掌控。
4.因此，提供一种可复合各种神经细胞，用于修复包括颅脑、脊髓、周围神经等在内的各种神经损伤的高分子化合物柔性导电神经支架及其制备方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种高分子化合物柔性导电神经支架及其制备方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种柔性导电神经支架的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)合成高分子化合物甲基丙烯酸酐化明胶：将明胶加入水中配制成明胶溶液，随后在45-55℃、200-300rmp下搅拌直至明胶完全溶解；然后将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，将溶液在45-55℃下继续搅拌2-3h，将所得甲基丙烯酸酐-明胶溶液稀释，准备透析膜，将稀释的溶液注入至透析膜中，在40-50℃的水浴中，400-600rmp搅拌透析，将透析出的溶
液放入-80℃下2-3d后，对其进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸酐化明胶，备用；
9.(2)制备碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液：将甲基丙烯酸酐化明胶加入至离心管中，并加水，然后进行水浴加热溶解形成甲基丙烯酸酐化明胶溶液；将碳纳米管加入到甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，然后在超声探头下充分混匀，得到碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液；
10.(3)光交联：避光下，向碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液中加入光引发剂，用移液枪移出500μl溶液至模具中，置于光交联紫外光源上交联30-50s，固化形成高分子混合物碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶，即为柔性导电神经支架。
11.甲基丙烯酸酐化明胶是一种在明胶上修饰了甲基丙烯酸酐基团的高分子化合物，属于一种明胶衍生物。该水凝胶在紫外光下产生共价键，进而被交联成透明的水凝胶。该水凝胶中含有大量的精氨酸甘氨酸天冬氨酸序列和基质金属蛋白酶，这些物质被证实十分适合细胞的黏附、增殖和功能的发挥。且该水凝胶可以通过调节自身浓度及光照交联时间来改变其机械性能，有报道成其机械性能变化范围为5-110kpa。碳纳米管是一种新型组织工程导电材料，具有导电率高、易于化学修饰、生物毒性低、和细胞粘附能力等特点。
12.碳纳米管的骨架结构主要是由碳原子组成的六边形蜂窝状结构，碳原子的p电子形成大范围的离域π键，由于共轭效应显著，故而其导电性较好。基于以上特质，碳纳米管被应用在各种组织修复的研究中。如专利cn102614032构建了一种基于碳纳米管的神经移植体，用于培养细胞，使神经细胞形成神经网络。该专利是将碳纳米管结构进行悬空设置，随后在表面进行亲水物质涂层，从而使得碳纳米管具有亲水性。但该方法培养的细胞是二维贴壁培养的，且碳纳米管表面的机械强度仍是高于神经本身。这些构造不够仿生。
13.因此，在本发明中将碳纳米管复合进甲基丙烯酸酐化明胶，通过光交联的方式构建一种导电神经支架，属于高分子化合物材料。该神经支架的构建操作相对简单，无需特殊工具。通过相关参数优化，该导电神经支架展现出良好的导电性能，且机械性能贴近正常神经，其水凝胶的状态具有良好的生物相容性，为神经细胞的黏附，增殖和功能发挥提供很好的平台。
14.进一步，步骤(1)中所述明胶溶液的的制备方法为10g明胶加入至100ml水中得到10％(w/v)的明胶溶液；
15.所述甲基丙烯酸酐的体积与明胶的质量比为8ml:10g。
16.所述甲基丙烯酸酐-明胶溶液的稀释方法为将所得甲基丙烯酸酐-明胶溶液加入至100ml水中。
17.采用上述进一步方案的有益效果在于：本发明限定比例可使甲基丙烯酸酐充分与明胶结合，防止过剩或者不足。
18.步骤(1)中所述透析膜内径22mm，截留分子量为10kda；透析时间为4-5d，且每4-5h更换一次水浴中的水。
19.采用上述进一步方案的有益效果在于：上述操作能将未结合的带毒性的甲基丙烯酸酐透析出去，降低产品毒性。
20.步骤(1)中所述冷冻干燥方法为-80℃，130
×
10-3
mbar下冷冻干燥5d；
21.采用上述进一步方案的有益效果在于：通过冷冻干燥可将液体水凝胶制作成固体，既保证了该水凝胶的结构完整性，又方便携带和储存，更方便使用。
22.进一步，步骤(2)中所述甲基丙烯酸酐化明胶与水的质量比为0.3:3；
23.所述甲基丙烯酸酐化明胶与碳纳米管的质量比为300:3。
24.进一步，步骤(2)中所述所述水浴加热温度为60-65℃，水浴加热时间为10-30min；
25.所述超声探头超声次数为3次，超声功率为300w，每次超声时间为20-30min。
26.采用上述进一步方案的有益效果在于：使碳纳米管与甲基丙烯酸酐化明胶溶液最大限度的混合。
27.进一步，步骤(3)中所述甲基丙烯酸酐化明胶的质量与光引发剂的体积比为1mg:1μl。
28.采用上述进一步方案的有益效果在于：上述操作可使甲基丙烯酸酐化明胶与光引发剂能够充分混合，在紫外灯的照射下发生交联。
29.进一步，步骤(3)中还包括雪旺细胞或神经元细胞的培养：体外培养雪旺细胞或神经元细胞，将其接种至细胞培养皿中，每2-3天换液，选用第3-5代雪旺细胞或5-7天的神经元细胞，将雪旺细胞或者神经元离心，重悬至1.5ml培养基中，随后将该培养基与碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液混匀，随后向混匀的溶液中加入光引发剂，用移液枪移出适量溶液至模具中，置于光交联紫外光源上交联相应时间，固化形成复合细胞的碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶，即为柔性导电神经支架。
30.采用上述进一步方案的有益效果在于：本发明的导电神经支架材料复合进雪旺细胞或者神经元细胞或者神经干细胞或者嗅鞘细胞等，将其应用在颅脑、脊髓、周围神经的损伤中。为颅脑、脊髓、周围神经损伤的修复提供适宜的电生理微环境，从而达到修复神经的目的。
31.更进一步，所述培养基为neurobasal培养基。
32.采用上述进一步方案的有益效果在于：神经细胞为一类特殊细胞，对培养液要求较为严格，本发明采用的培养基能给神经细胞提供充足的营养，有利于其生长。
33.更进一步，步骤(3)中所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂。
34.本发明的有益效果在于：本发明制备导电神经支架材料，包括导电材料碳纳米管和高分子化合物甲基丙烯酸酐化明胶。本发明通过将碳纳米管复合进甲基丙烯酸酐化明胶溶液可构建导电性能良好的水凝胶材料，加入光引发剂后，通过紫外光照可使其固化。该支架材料可复合各种神经细胞，用于修复包括颅脑、脊髓、周围神经等在内的各种神经损伤。
附图说明
35.图1为碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶交联前与交联后对比图；
36.图2为不同浓度碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶大体观；
37.图3为不同浓度碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶扫描电镜图片(a-d低倍，e-h高倍)；
38.图4为碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电神经支架培养雪旺细胞扫描电镜图片；
39.图5为碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电神经支架培养神经元细胞扫描电镜图片。
40.图6为不同浓度碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶导电率。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.在本发明下面实施例中采用的光引发剂均为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂。
43.实施例1
44.一种柔性导电神经支架的制备方法，包括以下步骤：
45.(1)合成高分子化合物甲基丙烯酸酐化明胶：将10g明胶加入100ml去离子水中50℃、240rmp下搅拌直至明胶完全溶解，形成10％(w/v)的明胶溶液；然后将8ml甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，将溶液在继续搅拌2h，将所得甲基丙烯酸酐-明胶溶液加入至100ml去离子水中，准备22mm，截留分子量为10kda的透析膜，将稀释的溶液注入至透析膜中，50℃水浴中，500rmp透析4d(透析时每5h换一次透析水浴)，将透析出的溶液放入-80℃下2d后，-80℃，130
×
10-3
mbar下对其进行冷冻干燥5d，得到甲基丙烯酸酐化明胶，备用；
46.(2)制备碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液：将300mg甲基丙烯酸酐化明胶加入至离心管中，并加3ml水，然后60℃水浴加热10min溶解形成甲基丙烯酸酐化明胶溶液；将3mg碳纳米管加入到甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，然后在超声探头下300w下超声3次(每次20min)充分混匀，得到碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液；
47.(3)光交联：避光下，向碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液中加入300μl光引发剂，用移液枪移出500μl溶液至模具中，置于光交联紫外光源上交联30s，固化形成高分子混合物碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶，即为柔性导电神经支架。
48.实施例2
49.一种柔性导电神经支架的制备方法，包括以下步骤：
50.(1)合成高分子化合物甲基丙烯酸酐化明胶：将10g明胶加入100ml去离子水中50℃、240rmp下搅拌直至明胶完全溶解，形成10％(w/v)的明胶溶液；然后将8ml甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，将溶液在继续搅拌2h，将所得甲基丙烯酸酐-明胶溶液加入至100ml去离子水中，准备22mm，截留分子量为10kda的透析膜，将稀释的溶液注入至透析膜中，40℃水浴中，500rmp透析5d(透析时每5h换一次透析水浴)，将透析出的溶液放入-80℃下2d后，-80℃，130
×
10-3
mbar下对其进行冷冻干燥5d，得到甲基丙烯酸酐化明胶，备用；
51.(2)制备碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液：将300mg甲基丙烯酸酐化明胶加入至离心管中，并加3ml水，然后65℃水浴加热10min溶解形成甲基丙烯酸酐化明胶溶液；将3mg碳纳米管加入到甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，然后在超声探头下300w超声3次(每次20min)充分混匀，得到碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液；
52.(3)雪旺细胞或神经元细胞的培养：体外培养雪旺细胞，将其接种至细胞培养皿中，每3天换液，选用第4代雪旺细胞；
53.(4)光交联：将雪旺细胞离心重悬至1.5mlneurobasal培养基中，随后将该培养基与碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液混匀，随后向混匀的溶液中加入300μl光引发剂，用移液枪移出500μl溶液至模具中，置于光交联紫外光源上交联30s，固化形成复合细胞的碳
纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶，即为柔性导电神经支架。
54.实施例3
55.一种柔性导电神经支架的制备方法：
56.(1)合成高分子化合物甲基丙烯酸酐化明胶：10g明胶加入至100ml水中得到10％(w/v)的明胶溶液，随后在55℃、200rmp下搅拌直至明胶完全溶解；然后将8ml甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，将溶液在55℃下继续搅拌2h，将所得甲基丙烯酸酐-明胶溶液加入至100ml去离子水中，准备22mm，截留分子量为10kda的透析膜，将稀释的溶液注入至透析膜中，40℃水浴中，600rmp透析4d(透析时每5h换一次透析水浴)，将透析出的溶液放入-80℃下3d后，-80℃，130
×
10-3
mbar下对其进行冷冻干燥5d，得到甲基丙烯酸酐化明胶，备用；
57.(2)制备碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液：将300mg甲基丙烯酸酐化明胶加入至离心管中，并加3ml水，然后60℃水浴加热30min溶解形成甲基丙烯酸酐化明胶溶液；将3mg碳纳米管加入到甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，然后在超声探头下300w超声3次(每次30min)充分混匀，得到碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液；
58.(3)光交联：避光下，向碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液中加入300μl光引发剂，用移液枪移出500μl溶液至模具中，置于光交联紫外光源上交联30s，固化形成高分子混合物碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶，即为柔性导电神经支架。
59.实施例4
60.一种柔性导电神经支架的制备方法：
61.(1)合成高分子化合物甲基丙烯酸酐化明胶：10g明胶加入至100ml水中得到10％(w/v)的明胶溶液，随后在45℃、300rmp下搅拌直至明胶完全溶解；然后将8ml甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，将溶液在45℃下继续搅拌3h，将所得甲基丙烯酸酐-明胶溶液加入至100ml去离子水中，准备22mm，截留分子量为10kda的透析膜，将稀释的溶液注入至透析膜中，50℃水浴中，400rmp透析5d(透析时每4h换一次透析水浴)，将透析出的溶液放入-80℃下2-3d后，-80℃，130
×
10-3
mbar下对其进行冷冻干燥5d，得到甲基丙烯酸酐化明胶，备用；
62.(2)制备碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液：将300mg甲基丙烯酸酐化明胶加入至离心管中，并加3ml水，然后65℃水浴加热10min溶解形成甲基丙烯酸酐化明胶溶液；将3mg碳纳米管加入到甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，然后在超声探头下300w超声3次(每次20min)充分混匀，得到碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液；
63.(3)光交联：避光下，向碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液中加入300μl光引发剂，用移液枪移出500μl溶液至模具中，置于光交联紫外光源上交联50s，固化形成高分子混合物碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶，即为柔性导电神经支架。
64.实施例5
65.一种柔性导电神经支架的制备方法：
66.(1)合成高分子化合物甲基丙烯酸酐化明胶：10g明胶加入至100ml水中得到10％(w/v)的明胶溶液，随后在50℃、260rmp下搅拌直至明胶完全溶解；然后将8ml甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，将溶液在50℃下继续搅拌2.5h，将所得甲基丙烯酸酐-明胶溶液加入至100ml去离子水中，准备22mm，截留分子量为10kda的透析膜，将稀释的溶液注入至透析膜中，45℃水浴中，500rmp透析4.5d(透析时每4h换一次透析水浴)，将透析出的溶液放入-80℃下2d后，-80℃，130
×
10-3
mbar下对其进行冷冻干燥5d，得到甲基丙烯酸酐化明胶，备用；
67.(2)制备碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液：将300mg甲基丙烯酸酐化明胶加入至离心管中，并加3ml水，然后62℃水浴加热20min溶解形成甲基丙烯酸酐化明胶溶液；将3mg碳纳米管加入到甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，然后在超声探头下300w超声3次(每次250min)充分混匀，得到碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液；
68.(3)雪旺细胞或神经元细胞的培养：体外培养神经元细胞，将其接种至细胞培养皿中，每2天换液，选用6天的神经元细胞；
69.(4)光交联：将神经元离心重悬至1.5mlneurobasal培养基中，随后将该培养基与碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶溶液混匀，随后向混匀的溶液中加入300μl光引发剂，用移液枪移出500μl溶液至模具中，置于光交联紫外光源上交联40s，固化形成复合细胞的碳纳米管-甲基丙烯酸酐化明胶导电水凝胶，即为柔性导电神经支架。
70.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。