NK细胞诱导培养基及其培养方法与流程

nk细胞诱导培养基及其培养方法
技术领域
1.本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种nk细胞诱导培养基及nk细胞培养方法。


背景技术：

2.肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。
3.肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法；其中，自体免疫细胞治疗技术，比如，nk细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗，且副作用小，不损伤正常组织。
4.nk细胞，又称自然杀伤细胞（natural killer cell），nk细胞是除t、b细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键子集，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。


技术实现要素：

5.基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种nk细胞诱导培养基及培养方法。
6.本发明提供的技术方之一如下：一种nk细胞诱导培养基，包含581培养基及浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨。
7.在一实施例中，该诱导培养基包含浓度1~5ug/ml的氟达拉滨。
8.本发明提供的技术方之二如下：一种nk细胞快速扩增的培养方法，包括如下步骤：第0天：首先，往培养瓶a和培养瓶b中分别接种1
×
107~6
×
107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶a加入10~40ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶b加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为10~40ml，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的il-15、浓度10~50ng/ml的il-18、浓度500~2000u/ml的il-2及581培养基；最后，将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养；第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶a中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为80~600ml；第9天：收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为100~500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的il-15、浓度10~50ng/ml的il-18、浓度500~2000u/ml的il-2及581培养基；第11天：往培养瓶中加入600~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500
~2000u/ml的il-2，浓度5~20ng/ml的il-21及581培养基；第13天：往培养瓶中加入800~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000u/ml的il-2，浓度5~20ng/ml的il-21及581培养基；第16天：停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的nk细胞。
9.另一实施例， nk细胞快速扩增的培养方法包括如下步骤：第0天：首先，往培养瓶a和培养瓶b中分别接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶a加入15~35ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶b加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为15~35ml，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的il-15、浓度15~30ng/ml的il-18、浓度800~1500u/ml的il-2及581培养基；最后，将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养；第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶a分别往培养瓶a中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为100~550ml；第9天：收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为200~400ml；其中，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的il-15、浓度15~30ng/ml的il-18、浓度800~1500u/ml的il-2及581培养基；第11天：往培养瓶中加入700~1000ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500u/ml的il-2，浓度8~15ng/ml的il-21及581培养基；第13天：往培养瓶中加入900~1100ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500u的il-2，浓度8~15ng/ml的il-21及581培养基；第16天：停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的nk细胞。
10.本发明提供的nk培养方法；相对于现有技术，具有如下有点：1、诱导培养基中，成分氟达拉滨在外周血单个核细胞培养中，可以诱导nk细胞快速扩增，同时对t细胞及其他免疫细胞又有抑制扩增效果，并培养到第8天，nk细胞数量获得集群优势，以确保nk细胞快速扩增培养，16天培养周期，nk细胞数量可扩增2000~4000倍；2、氟达拉滨诱导单个核细胞培养的nk细胞，有效nk细胞活率达到92%以上。
11.3、本发明nk细胞培养，采用培养瓶a和b分开实现诱导培养和扩增培养，有利于nk细胞快速扩增生长，且培养工艺简单、无需包被、操作方便。
附图说明
12.图1为实施例1至6中nk细胞和t细胞分别对应的生长曲线图；图2为实施例1中nk细胞培养16天后的cd3-cd56 表型检测图；图3为实施例2中nk细胞培养16天后的cd3-cd56 表型检测图；图4为实施例3中nk细胞培养16天后的cd3-cd56 表型检测图；图5为实施例4中nk细胞培养16天后的cd3-cd56 表型检测图；图6为实施例5中nk细胞培养16天后的cd3-cd56 表型检测图；
图7为实施例6中nk细胞培养16天后的cd3-cd56 表型检测图。
具体实施方式
13.本发明提供的一种采用外周血培养nk细胞的快速扩增培养方法，具体培养如下：1、获取单个核细胞（pbmc）采集志愿者外周血，抽取80ml血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞。血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境上速冻15min，离心1500g，30分钟，得到清澈的血浆，保存于2~8℃环境；全血细胞与生理盐水1:1稀释后，按1:2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30分钟，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞pbmc，备用；2、nk细胞培养2.1、细胞培养第0天；2.1.1、准备洁净、消毒处理的非tc t75培养瓶，标识号分别为a和b；2.1.2、取1
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107~6
×
107个/ml的单个核细胞分别置于培养瓶a和b中进行接种处理；2.1.3、培养瓶a中加入10~40ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；2.1.4、培养瓶b中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积数为10~40ml；其中，激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的il-15、浓度10~50ng/ml的il-18、浓度500~2000u/ml的il-2及581培养基。
14.2.1.5、将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养。
15.2.2、细胞培养第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶a中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为80~600ml；2.3、细胞培养第9天：收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为100~500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的il-15、浓度10~50ng/ml的il-18、浓度500~2000u/ml的il-2及581培养基；2.4、细胞培养第11天：往培养瓶b中加入600~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000u/ml的il-2，浓度5~20ng/ml的il-21及581培养基；2.5细胞培养第13天：往培养瓶b中加入800~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000u/ml的il-2，浓度5~20ng/ml的il-21及581培养基；2.6、细胞培养第16天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的nk细胞。
16.较好地，在一实施例中，nk细胞培养，还可以采用如下工艺步骤：第0天：首先，往培养瓶a和培养瓶b中分别接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶a加入15~35ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶b加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为15~35ml，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的il-15、浓度15~30ng/ml的il-18、浓度800~1500u/ml的
il-2及581培养基；最后，将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养；第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶a分别往培养瓶a中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为100~550ml；第9天：收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为200~400ml；其中，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的il-15、浓度15~30ng/ml的il-18、浓度800~1500u/ml的il-2及581培养基；第11天：往培养瓶中加入700~1000ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500u/ml的il-2，浓度8~15ng/ml的il-21及581培养基；第13天：往培养瓶中加入900~1100ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500u的il-2，浓度8~15ng/ml的il-21及581培养基。
17.下面通过一些具体实施例来进一步说明。
18.一、nk细胞制备下述各实施例中，单个核细胞接种数量均为5
×
107个/ml。当然，也是可以是1
×
107个/ml、2
×
107个/ml、4
×
107个/ml、6
×
107个/ml或3
×
107个/ml等。
19.实施例11、细胞培养第0天1.1、准备两个非tc的t75培养瓶，分别标识a和b；1.2、分别往培养瓶a和培养瓶b中接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶a中加入25ml诱导培养基，该培养基包含浓度2ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶b中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为25ml，且激活培养基中包含浓度20ng/ml 的il-15、浓度20ng/ml的il-18、浓度1000u/ml的il-2及581培养基；1.3、将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养。
20.2、细胞培养第3至第7天2.1、细胞培养第3天，培养瓶a中补液诱导培养基后控制培养瓶a中总体积为150ml；2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为200ml；2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
21.3、细胞培养第9天3.1、收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；3.2、将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基15v/v%的自体灭活血浆体积为300ml；其中，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml 的il-15、浓度20ng/ml的il-18、浓度1000u/ml的il-2及581培养基。
22.4、细胞培养第11天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为2000ml，且该扩增培
养基中包含浓度1000u/ml的il-2、浓度10ng/ml的il-21及581培养基。
23.5、细胞培养第13天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度1000u的il-2、浓度10ng/ml的il-21及581培养基。
24.6、细胞培养第16天停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得nk细胞。
25.实施例21、细胞培养第0天1.1、准备两个非tc的t75培养瓶，分别标识a和b；1.2、分别往培养瓶a和培养瓶b中接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶a中加入10ml诱导培养基，该培养基包含浓度0.1ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶b中加入激活培养基和10v/v%的自体灭活血浆体积为10ml，且激活培养基中包含浓度10ng/ml 的il-15、浓度10ng/ml的il-18、浓度500u/ml的il-2及581培养基；1.3、将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养。
26.2、细胞培养第3至第7天2.1、细胞培养第3天，培养瓶a中补液诱导培养基后控制培养瓶a中总体积为80ml；2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为300ml；2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
27.3、细胞培养第9天3.1、收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；3.2、将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基20v/v%的自体灭活血浆体积为100ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10ng/ml 的il-15、浓度10ng/ml的il-18、浓度500u/ml的il-2及581培养基。
28.4、细胞培养第11天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度500u/ml的il-2、浓度5ng/ml的il-21及581培养基。
29.5、细胞培养第13天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度500u的il-2、浓度5ng/ml的il-21及581培养基。
30.6、细胞培养第16天停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得nk细胞。
31.实施例3
1、细胞培养第0天1.1、准备两个非tc的t75培养瓶，分别标识a和b；1.2、分别往培养瓶a和培养瓶b中接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶a中加入50ml诱导培养基，该培养基包含浓度10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶b中加入激活培养基和20v/v%的自体灭活血浆体积为40ml，且激活培养基中包含浓度50ng/ml 的il-15、浓度50ng/ml的il-18、浓度2000u/ml的il-2及581培养基；1.3、将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养。
32.2、细胞培养第3至第7天2.1、细胞培养第3天，培养瓶a中补液诱导培养基后控制培养瓶a中总体积为300ml；2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为400ml；2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为600ml，继续细胞培养。
33.3、细胞培养第9天3.1、收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；3.2、将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基20v/v%的自体灭活血浆体积为500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度50ng/ml 的il-15、浓度50ng/ml的il-18、浓度2000u/ml的il-2及581培养基。
34.4、细胞培养第11天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度2000u/ml的il-2、浓度20ng/ml的il-21及581培养基。
35.5、细胞培养第13天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度2000u的il-2、浓度20ng/ml的il-21及581培养基。
36.6、细胞培养第16天停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得nk细胞。
37.实施例41、细胞培养第0天1.1、准备两个非tc的t75培养瓶，分别标识a和b；1.2、分别往培养瓶a和培养瓶b中接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶a中加入35ml诱导培养基，该培养基包含浓度5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶b中加入激活培养基和20v/v%的自体灭活血浆体积为35ml，且激活培养基中包含浓度30ng/ml 的il-15、浓度30ng/ml的il-18、浓度1500u/ml的il-2及581培养基；1.3、将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养。
38.2、细胞培养第3至第7天2.1、细胞培养第3天，培养瓶a中补液诱导培养基后控制培养瓶a中总体积为100ml；2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为350ml；2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为550ml，继续细胞培养。
39.3、细胞培养第9天3.1、收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；3.2、将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基20v/v%的自体灭活血浆体积为400ml；其中，激活培养基中包含浓度30ng/ml 的il-15、浓度30ng/ml的il-18、浓度1500u/ml的il-2及581培养基。
40.4、细胞培养第11天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度2000u/ml的il-2、浓度15ng/ml的il-21及581培养基。
41.5、细胞培养第13天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度2000u的il-2、浓度15ng/ml的il-21及581培养基。
42.6、细胞培养第16天停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得nk细胞。
43.实施例51、细胞培养第0天1.1、准备两个非tc的t75培养瓶，分别标识a和b；1.2、分别往培养瓶a和培养瓶b中接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶a中加入15ml诱导培养基，该培养基包含浓度1ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶b中加入激活培养基和10v/v%的自体灭活血浆体积为15ml，且激活培养基中包含浓度15ng/ml 的il-15、浓度15ng/ml的il-18、浓度800u/ml的il-2及581培养基；1.3、将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养。
44.2、细胞培养第3至第7天2.1、细胞培养第3天，培养瓶a中补液诱导培养基后控制培养瓶a中总体积为120ml；2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为250ml；2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
45.3、细胞培养第9天3.1、收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去
诱导培养基；3.2、将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基10v/v%的自体灭活血浆体积为200ml；其中，激活培养基中包含浓度15ng/ml 的il-15、浓度15ng/ml的il-18、浓度800u/ml的il-2及581培养基。
46.4、细胞培养第11天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度800u/ml的il-2、浓度8ng/ml的il-21及581培养基。
47.5、细胞培养第13天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度800u的il-2、浓度8ng/ml的il-21及581培养基。
48.6、细胞培养第16天停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得nk细胞。
49.实施例61、细胞培养第0天1.1、准备两个非tc的t75培养瓶，分别标识a和b；1.2、分别往培养瓶a和培养瓶b中接种5
×
107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶a中加入25ml 581培养基；培养瓶b中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为25ml，且激活培养基中包含浓度20ng/ml 的il-15、浓度20ng/ml的il-18、浓度1000u/ml的il-2及581培养基；1.3、将培养瓶a和b分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%co2的培养箱中，进行细胞培养。
50.2、细胞培养第3至第7天2.1、细胞培养第3天，培养瓶a中补液诱导培养基后控制培养瓶a中总体积为150ml；2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为200ml；2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
51.3、细胞培养第9天3.1、收集培养瓶a中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；3.2、将培养瓶a中收集的细胞加入到培养瓶b中，并往培养瓶b中加入激活培养基15v/v%的自体灭活血浆体积为300ml；其中，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml 的il-15、浓度20ng/ml的il-18、浓度1000u/ml的il-2及581培养基。
52.4、细胞培养第11天往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度1000u/ml的il-2、浓度10ng/ml的il-21及581培养基。
53.5、细胞培养第13天
往培养瓶b中加入扩增培养基补液后控制培养瓶b中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度1000u的il-2、浓度10ng/ml的il-21及581培养基。
54.6、细胞培养第16天停止细胞培养，收集培养瓶b中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得nk细胞。
55.二、nk细胞检测1、细胞培养生长计数统计图1为实施例1至6中单个核细胞培养16天，nk细胞与t细胞的生长曲线图；其中：图1中，虚线表示n细胞生长曲线；实线表示t细胞生长曲线；1-nk表示实施例1中nk细胞、1-t表示实施例1中t细胞，其他依次类推；采用流式细胞计数仪计数细胞数量；实施例6的细胞培养过程中，第0天至第7天，诱导培养基中均未添加氟达拉滨组分。
56.实施例1至6接种的单个核细胞中所拥有的nk和t细胞，分别按照nk细胞10%、t细胞70%计算；第0天初始nk和t细胞分别是：nk细胞为0.5
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107个/ml、t细胞为3.5
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107个/ml。
57.表1为图1各实施例中对应曲线细胞生长数量。
58.表1 各实施例中nk、t细胞统计数量，（
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107个/ml）由图1和表1可知，实施例1至5中，诱导培养基中含有组分氟达拉滨时，单个核细胞在第9天前培养过程中，nk细胞生长速度较快，容易形成nk细胞集群优势，而t细胞虽然在初始细胞数量中占有绝对优势，但在氟达拉滨组分的抑制作用下，t细胞生长缓慢，慢慢失去了t细胞集群优势，如从第5天至第9天，nk细胞数量为t细胞数量6~8倍；因此，导致细胞扩增培养时，t细胞也不占有集群生长优势，相应地，nk细胞由于前期培养占有集群优势，后期发展得到迅速扩增生长；16天培养周期，nk细胞数量可扩增2000~4000倍。实施例6中，诱导培养基中无组分氟达拉滨时，由于t细胞在初始状态就占有集群优势，所以t细胞在16天培养中，获得快速扩增，而nk细胞则被抑制生长了。
59.2、nk细胞活率检测 将实施例1至6中的nk细胞进行台盼蓝染色，放入18~25℃下保存4小时后，用流式细胞计数仪进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率，如表2。
60.表2 细胞数和细胞活率表
从表2中可以看出，实施例1至5的nk细胞数量及细胞活率，都高于实施例6，也就说明nk诱导培养基质成分氟达拉滨可以提升nk细胞扩增速率，且细胞活率也超出临床应用标准规定的细胞活率（≥90%）。
61.3、nk细胞免疫表型检测图2至7分别对应实施例1至6的nk细胞培养第16天的cd3-cd56 表型检测图。
62.第16天，分别取实施例1至6培养的nk细胞，制成细胞悬液并调整细胞终浓度为1
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106个/ml，加入标记的cd3-cd56 单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，测试结果，如图2至7所示的nk细胞表型分析图。
63.由图2至7说明，实施例1至5中培养的nk细胞中cd3-cd56 细胞比例分别是88.37%、85.55%、87.79%、83.84%、84.37%，比实施例6的nk细胞在cd3-cd56 的含量（25.32%）分别高出63.05%、60.25%、62.48%、58.52%、59.05%，且实施例1至5的nk细胞中cd3-cd56 细胞比例均已超过临床应用标准（≥60%）；说明nk诱导培养基质成分氟达拉滨可以提升nk细胞的纯度。
64.应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。