基于二氧化锰纳米花和碱性磷酸酶的双酶级联反应调控金纳米棒刻蚀检测有机磷农药的方法与流程

1.本发明涉及纳米材料学和检测技术领域，具体涉及基于二氧化锰纳米花和碱性磷酸酶的双酶级联反应调控金纳米棒刻蚀检测有机磷农药的方法。


背景技术：

2.有机磷农药(ops)具备药效高、广谱、成本低、种类多等优点，较为普遍的应用于除草、杀虫及杀菌等农业生产。以一种具备高毒性的有机磷农药tr为例，tr作为杀螨剂或杀虫剂用于全世界的农业领域，有经济和高效的性能。利用tr防治害虫对农业生产有巨大的经济效益，但这种有机磷遇碱会水解成敌敌畏，其毒性增大了10倍，2017年世界卫生组织将tr纳入3类致癌物名单。因该类农药本身毒性较高，若使用不当，容易通过皮肤渗透或食用动物可食性组织导致中毒导致中毒。此外，人类长期暴露于低剂量的ops，可引起人体肿瘤发生、肌肉功能障碍和不良的生殖等影响。所以，迫切需要制定有效的方法来监测和检测食物中低剂量的ops，以保证食品安全和人类健康。
3.可视化检测具有检测和读数简单、省时省力、对仪器要求很低的优势，因此被广泛用于现场检测，在检测各种分析物方面受到密切关注。据报道，大多数传统的比色检测是基于有机染料与有机染料探针相互作用，通常会受到灵敏度低以及可用分析物数量少的限制，因此大多消光系数低，检测受到很大的限制。相较而言，贵金属纳米材料如金和银纳米材料，消光系数极高，在可见光区域消光系数比有机染料高1000倍，具有高灵敏度，可至纳米级甚至更小级别。故而贵金属纳米材料在可视化检测方面凸显出巨大潜力。现今已报道了许多关于贵金属等离子纳米材料的可视化检测文献，其中基于各向异性的等离子体纳米材料如金纳米棒(aunrs)和金纳米双锥(aunps)，基于局域表面等离子共振，通过改变形状和长径比能产生丰富的颜色变化，被广泛应用在可视化检测中。而aunps材料合成复杂且产量低，故aunrs成为优先选择。
4.在目前已有的报道中，基于贵金属纳米材料聚集的比色法的信号容易受到环境和样本的干扰而难以辨别，应用范围小。而基于贵金属纳米材料刻蚀的比色法对环境和样本的抗干扰性强、信号稳定、颜色多样，非常契合比色传感器的构筑要求。目前通过乙酰胆碱酯酶对有机磷农药进行可视化检测的方法较为成熟，一类是乙酰胆碱酯酶的单酶检测，另一类是乙酰胆碱酯酶-胆碱氧化酶的双生物酶检测。但相对于精密仪器检测方法，采用乙酰胆碱酯酶的可视化检测的灵敏度不高，仍是需要不断改进的地方。因此构建一种兼具高灵敏度、读数简单的比色传感方法用于日常生活中的食品安全检测具有非常高价值的研究和应用意义。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种基于二氧化锰纳米花和碱性磷酸酶的双酶级联反应调控金纳米棒刻蚀检测有机磷农药的方法，裸眼可识别、操作方便、显色快速、灵敏度高、颜色变化丰
富，可实现ops的可视化即时检测，在日常生活的食品安全检测中应用前景广泛。
6.具体采用的技术方案如下：
7.一种基于二氧化锰纳米花和碱性磷酸酶的双酶级联反应调控金纳米棒刻蚀检测有机磷农药的方法，包括以下步骤：
8.步骤(1)：在十六烷基三甲基溴化铵ctab中加入氯金酸haucl4、硝酸银agno3、抗坏血酸aa、盐酸hcl和金纳米种子溶液，使金纳米种子生长为金纳米棒aunrs；所述金纳米棒aunrs的长径比为3～4：1；
9.步骤(2)：以高锰酸钾kmno4、聚乙烯吡咯烷酮pvp和hcl为原料合成二氧化锰纳米花mno
2 nfs；所述二氧化锰纳米花mno
2 nfs的尺寸为150～400nm；
10.步骤(3)：在dea缓冲溶液体系中，将样品预处理液和碱性磷酸酶alp溶液混合后孵育催化l-抗坏血酸-2-磷酸aap还原生成aa，得到混合溶液；
11.步骤(4)：在含有ctab的hac-naac缓冲溶液体系中，加入步骤(3)所得的混合溶液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺tmb溶液和步骤(2)所得的mno
2 nfs，再加入hcl和步骤(1)所得的aunrs进行孵育，发生氧化还原反应调控aunrs的刻蚀；利用紫外分光光度计测量aunrs吸收光谱，观察记录颜色结果，完成对样品预处理液中有机磷农药ops的检测。
12.作为优选，步骤(3)中，dea缓冲体系的ph值为8～10，dea缓冲液、alp溶液、aap溶液和样品预处理液的体积比为1～3：1：1：1，更优选为1：1：1：1。
13.作为优选，步骤(3)中，alp溶液和aap溶液的浓度比为10～15u/l：1mm。
14.作为优选，步骤(3)中，孵育温度为35～40℃，孵育时间为20～40min，更优选为孵育温度37℃。
15.作为优选，步骤(4)中，hac/naac缓冲体系的ph值为4～5，ctab的浓度为0.1～0.3m。
16.作为优选，步骤(4)中hac/naac缓冲液、步骤(3)所得的混合溶液、tmb溶液、mno
2 nfs、hcl溶液和aunrs的体积比为89:5:5:1:15:25，mno
2 nfs溶液的浓度为1～2mg/ml。
17.作为优选，步骤(4)中，孵育温度为35～40℃，孵育时间为2～5min，更优选为孵育温度37℃，孵育时间2.5min。
18.本发明的原理为：mno
2 nfs是一种类氧化物酶，并具有强氧化性，可催化水中的溶解氧生成超氧自由基，利用超氧自由基去氧化tmb生成tmb

，在酸性环境下进一步氧化tmb

生成的tmb
2
可以有效的刻蚀金棒，对aunrs的形状和尺寸产生影响，这导致aunrs纵向lspr消光峰发生蓝移，向短波方向移动，同时溶液的颜色也会发生显著变化，从一开始的褐色变为、灰色、墨绿色、青蓝色、蓝色和最终的靛蓝色。而alp催化aap脱磷生成的aa具有强还原性，优先与mno
2 nfs反应并将mno2nfs还原成二价锰离子，减少了tmb
2
的生成，进而抑制aunrs刻蚀。而ops的存在又会在一定程度上抑制alp的催化活性，最终促进aunrs的刻蚀。通过分步调控ctab浓度、alp浓度、aap浓度以及孵育时间来建立ops浓度和aunrs刻蚀的正向关系模型。
19.步骤(1)中，所述的aunrs溶液采用经典的种子介导法，以haucl4、agno3、aa、nabh4、hcl和十六烷基三甲基氯化铵为原料制备得到。
20.aunrs的长径比决定了其纵向局部表面等离振子共振(lspr)消光峰发生蓝移的最大量程，长径比越大lspr消光峰蓝移的范围越大，颜色变化越丰富，步骤(1)中，aunrs的
lspr消光峰在紫外光谱图中位于710～720nm。调控上述范围内的aunrs的刻蚀，能够实现对ops的高灵敏可视化检测。
21.步骤(2)中，mno
2 nfs是一种类氧化物酶，具有的强催化性能在本发明中有至关重要的作用，mno
2 nfs的催化性能越强，生成的超氧自由基越多，越易使tmb氧化。
22.步骤(3)中，alp催化aap脱磷生成的aa具有强还原性，优先与mno
2 nfs反应并将mno
2 nfs还原成二价锰离子，减少了tmb
2
的生成，进而抑制aunrs刻蚀。而样品预处理液中ops的存在又会在一定程度上抑制alp的催化活性，最终促进aunrs的刻蚀。
23.步骤(4)中，ops优选为高毒性、用量大的敌百虫tr；mno
2 nfs具有强氧化性，可催化水中的溶解氧生成超氧自由基，利用超氧自由基去氧化tmb生成tmb

，在酸性环境下进一步氧化tmb

生成的tmb
2
可以有效的刻蚀金棒，对aunrs的形状和尺寸产生影响，这导致aunrs纵向lspr消光峰发生蓝移，同时溶液的颜色也会发生显著变化。
24.本发明方法能够作为多色比色传感器应用，加入待测液后即可使用，刻蚀后进行紫外光谱测量并拍摄保存图片，根据纵向lspr峰位移变化能够计算得到待测溶液中ops的含量。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
26.(1)本发明利用mno
2 nfs和alp的双酶级联反应，调控aunrs刻蚀，使aunrs的纵向lspr峰发生蓝移，并产生丰富的颜色变化，可实现ops的可视化检测，在灵敏度和稳定性方面都有明显提升，在日常食品安全的即时检测领域应用前景广泛。
27.(2)本发明采用的是二氧化锰纳米花mno
2 nfs，相较于传统的二氧化锰纳米片，纳米花是三维材料，比表面积更大，活性位点更多，灵敏度更高，因此二氧化锰的用量更少，相对的其他药品的用量也能够减少，降低了检测限。
28.(3)本发明方法具有无需借助仪器、结果裸眼可视、操作简单、检测时间快、反应灵敏、颜色变化丰富等优点，可用于ops的现场即时检测。
附图说明
29.图1为基于mno
2 nfs和alp的双酶级联反应调控aunrs刻蚀检测ops的高灵敏可视化方法的原理流程图。
30.图2为实施例1制得的aunrs溶液的tem图片，标尺为200nm。
31.图3为实施例1制得的aunrs溶液的紫外光谱。
32.图4为实施例1制得的mno
2 nfs的sem图片和tem图片，其中a是sem图片，b是tem图片。
33.图5为实施例1中不同浓度的tr对aunrs纵向lspr峰位移影响图。
34.图6为实施例1中不同浓度的tr与au nrs因被刻蚀产生的lspr峰位移变化之间的关系及线性拟合图。
35.图7为实施例1中不同浓度的tr影响aunrs刻蚀的颜色变化图。
36.图8为应用例1中不同浓度的tr对aunrs纵向lspr峰位移影响图。
具体实施方式
37.下面通过实施例对本发明进行详细描述。
38.本发明提供一种基于二氧化锰纳米花和碱性磷酸酶的双酶级联反应调控金纳米棒刻蚀检测有机磷农药的方法，具体实施步骤如下：
39.(1)aunrs溶液的制备
40.在十六烷基三甲基溴化铵ctab中加入氯金酸haucl4、硝酸银agno3、抗坏血酸aa、盐酸hcl和金纳米种子，使金纳米种子生长为金纳米棒aunrs；得到的aunrs的长径比为3～4：1，纵向lspr峰在720～770nm处；
41.(2)mno
2 nfs的制备
42.以高锰酸钾kmno4、聚乙烯吡咯烷酮pvp和hcl为原料合成二氧化锰纳米花mno
2 nfs；得到的mno
2 nfs的直径为150～400nm；
43.(3)基于au nrs刻蚀的比色法检测tr
44.在本发明实施例中，ops优选为高毒性、用量大的敌百虫tr。
45.在ph为8～10的dea缓冲溶液体系中，将样品预处理液、浓度为20mm的底物l-抗坏血酸-2-磷酸aap溶液和浓度为200～300u/l碱性磷酸酶alp溶液混合后，在35～40℃条件下孵育20～40min，得到混合溶液；其中dea缓冲液、alp溶液、aap溶液和样品预处理液的体积比为1～3：1：1：1；
46.在含有0.1～0.3m ctab的ph为4～5的hac-naac缓冲溶液体系中，加入混合溶液、浓度为5mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺tmb溶液和浓度为1～2mg/ml的mno2nfs，再加入浓度为2m的hcl和aunrs，在35～40℃条件下孵育2～5min，发生氧化还原反应调控aunrs的刻蚀；利用紫外分光光度计测量金纳米棒吸收光谱，观察记录颜色结果，完成对样品预处理液中有机磷农药ops的检测；其中hac/naac缓冲液、混合溶液、tmb溶液、mno
2 nfs、hcl溶液和aunrs的体积比为89:5:5:1:15:25。
47.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
48.实施例1
49.本发明原理如图1所示。
50.(1)aunrs溶液的制备
51.①
金纳米种子合成过程如下：依次将0.25ml 0.01m的haucl4溶液和0.60ml 0.01m冰水配制的nabh4溶液依次加入到9.75ml 0.10m ctab溶液中，然后在转速1200rpm下剧烈搅拌2分钟。最后将此反应液静置于室温中至少120min以备用。
52.②
aunrs合成过程如下：首先在转速700rpm和27℃水浴条件下依次把6ml 0.01m的haucl4溶液，1.2ml 0.01m的agno3溶液，0.96ml 0.1m的aa溶液和2.4ml 1m hcl溶液加入到120ml 0.10m的ctab溶液中。随后，向混合液中加入120μl的(1)中制备好的金核溶液。三十分钟后，溶液的颜色逐渐变为酒红色，在27℃水浴下静置过夜。将制备好的aunrs在转速8000rpm下离心三次并浓缩到1.4nm左右。
53.得到的aunrs的长径比为3～4：1，tem图如图2所示，紫外光谱图如图3所示，该金纳米棒的纵向lspr峰在720nm处，颜色呈褐色。
54.(2)mno
2 nfs的制备
55.将24ml 0.1m高锰酸钾溶液和2.4ml 26mg/mlpvp混合搅拌，90℃水浴加热条件下
加入24ml 0.2m hcl，并搅拌1h。后静置冷却至室温，将制备好的mno
2 nfs在转速7000rpm下离心三次(10min/次)，去除上清液敞开放入烘箱烘24h。
56.得到的mno
2 nfs的直径为150～250nm，sem图如图4中的a所示，tem图如图4中的b所示。
57.(3)基于aunrs刻蚀的比色法检测tr
58.在本发明实施例中，ops优选为高毒性、用量大的敌百虫tr。
59.本实验所用的缓冲溶液是含有0.1m ctab的ph 4.5hac/naac缓冲液和ph 9.7dea缓冲液。首先，移取25μldea缓冲液至0.5ml离心管中，随后依次加入25μl浓度为300u/l的alp溶液、25μl浓度为20mm的aap溶液和25μl不同浓度的tr溶液(配制浓度为30,40,50,60,80,100,150,200,250,300,350,400mm)，混合均匀，37℃水浴加热条件下孵育30min。
60.再者，移取178μlhac/naac缓冲液至0.5ml离心管中，随后依次加入10μl孵育完成的溶液、10μl含有5mm tmb溶液和2μl1mg/mlmno
2 nfs溶液，混合均匀，37℃水浴加热条件下孵育2.5min。随后加入30ml 2m hcl溶液，37℃水浴加热条件下孵育2.5min。再随后移取50μl离心水洗处理后的aunrs加入到各个离心管中并混合均匀。最后，把终溶液于37℃环境下孵育2.5min后拍照观察，并用紫外分光光度计测紫外可见吸收光谱。
61.不同浓度的tr对aunrs纵向lspr峰位移影响如图5所示。
62.不同浓度的tr与au nrs因被刻蚀产生的lspr峰位移变化之间的关系及线性拟合如图6所示。
63.不同浓度的tr影响aunrs刻蚀的颜色变化如图7所示，随着tr浓度增加，金纳米棒颜色由从一开始的褐色变为灰色、墨绿色、青蓝色、蓝色和最终的靛蓝色。
64.实施例2
65.①
金纳米种子合成过程如下：依次将0.25ml 0.01m的haucl4溶液和0.60ml 0.01m冰水配制的nabh4溶液依次加入到9.75ml 0.1m ctab溶液中，然后在转速1200rpm下剧烈搅拌2min。最后将此反应液静置于室温中至少120min以备用。
66.②
aunrs合成过程如下：首先在转速700rpm和30℃水浴条件下依次把6ml 0.01m的haucl4溶液，1.2ml 0.01m的agno3溶液，0.96ml 0.1m的aa溶液和2.4ml 1m hcl溶液加入到120ml 0.10m的ctab溶液中。随后，向混合液中加入140μl的
①
中制备好的金核溶液。三十分钟后，溶液的颜色逐渐变为酒红色，在30℃水浴下静置过夜。将制备好的aunrs在转速8000rpm下离心三次并浓缩到1.4nm左右。
67.合成得到的aunrs的纵向lspr峰在770nm。
68.③
其他参数和方法与实施例1相同，使用
②
中得到的aunrs溶液进行反应，得到终溶液于37℃环境下孵育2.5min后拍照观察，并用紫外分光光度计测紫外可见吸收光谱。
69.实施例3
70.①
将24ml 0.1m高锰酸钾溶液和2.4ml 32mg/ml pvp混合搅拌，90℃水浴加热条件下加入24ml 0.2m hcl，并搅拌1h。后静置冷却至室温，将制备好的mno
2 nfs在转速7000rpm下离心三次(10min/次)，去除上清液敞开放入烘箱烘24h。
71.合成得到的mno
2 nfs的直径为300～400nm。
72.②
其他参数和方法与实施例1相同，使用
①
中得到的mno
2 nfs溶液进行反应，得到终溶液于37℃环境下孵育2.5min后拍照观察，并用紫外分光光度计测紫外可见吸收光谱。
73.应用例1
74.按照实施例1的实验方法，在步骤(3)时配置终浓度为5μm和10μm的tr溶液以及浓度为100u/l的alp溶液，设置不添加tr的对照组，其他参数与实施例1相同，得到终溶液于37℃环境下孵育2.5min后拍照观察，并用紫外分光光度计测紫外可见吸收光谱。
75.不同浓度的tr对aunrs纵向lspr峰位移影响如图8所示。痕量tr的加入就会对aunrs产生刻蚀，证明本发明具有很高的灵敏度。国标中茶叶水的tr最大残余为7.7μm，本发明可以应用于检测国标以下的浓度。
76.应用例2
77.选择新鲜泡制的茶叶水，并加标40，280，400mm的tr溶液进行检测，为了减少新鲜茶叶水中的复杂物质的干扰，将新鲜茶叶水过滤三次后用ph为4.5的hac-naac缓冲溶液稀释150～200倍，其他参数和方法与实施例1相同，得到终溶液于37℃环境下孵育2.5min后拍照观察，并用紫外分光光度计测紫外可见吸收光谱，计算回收率。
78.新鲜的茶叶水中含有还原性物质茶多酚(gtp)，会增加aunrs的刻蚀程度。因此，通过增大稀释倍数来减少干扰。
79.观察颜色变化结果，浓度40mm时呈褐色，浓度280mm时呈墨绿色，浓度400mm时呈青蓝色，其紫外光谱分析实验结果如表1所示，新鲜茶叶水检测结果与实验结果接近，新鲜茶叶水的回收率在98.5％-104.0％，与加标浓度相比偏差在5％以下，说明该方法构建的比色传感器可用于真实样本的检测，上述实验表明该传感器具有较好的适用性。
80.表1新鲜茶叶水中农药tr的检测结果
[0081][0082]
以上所述的实施例及应用例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。