生物炭耦合协同降解TCC微生物菌剂及其制备方法

生物炭耦合协同降解tcc微生物菌剂及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种应用于tcc污染土壤修复的微生物菌剂及其制备方法和应用。属于土壤修复技术领域。


背景技术：

2.三氯卡班（triclocarban，tcc）作为一种广谱抗菌剂，能高效抑杀多种微生物，广泛应用于肥皂、洗涤剂、化妆品、服装、地毯、油漆、塑料、玩具等产品中，至今已经超过 60 年。由于 tcc 的疏水性和稳定性，使其很容易在地表水、地下水、污泥以及土壤中富集，造成生态环境污染，引起人类健康问题。目前 tcc 已成为自然环境中最普遍监测的污染物之一，并被列为新兴有机污染物。3,4-氯苯胺（3,4-chloroaniline，dca），是常见的苯脲类除草剂及个人护理用品降解产物之一，也是tcc主要降解产物之一，因dca对生态环境产生的负效应，开始受到人们的关注。目前，在土壤中还是在水体中，甚至在农作物和肉食品中都检测到了dca的残留。
3.在自然环境中，细菌很少单独生活，它们与其它微观和宏观有机体共享生态位，形成复杂的多细胞群落，对环境信号作出反应。微生物通过复杂的相互作用，能够改变其个体的生长和代谢特征，维持群落的生态稳定性，提高对污染物的降解效率。相比于自然界中的复合菌群，人工构建的复合菌群在污染物的生物降解过程中具有结构简单、功能稳定、容易控制等优点，且有利于深入研究混培时菌株间互相影响的机制。通过引入混合培养微生物，利用多样的协同代谢方式，使它们的代谢活动对彼此有利，并加快对污染物的降解。
4.目前对土壤中tcc与dca 的去除途径主要集中在吸附技术、膜分离技术、高级氧化技术、生物降解等途径。生物降解是去除有毒有害的有机污染物的有效方法之一，该技术的关键策略是采用微生物将有毒污染物转化为较小或无毒物质。与非生物处理方法相比，生物降解具有效率高、所需成本低、环境友好等特点，并且生物降解在降低污染物浓度的同时还可以保持或恢复土壤质量。
5.生物炭是一种富含碳且多孔的稳定固体材料，由有机物质在限氧条件下的热解过程产生。它是一种优良的土壤改良剂，可增加固碳和土壤肥力，同时提高土壤对污染物的吸附能力，为微生物的生长和功能提供养分。许多研究结果表明，由于生物炭的静电引力作用，使得微生物能固定在生物炭上。此外，由于生物炭含有多种微量元素，而且其含有的溶解性有机质可被微生物利用，从而促进微生物的生长繁殖。


技术实现要素：

6.针对上述存在的问题，本发明提供了一种生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂及其制备方法。该生物炭耦合协同降解微生物菌剂以具有tcc及其降解中间产物dca协同降解能力的两株菌bx2和ly-1为对象，选取秸秆生物炭为固定化载体，采用吸附法，制备具有tcc降解修复能力的固体菌剂，对土壤中tcc具有较高的去除率，选用的秸秆生物炭为固定化载体，经过长时间的腐败，还可增加土壤肥力。
7.为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：首先，本发明提出了一种用于降解土壤中tcc的复合微生物组合物，其特征在于，所述复合微生物组合物包括紫红色红球菌（rhodococcus rhodochrous）bx2菌株和假单胞菌（pseudomonas sp.）ly-1菌株，其中所述的紫红色红球菌（rhodococcus rhodochrous）bx2菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.7411，保藏日期为2013年4月7日，其中所述的假单胞菌（pseudomonas sp.）ly-1菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25941，保藏日期为2022年10月21日。
8.其中，优选的，所述复合微生物组合物中菌株紫红色红球菌（rhodococcus rhodochrous）bx2和假单胞菌（pseudomonas sp.）ly-1的体积比例为3:2。
9.其次，本发明还提出了一种生物炭耦合协同降解tcc 微生物菌剂，所述的微生物菌剂是以生物炭为载体，将本发明所述的复合微生物组合物定植在生物炭的表面上及孔道内形成的。该生物炭可为菌株提供在土壤生长的生长条件和微观环境，以降解土壤中tcc。由生物炭为载体、菌株bx2和ly-1在该生物炭的表面上及孔道内生长，该生物炭吸附土壤中的tcc作为菌株生长的碳源、以生物炭孔道内留存的空气和土壤孔隙中氧为氧源，使降解反应能够持续进行。
10.其中，优选的，所述的微生物菌剂通过以下步骤制备：a、制备生物炭：将生物质玉米秸秆在烘箱中60℃烘干，研磨粉碎过150
µ
m筛，取一定量的过筛生物质放于磁舟中置于管式炉，为保证管式炉内是真空状态，需先向管式炉中通入惰性气体20~30 min，管式炉升温程序为：以10℃/min由室温分别升温至700℃~750℃热解，并保留2 h，以10℃/min由各热解温度分别降至75℃以下，取出避光保存备用；b、制备生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂：选用玉米秸秆生物炭为固定化载体，按照重量比为1:5的比例称取生物炭和菌液，其中bx2和ly-1菌液的体积比为3:2，在转速为160r/min~180r/min下固定化培养9-11 h，制备得到生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂。
11.再次，本发明还提出了一种去除土壤中tcc的方法，包括向受污染土壤中投加本发明所述的微生物菌剂，通过菌株生长、繁育，对土壤中的tcc进行生物强化降解。
12.其中，优选的，所述的方法包括如下步骤：s1：制备本发明所述的生物炭耦合协同降解tcc 微生物菌剂；s2：测定土壤中tcc的浓度及所制备的微生物菌剂的降解率，计算降解所需的微生物菌剂用量；s3：向受污染土壤中投加微生物菌剂，使菌剂上的微生物菌株持续好氧生长8~20 d，使其将土壤中的tcc吸附并降解；s4：测定降解处理后的土壤中tcc的残留量。
13.其中，优选的，所述的步骤s3中，微生物菌剂降解tcc的环境温度为25℃，土壤ph为7。
14.与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明提供的去除土壤中tcc的方法、微生物菌株及微生物菌剂，以具有tcc协
同降解能力的菌株为对象，选取秸秆生物炭为固定化载体，采用吸附法，制备具有tcc降解修复能力的固体菌剂。在本发明中，构建了tcc降解菌bx2和代谢中间产物dca降解菌ly-1协同降解tcc的共培养体系，菌株bx2首先把tcc水解为dca和4-ca，菌株ly-1可利用bx2无法降解的dca，通过代谢分工的形式来克服不利条件，促进了tcc的生物降解和矿化；选用秸秆生物炭为固定化载体，经过长时间的腐败，还可增加土壤肥力。
15.2、本发明将生物炭应用于土壤后带来的好处不仅与其高碳含量有关，而且还依赖于对土壤调理特性。此外，还可以通过提高土壤的阳离子交换能力 (cec)、营养元素的含量、ph和保水能力，吸附有毒重金属，并通过增加根系密度，使得根系逐渐释放有限的养分来作为土壤调节剂。总体来说，具有安全有效，环境友好，处理成本低的优点，可以满足大范围推广应用、低成本、安全可靠的土壤修复的需求。
16.3、与其他单一菌株降解tcc相比，本研究共培养体系中菌株ly-1可以承担对主要降解产物dca及小分子物质的降解功能，减小了dca累积对菌株bx2降解tcc的负反馈作用，进而促进了共培养体系对tcc的降解。
17.4、本发明菌剂对 tcc 的去除方式为生物炭的吸附去除和微生物的生物降解共同发挥作用。在综合考虑去除效率和成本的基础上，对底物浓度为10 mg/kg土壤中tcc去除率可以达到98.2％。
附图说明
18.图1是本发明的秸秆生物炭材料的扫描电镜图（3k倍）；图2是本发明中生物炭与微生物菌剂对tcc的去除以及产物生成图；其中，如图2（a）为生物炭对tcc的去除以及产物生成图；如图2（b）为微生物菌剂对tcc的去除以及产物生成图；图3是本发明的生物炭耦合菌株的扫描电镜图（10k倍）；图4是本发明的生物炭上菌株的扫描电镜图（25k倍）；图5是本发明中不同修复方式对土壤中tcc的降解含量变化图；图6是本发明中菌剂吸附tcc前后的ftir图；图7是本发明中菌剂吸附tcc前后的xps全谱；图8是本发明中菌株bx2降解tcc时tcc与dca浓度变化图；图9是本发明中菌株bx2对不同浓度的dca和4-ca的降解图；图10是本发明中菌株ly-1对不同浓度的tcc和dca的降解图；图11是本发明中协同代谢菌株bx2与ly-1对不同浓度的tcc的降解图。
19.保藏信息：1、菌株名称：bx2分类命名：紫红色红球菌（rhodococcus rhodochrous）保藏编号：cgmcc no.7411保藏日期：2013年4月7日保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
20.2、菌株名称：ly-1
分类命名：假单胞菌（pseudomonas sp.）保藏编号：cgmcc no.25941保藏日期：2022年10月21日保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
21.以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
22.实施例1生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂的制备1、菌株来源紫红色红球菌（rhodococcus rhodochrous）bx2（全基因组 genbank accession number：cp027557），筛选自江苏激素研究所污水处理池污泥，由本实验室筛选获得并保藏，该菌株可以利用 tcc 作为唯一碳源进行生长代谢。所述的bx2菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.7411，保藏日期为2013年4月12日。
23.假单胞菌（pseudomonas sp.）ly-1（全基因组 genbank accession number：cp094353），筛选自黑龙江某农药厂污水处理井污泥，由本实验室筛选获得并保藏，菌株 ly-1 能够以 bx2 降解 tcc 产生的主要中间产物 dca 作为唯一碳源进行生长代谢。所述的ly-1菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25941，保藏日期为2022年10月21日。
24.2、菌株的复壮和扩培菌株在使用其进行土壤中tcc降解前，先使用lb培养基进行复壮和扩培，过程如下：将菌株加入lb培养基，在35℃下、160 r/min转动，扩大培养12 h；所述的lb培养基为：将酵母膏5 g，蛋白胨10 g，nacl 5 g加入到纯水中，定容至1000 ml，调节ph为 7.0。
25.将菌株bx2和ly-1分别在lb培养基中培养至对数期，8000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀用lb培养基重悬，调节od
600nm
=2.0
±
0.1。将菌株bx2和ly-1培养液滴在固体lb培养基上，37℃培养过夜观察菌落生长情况，从菌落生长状况上观察互作菌株之间不存在拮抗作用。
26.3、生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂的制备a、制备生物炭：将生物质玉米秸秆在烘箱中60℃烘干，研磨粉碎过150
µ
m筛，取一定量的过筛生物质放于磁舟中置于管式炉，为保证管式炉内是真空状态，需先向管式炉中通入惰性气体30 min，管式炉升温程序为：以10℃/min由室温分别升温至700℃热解，并保留2 h，以10℃/min由热解温度降至75℃，取出避光存放在不同烧杯中备用。本发明的秸秆生物炭材料的扫描电镜图（3k倍）如图1所示。
27.b、制备生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂：选用玉米秸秆生物炭为固定化载体，按照重量比为1:5的比例称取生物炭和菌液，其中bx2和ly-1菌液的体积比为3:2。在转速为160r/min下固定化培养 9 h，制备完成生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂，备用。
28.本实施例提供的技术方案，重点是先筛选和驯化菌株bx2和ly-1，再将协同降解能力菌株组合物定植（固定化培养）在生物炭的表面上及孔道内形成菌剂，该菌剂为菌株提供在土壤中好氧生长的生长条件和微观环境，以降解土壤中残留的tcc。
29.4、降解效果验证向 100ml 无机盐培养基（nacl 0.2 g，nh4cl 0.2 g，mgso4
·
7h2o 0.04 g，k2hpo4 0.3 g，kh2po4 0.1 g，加蒸馏水至 1.0 l，ph=7.0）中加入一定量 tcc 使其终浓度达到 10 mg/l，随后分别加入培养基重量3%的生物炭（l-tb）和 3%的微生物菌剂（l-tcib），以只含有 10 mg/l tcc 的无机盐培养基作为对照组，通过hplc 检测无机盐培养基中的 tcc 及其代谢产物 dca、4-ca 的残留量。
30.参见图2可知，本实施例采用菌剂l-tcib，与采用传统生物炭l-tb，进行去除土壤中tcc效果对比可知，在相同条件下，采用本发明的菌剂去除效率提升了15%左右。
31.实施例2：生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂的制备1、菌株来源0070同实施例1。
32.2、发酵罐培养复壮扩培将上述协同代谢微生物菌株转接至lb培养基中活化，在35℃的温度条件下，以150r/min的转速摇床震荡培养24h，作为一级种子液使用，按 5wt％的接种量将一级种子液转接至发酵罐中进行放大发酵，培养至对数生长期，获得液体菌剂；3、制备生物炭将生物质玉米秸秆在烘箱中60℃烘干，研磨粉碎过150
µ
m筛，取一定量的过筛生物质放于磁舟中置于管式炉，为保证管式炉内是真空状态，需先向管式炉中通入惰性气体20 min，管式炉升温程序为：以10℃/min由室温分别升温至750℃热解，并保留2 h，以10℃/min由热解温度降至60℃，取出避光存放在不同烧杯中备用。
33.4、生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂的制备选用玉米秸秆生物炭为固定化载体，按照重量比为1:5的比例称取生物炭和菌液，其中bx2和ly-1菌液的体积比为3:2。在转速为180r/min下固定化培养 11h，制备完成生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂，备用。
34.实施例3：生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂去除土壤中tcc的应用1、菌株来源0078同实施例1。
35.2、发酵罐培养复壮扩培同实施例2。
36.3、制备生物炭将生物质玉米秸秆在烘箱中50℃烘干，研磨粉碎过150
µ
m筛，取一定量的过筛生物质放于磁舟中置于管式炉，为保证管式炉内是真空状态，需先向管式炉中通入惰性气体30 min，管式炉升温程序为：以10℃/min由室温分别升温至700℃热解，并保留2 h，以10℃/min由热解温度降至75℃，取出避光存放在不同烧杯中备用。
37.4、生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂的制备选用玉米秸秆生物炭为固定化载体，按照重量比为1:5的比例称取生物炭和菌液，
其中bx2和ly-1菌液的体积比为3:2。在转速为160r/min下固定化培养 9 h，制备完成生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂，备用。
38.5、受污染土壤的接种将300 μl tcc（浓度为10 mg/ml）与30 ml丙酮混合后，加入到称取的30 g风干土壤中，边滴加边搅拌以便于混匀。土壤静置一段时间，待丙酮充分挥发后，将30 g tcc污染土壤与270 g风干土壤混合均匀。每24 h浇水一次以保证土壤中的含水率为25%。试验共设置3个处理组：s-tb组（仅添加生物炭）、s-tbc组（添加游离的微生物与生物炭）、s-tcib组（添加生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂）组以及一个对照组（无任何添加，ck组），每个处理重复三次。分别在0、4、8、12、16、20 d取样。监测污染土壤中tcc残留量的变化。
39.观察图3-图4可知，生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂（图3）投入土壤后，协同代谢菌株在该生物炭的表面上及孔道内生长，该生物炭吸附土壤中的tcc作为菌株生长的碳源、以生物炭孔道内留存的空气及土壤孔隙中氧气为氧源，使降解反应能够持续进行，经过12h后，少量的菌株（图3）就快速生长和裂变，广泛分布在生物炭表面及孔道上（图4），图中近似椭圆形的部分为bx2菌株，近似圆柱形的部分为ly-1菌株，其自然、非均匀的分布在生物炭表面及孔道各处。
40.土壤中tcc残留量的变化如图5，培养20 d后，ck组土壤随着时间推移tcc含量略有降低，与ck组相比，s-tb组、s-tbc组、s-tcib组中tcc的含量均显著降低，其中s-tbc组和s-tcib组的tcc的降解效果更为明显。其中，s-tcib组对tcc的降解效果最佳，最大降解率可达到98.2%。这是因为在s-tcib组中，生物炭可以不仅发挥了吸附作用，还通过固定化手段为降解菌提供合适的定植场所和反应场所，从而更加有利于降解菌发挥降解作用。
41.图6是本发明的生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂吸附tcc前后的ftir图；图7是本发明的生物炭耦合协同降解 tcc 微生物菌剂吸附tcc前后的xps全谱。
42.实施例4 对比实验下面通过对比实验例来证明菌株bx2和ly-1的协同促进作用。
43.实验例1：1、菌株来源菌株 rhodococcus rhodochrous bx2（全基因组 genbank accession number：cp027557），筛选自江苏激素研究所污水处理池污泥，由本实验室筛选获得并保藏，该菌株可以利用 tcc 作为唯一碳源进行生长代谢。所述的rhodococcus rhodochrous bx2菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.7411，保藏日期为2013年4月12日。
44.菌株的复壮和扩培同实施例1。
45.2、单菌株bx2对tcc的降解能力，以及对于降解产物dca和4-ca的影响测试方法为：通过hplc检测菌株bx2降解15 mg/l tcc时，tcc与dca在培养液中的浓度变化。温度30.5℃，ph=7.05，接种量3.42%，培养时间5.36 d。如图8所示，在降解第1 d时，产物dca开始出现；随着tcc的降解，dca浓度逐渐累积，且随着时间的延长呈现升高的趋势，在第7 d代谢dca累积浓度达到3.95 mg/l。在无机盐液体培养基中分别加入不同浓度的dca和4-ca，培养5 d后考察不同初始浓度的dca和4-ca的降解率。如图9所示，随着dca浓度的升高，菌株bx2对其降解率下降，最高降解率为21.4%（1 mg/l）。
46.由此可知，菌株bx2对dca的降解能力较弱。但菌株bx2对不同浓度的4-ca降解情况则与dca不同，在1 mg/l的浓度下，4-ca的降解率达到84.3%，在10 mg/l的浓度下，4-ca的降解率为55.6%，说明菌株bx2对4-ca有较好的降解能力。
47.实验例2：1、菌株来源菌株 pseudomonas sp. ly-1（全基因组 genbank accession number：cp094353），筛选自黑龙江某农药厂污水处理井污泥，由本实验室筛选获得并保藏，菌株 ly-1 能够以 bx2 降解 tcc 产生的主要中间产物 dca 作为唯一碳源进行生长代谢。所述的pseudomonas sp. ly-1菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25941，保藏日期为2022年10月21日。
48.菌株的复壮和扩培同实施例1。
49.2、单菌株ly-1对tcc的降解能力，以及对于降解产物dca的影响测试方法为：在无机盐液体培养基中分别加入不同浓度的tcc和dca，温度35℃，ph=7.0，ly-1菌液接种量4.0%，培养5 d后考察菌株ly-1对不同初始浓度tcc和dca的降解率。如图10所示，菌株ly-1在2 mg/l tcc的浓度下降解率为12.9%，在5 mg/l和10 mg/l浓度下降解率分别为5.7%和1.2%，在15 mg/l浓度下，对tcc几乎没有降解；而菌株ly-1对不同浓度的dca均有较高的降解率，且降解率随浓度升高而降低，在2 mg/l的浓度下，降解率为81.43%，在15 mg/l浓度下，降解率为35.4%。
50.由此可知，菌株ly-1可利用低浓度tcc，且对不同浓度的dca均有良好的降解能力，可用于降解tcc的共培养体系中对其代谢产物dca的去除。
51.实验例3：1、菌株来源以及复壮和扩培同实施例1。
52.2、协同代谢菌株共培养条件下对tcc的降解能力结果如图11所示。温度25℃，ph=7，接种量为7%（bx2和ly-1的体积比例为3:2）的条件下，共培养体系菌株bx2与ly-1对不同浓度的tcc，均有较高的降解率，且随着tcc浓度的升高降解率呈现下降趋势，在2 mg/l的浓度下，菌株bx2与ly-1对tcc的降解率达到89.7%，而在15 mg/l时，tcc的降解率为64.3%；此外，在10 mg/l的浓度下，菌株协同降解tcc的降解率为79.2%，高于单菌株bx2在其最佳降解条件下对tcc的降解率（76.8%）。说明菌株bx2和ly-1组成的共培养体系可以促进tcc的生物降解。