一种造血干细胞的提取和保存方法与流程

技术特征：
1.一种造血干细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：胎盘获取，在手术室无菌环境下收集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘及母血，将胎盘存放于无菌的储存箱中，在箱体外做好标签记录；步骤二：胎盘检测，胎盘送至实验室后，核验储存箱上的标签、箱内温度，将胎盘取出进行预清理后，对胎盘和母血进行病原微生物检测；步骤三：胎盘清洗，通过清洗液对胎盘进行前期的清洗处理，收集清洗后的液体a，用灌洗液对胎盘脐静脉、脐动脉内的血液进行灌洗，收集灌洗的液体，从而得到液体b；步骤四：胎盘溶解，在无菌环境下使用消毒后的医用剪刀将胎盘剪碎，然后将剪碎的胎盘浸入酶解液内消化胎盘组织，将酶解后的胎盘组织液收集，从而得到液体c；步骤五：将液体a、液体b和液体c混合得到混合液，将混合液经过2-3次过滤，从而得到过滤后的溶液，将过滤后的溶液静止6-9h，取出上清液，从而得到细胞悬液；步骤六：将细胞悬液加入离心机中进行第一次离心，取出离心后的上清液a，将上清液a与羟乙基淀粉后加入培养基中放置30-50min，将培养基中混合后的上清液a加入离心机中进行第二次离心，取出上清液b，将上清液b和和淋巴细胞分离液混合后加入培养基中静置1-2h，将混合后的上清液b加入离心机中第三次离心，取出上清液，从而制备得到造血干细胞。2.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤一中储存箱的温度控制在4-8℃，胎盘需要在24h内送至实验室。3.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤二中预清理方式为，先采用75％酒精喷洒在胎盘外表面，再采用生理盐水清洗胎盘外表面的残留血液和血块。4.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤二中病原微生物检测为：肝炎病毒及相应抗体、性病检测、艾滋病毒抗体检测、遗传性溶血性疾病、有核白细胞及单个核细胞计数、造血干/祖细胞定量检测、组织配型、造血干/祖细胞定性检测。5.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤三中清洗液由青霉素-链霉素双抗与生理盐水按质量比为1:0.8-1.2混合制得，浓度为80-120mg/l。6.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤三中灌洗液由100-300mg青霉素-链霉素双抗、0.05-0.09g酚妥拉明，40-80mg赖氨酸、1-3g维生素c、1-5mgamd3100、2支肝素钠注射液、2支硝酸甘油注射液、30-70ml质量分数为8％-12％的pbs缓冲液和1ldeme培养液制得，灌洗时以每秒钟3滴灌洗液的速度进行灌洗3-5h。7.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤四中胎盘碎块的长宽均小于5-10mm，胎盘组织在酶解液内消化时间为30-40min。8.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤六中上清液a与羟乙基淀粉的配比为1:6，上清液b和和淋巴细胞分离液的配比为1:4。9.根据权利要求1所述的一种造血干细胞的提取方法，其特征在于：步骤六中第一次离心时间10-20min，离心机转速为500-800r/min，第二次离心时间10-20min，离心机转速为离心机转速为1200-1400r/min，第三次离心时间20-40min，离心机转速为1200-1400r/min。10.根据权利要求1-9任一项所述的一种造血干细胞的保存方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：先将造血干细胞液与冻存混合液混合，使造血干细胞的密度控制在1
×
106～1
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107个/ml，再将造血干细胞冻存液缓慢的注入冷冻袋中；步骤二：先将装有造血干细胞冻存液的冷冻袋放置在4℃的环境下，静置30min，再将其以2℃/min的降温速度降至-26℃，冷冻保存1-2h后，再以2℃/min的降温速度降至-56℃，冷冻保存1-2h后，再以10℃/min的降温速度降至-96℃，冷冻保存1h，再以10℃/min的降温速度降至-196℃，最后将其置于-196℃的液氮中长期保存。

技术总结
本发明公开了涉及造血干细胞技术领域，具体为一种造血干细胞的提取和保存方法，步骤一：胎盘获取，在手术室无菌环境下收集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘及母血，将胎盘存放于无菌的储存箱中，在箱体外做好标签记录，步骤一：先将造血干细胞液与冻存混合液混合，使造血干细胞的密度控制在1


技术研发人员：陈忠平
受保护的技术使用者：朗姿赛尔生物科技（广州）有限公司
技术研发日：2022.11.11
技术公布日：2022/12/30