一种槲皮素的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种槲皮素的应用。


背景技术：

2.股骨头坏死在临床上一般又被称为股骨头缺血性坏死，或者股骨头无菌性坏死，主要是指由于各种原因所导致的股骨头血供出现了问题，从而引起股骨头内的骨髓以及骨细胞的死亡，导致股骨头结构塌陷，继而引起患侧的髋关节疼痛，跛行功能障碍等的疾病。是青壮年的髋关节致残、致畸疾病常见的原因之一，临床当中好发于中年的男性。早期可以表现为腹股沟区的疼痛，到终末期会引起颇行和相应的畸形。股骨头坏死主要包括创伤性和非创伤性股骨头坏死。创伤性股骨头坏死多见于摔伤、扭伤或直接撞伤等，比如继发股骨颈骨折导致支配股骨头的血管受损，引起股骨头坏死，或者由于髋部的外伤造成血管受损，引起股骨头坏死。非创伤性股骨头坏死最常见的位药物性，比如长期大量使用糖皮质激素，可以使营养股骨头的血管出现脂肪变性、血栓等，从而使血供中断，引起股骨头缺血坏死，或者见于长期大量的饮酒，酒精也会导致股骨头支持带血管脂肪变性，出现股骨头缺血坏死。其他的原因比如遗传性的贫血或者血液疾病，另外一类无明显病因的特发性股骨头坏死。 目前没有任何一种专门针对于股骨头坏死特效药,常用的治疗方式主要是抗骨质疏松等药物。例如磷酸钙片、阿仑膦酸钠、骨化三醇等。对于关节腔内积液和滑膜增生,可以口服促进积液吸收的药物。对于明显疼痛,可以通过口服非甾体类消炎药,减轻疼痛和相应炎症反应。因此，开发一种能解决上述技术问题的产品是非常必要的。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种槲皮素的应用。
4.本发明的目的是这样实现的，所述的槲皮素在制备预防/治疗股骨头坏死产品中的应用。
5.槲皮素，是植物界分布广泛，具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，化学式为c
15h10
o7。
6.槲皮素广泛存在于许多植物的茎皮、花、叶、芽、种子、果实中，多以苷的形式存在，如芦丁、槲皮苷、金丝桃苷等，经酸水解可得到槲皮素。其中，在荞麦的杆和叶、沙棘、山楂、洋葱中含量较高。槲皮素在许多食物中也均有发现，如洋葱、细葱、芦笋、卷心菜、芥菜、青椒、菊苣、葡萄柚、莴苣、山楂、苹果、芒果、李子、萝卜、黑加仑、马铃薯和菠菜等。另外，约有100多种药用植物（如槐米、侧柏叶、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、银杏、接骨木等）中均含有此成分。
7.槲皮素可以祛痰，止咳，平喘，此外还具有增强毛细管血压抵抗力，降血脂，减少毛细管血管脆性，扩张冠状动脉，降血压，增加冠脉血流量的作用，对于治疗冠心病，高血压，慢性支气管炎有一定的辅助作用。发明人在研究股骨头坏死原理的过程中，偶然发现槲皮素对于股骨头坏死具有良好的修复作用和预防作用。
附图说明
8.图1为股骨头坏死患者和正常人群的血液样本目标基因的差异示意图；图2为正常股骨头图片示意图；图3为激素类药物治疗股骨头坏死的图片示意图；图4为槲皮素治疗股骨头坏死的图片示意图；图5为股骨头he染色示意图；图6为股骨头坏死组和槲皮素治疗组最大脂肪空泡直径对比示意图；图7为股骨头坏死组和槲皮素治疗组空骨陷窝率对比示意图；图8为股骨头坏死组和槲皮素治疗组骨小梁相对面积对比示意图；图9为股骨头坏死组和槲皮素治疗组脂肪空泡相对面积对比示意图。
具体实施方式
9.下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
10.本发明所述的槲皮素的应用为所述的槲皮素在制备预防/治疗股骨头坏死产品中的应用。
11.所述的产品为食品、保健食品或药品。
12.对比例1本发明对股骨头坏死患者和正常人群的血液样本目标基因以及激素类药物导致的股骨头坏死和槲皮素治疗股骨头坏死进行的对比实验，实验方法为常规实验方法，实验结果具体级按图1~图4，实验结果表明槲皮素对于股骨头坏死具有良好的修复作用，比常规激素类药物治疗效果相当并且更好。
13.实施例11.1 首先获取股骨头坏死和对照的转录组数据集gse123568的表达谱是从公共功能基因组数据存储库 geo (gene expression omnibus, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 获取的，gse123568的表达谱数据基于affymetrix gpl15207平台([主视图] affymetrix人类基因表达阵列）。该数据集中共有 30 名 （在类固醇给药后的）sonfh（激素性股骨头坏死）患者和 10 名非 sonfh（激素性股骨头坏死） 患者。
[0014]
1.2差异分析确定差异的股骨头坏死基因集用微阵列数据的线性模型（limma）r语言包，识别sonfh中显着差异表达的基因，并且仅具有|log2倍变化| (log2fc)》1和调整后的 p 值 《0.05的符合标准的基因可以作为 deg函数被选中。
[0015]
1.3利用wgcna分析进一步确定差异共表达基因集gse123568 中所有基因的表达数据使用 了r语言中的 wgcna 包去识别重要的基因模块。使用幂函数 a
mn
= |c
mn
| β
构建一个加权邻接矩阵（c
mn = 基因 m 和基因 n 之间的皮尔逊相关性；a
mn = 基因 m 和基因 n 之间的邻接）。选择一个合适的β值来增加相似度矩阵，构建一个无标度的共表达网络。接下来，将邻接矩阵转换为拓扑重叠矩阵（tom）。动态树切割算法用于检测基因模块。在这里，我们选择软阈值功率为 12（无标度 r
2 = 0.7），最小
模块大小为 50 来识别集线器模块。为了研究基因模块和sonfh（非sonfh）之间的联系，计算了模块特征基因和sonfh（非sonfh）之间的关系。基因显着性（gs）和模块成员资格（mm）分别由每个模块特征基因和sonfh（非sonfh）的相关系数定义。关键模块中与sonfhs高度相关的基因被鉴定为sonfh相关基因。然后通过维恩图鉴定sonfh相关基因与deg的交叉基因，确定为sonfh的关键基因。
[0016]
1.4功能富集分析观察这些基因的功能对sonfh的关键基因进行基因本体（go）分析，以注释它们所涉及的生物过程（bp）、细胞成分（cc）和分子功能（mf）。 同时，京都基因和基因组百科全书（kegg）分析被用来注释与这些sonfh关键基因相关的信号通路。 这些分析由r软件包“集群分析器”进行，p值《0.05和q值《0.05作为统计显着性的阈值。“ggplot2”r包用于可视化 go 和 kegg 富集结果。
[0017]
1.5建立蛋白互作网络string（用于检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具，http://string-db.org/）是已知和预测 ppi 的生物数据库和网络资源。 基于string数据库，ppi选择sonfh关键基因中得分（中位置信度）》 0.9的基因，然后ppi网络通过细胞景观将其可视化。
[0018]
1.6基于公共数据库和药物数据库检索温胆汤活性成分和靶向基因温胆汤中药成分信息来源于中药系统药理学数据库和分析平台（tcmsp，http://tcmspw.com/tcmsp.php），提供基于吸收、分布、代谢和排泄的化学药代动力学特性(adme) 参数。在tcmsp服务器中，主要通过整合口服生物利用度（ob）
⩾
30%、药物相似度（dl）
⩾
0.18的药代动力学特性对温胆汤中每种草药的活性成分进行过滤。 ob 预筛选用于估计在中医治疗中到达全身循环的口服给药剂量，这揭示了 adme 过程的收敛性。 dl 是药物设计中用于评估化合物在化学上是否适合药物的定性概念。化合物的“类药”水平为0.18，作为中药中“类药”化合物的选择标准。在这项研究中，当活性成分同时满足这两个标准时，它们将被选择进行进一步分析。接下来，在tcmsp数据库中收集与活性成分相关的蛋白质靶标。我们将所有获得的蛋白质目标导入 uniprot 数据库（https://www.uniprot.org），将物种设置为人类，将这些蛋白质目标转换为标准基因名称。
[0019]
1.7建立药物和关键基因的调控网络通过维恩图将温胆汤有效成分的靶基因与sonfh的关键基因进行匹配，确定温胆汤治疗sonfh的关键靶基因。 相应地，筛选出针对这些关键基因的温胆汤潜在活性成分。通过细胞检测仪软件，可视化温胆汤活性成分、关键靶基因和sonfh的调控网络。
[0020]
1.8对候选药物和关键基因进行分子对接温胆汤关键活性成分的三维结构来自pubchem数据（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。 相应靶蛋白的三维结构来自rcsb pdb数据库（www.rcsb.org/）。使用pymol 2.4.0软件去除溶剂，分离靶蛋白中的原始配体。使用autodocktools确定这些靶蛋白的活性口袋，在windows 10下使用vina软件将核心蛋白和关键活性成分批量对接，获取结合能。pymol 2.4.0软件用于可视化对接结果。
[0021]
结果：2.1 sonfh中deg的识别我们从gse123568中的每个样本表达谱中获得了54675个探针。在基因注释和去除重复基因符号后，我们获得了30名sonfh患者和10名非sonfh 患者的20014个基因符号的表
达谱，用于后续分析。差异表达分析显示sonfh中共有609个差异表达基因，其中230个基因上调，378个基因下调。然后基于差异表达基因的表达水平进行双向层次聚类。因此，sonfh和非sonfh可以完全分离。
[0022]
2.2通过wgcna识别sonfh的关键模块通过wgcnar软件包分析gse123568的基因表达谱。β=12（无标度r2=0.7）的幂被设置为适当的软阈值以满足无标度网络标准。共鉴定了16个模块，大小从77到1857个基因不等，并用不同的颜色标记。根据 mes 与 sonfh 的相关性，棕色模块和粉色模块是与 sonfh 最相关的两个模块，被认为是 sonfh 的关键模块。此外，绘制了粉色模型和棕色模型中的mm 散点图与sonfh的gs对比。p值表明粉红色模块和棕色模块与sonfh高度相关。 因此，粉色模块和棕色模块中的基因被鉴定为sonfh相关基因。重叠deg和 sonfh相关基因，我们确定了sonfh的387个关键基因。
[0023]
2.3 sonfh关键基因富集分析go功能富集分析显示sonfh的关键基因主要参与了参与免疫反应的中性粒细胞活化、中性粒细胞活化、bp中性粒细胞脱颗粒；分泌颗粒膜、ficolin-1-rich颗粒、cc分泌颗粒管腔；mf的磷脂结合、碳水化合物结合、磷脂酰肌醇结合。根据kegg通路富集分析，sonfh的关键基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化、肺结核等。
[0024]
2.4 sonfh关键基因的ppi使用string工具预测sonfh的这些关键基因之间的蛋白质相互作用。细胞景观仪显示了得分（中值置信度）》0.9 的基因的相互作用。红色表示上调基因；红色表示上调基因；绿色表示下调基因。ppi网络中总共包含101个基因。
[0025]
2.5温胆汤化学成分采集与靶点预测根据筛选标准，我们从tcmsp中分别鉴定出温胆汤中的半夏、陈皮、茯苓、甘草和枳壳5种药材的13、5、15、92和22种有效成分。这些活性成分的推定目标由tcmsp预测。因此，我们分别确定了半夏100个候选目标、陈皮69个候选目标、茯苓25个候选目标、甘草239个候选目标和枳壳125个候选目标。接下来，在消除冗余后，从 125 个化合物中收集了总共278个推定的目标。其中，这278个推定目标的基因符号来自 uniprot 数据库。
[0026]
2.6温胆汤-基因-sonfh活性成分监管网络的建立将温胆汤的278个推定靶基因和ppi网络中的101个基因重叠，我们确定ncf1、ptgs2和runx2 是温胆汤调控 sonfh 进展的潜在靶点。通过细胞景观构建了温丹堂-基因-sonfh活性成分调控网络。长方形代表有效成分（半夏：草绿色；陈皮：浅橙色；甘草：紫色；茯苓：粉红色；甘草：绿色；枳壳：天蓝色）；椭圆代表靶基因；菱形代表疾病。
[0027]
2.7温胆汤关键活性成分与靶点的分子对接基于温胆汤-基因-sonfh活性成分的监管网络，我们提到了甘草的活性成分之一mol000098（槲皮素）可能靶向是ncf1、ptgs2和runx2。这一现象表明槲皮素是温胆汤通过靶向ncf1、ptgs2和runx2作用于sonfh的关键活性成分。因此，分别进行了槲皮素与ncf1、ptgs2和runx2的分子对接。
[0028]
实施例21、实验采用样品
2、仪器3、试剂耗材3.1试剂3.2耗材4、实验方法步骤4.1 组织石蜡包埋及切片（1）组织固定：取适量的组织，用pbs清洗用4%的多聚甲醛浸泡固定24-48h。放入5倍体积强酸脱钙液中脱钙，每周更换一次脱钙液，直到组织可以切片。
[0029]
（2）脱水：将固定好的组织依次放入以下浓度的酒精中浸泡脱水 70％乙醇（过
夜）
‑‑‑
80%乙醇（50min）
‑‑‑
95%乙醇（45min）
‑‑‑
100%乙醇i（40min）
‑‑‑‑
100%乙醇ii(40min)。
[0030]
（3）透明：将脱水好的组织依次以下二甲苯中浸泡透明 1/2无水乙醇 1/2二甲苯（35min）
‑‑‑‑
二甲苯i（30min）
‑‑‑‑
二甲苯 ii(30min)。
[0031]
（4）浸蜡：将透明好的组织放入石蜡中浸泡渗透，石蜡i(20min)
‑‑‑‑
石蜡ii （20min）——石蜡三ⅲ(20min)。
[0032]
（5）包埋：将组织块放入盛有石蜡的模具中，摆好组织块位置，切面向下，盖上塑料模具盖，接满石蜡，待石蜡冷却，抠出石蜡快。
[0033]
（6）切片：将组织块固定在切片机上，切厚度为5um的切片，切好后放到20%的酒精中展片，再放到47℃水浴中展片，展平后用阳离子玻片贴片，贴好后放到64℃烘箱中烤片，待石蜡融化后取出玻片放到片盒中。
[0034]
4.2 he染色样本处理：将组织用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片。
[0035]
（1）烤片：将组织片放入64℃恒温箱中烘烤1h。
[0036]
（2）脱蜡：将玻片放入到二甲苯中ⅰ（10min）
‑‑‑‑
二甲苯ⅱ（10min）。
[0037]
（3）水化：100%酒精ⅰ（5min）
‑‑‑‑
100%酒精ⅱ（5min）
‑‑‑‑
95%酒精（5min）
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80%酒精（3min）
‑‑‑‑
70%酒精(2min)；pbs冲洗3次，每次5min。
[0038]
（4）苏木素复染：将玻片放到苏木素中染色5min，蒸馏水冲洗，放入到酒精-盐酸溶液中进行分化，分化10~15s，放入到自来水中返蓝，返蓝至少15min。
[0039]
（5）伊红染色：将玻片放入到伊红中染色5~10s，放入到蒸馏水中洗一次。
[0040]
（6）脱水：95%酒精（5~10s）——100%酒精ⅰ（5min）——100%酒精ⅱ（5min）。
[0041]
（7）透明：二甲苯ⅰ（10min）——二甲苯ⅱ（10min）。
[0042]
（8）封片：用中性树胶进行封片。
[0043]
（9）拍片：选择中间和四周不少于5个视野进行拍照和分析。
[0044]
5、结果5.1 he染色结果见图5，从图5可以看出，与正常组相比，股骨头坏死组骨小梁相对面积有所减少、脂肪空泡相对面积增多、生长板减少；与股骨头坏死组相比，槲皮素治疗组骨小梁相对面积有所增多、脂肪空泡相对面积减少、生长板有所增多。
[0045]
5.2 统计结果（1）与正常组相比，股骨头坏死组最大脂肪空泡直径增大，与股骨头坏死组相比，槲皮素治疗组最大脂肪空泡直径减少，具体见图6和下表：。
[0046]
（2）与正常组相比，股骨头坏死组空骨陷窝率增高；与股骨头坏死组相比，槲皮素治疗组空骨陷窝率降低，具体见图7和下表：
。
[0047]
（3）与正常组相比，股骨头坏死组骨小梁相对面积减小；与股骨头坏死组相比，槲皮素治疗组骨小梁相对面积增大，具体见图8和下表：。
[0048]
（4）与正常组相比，股骨头坏死组脂肪空泡相对面积增大；与股骨头坏死组相比，槲皮素治疗组脂肪空泡相对面积减小，具体见图9和下表：。