修饰的短干扰rna组合物及其在癌症治疗中的用途1.与相关申请的相互参照本技术要求于2020年3月18日提交的美国临时申请no.62/991,296的优先权利益，其整体内容引入本文作为参考。2.政府支持本发明是利用美国国立卫生研究院（nationalinstitutesofhealth）授予的基金号码ca197098下的政府支持完成的。政府在本发明中享有一定的权利。3.序列表引入作为参考3kb字节的命名为050_9019_us_pro_sequencelisting.txt且通过efs-web提交给美国专利商标局（unitedstatespatentandtrademarkoffice）的ascii文本文件中的序列表引入本文作为参考。
技术领域：
：4.本公开内容总的来说涉及包含5-氟尿嘧啶（5-fu）分子的短干扰核糖体核酸（sirna）组合物。更具体地，本公开内容提供了含有一个或多个5-fu分子的修饰的sirna组合物及其使用方法。本技术还提供了包含本发明的短干扰核酸组合物的药物组合物和使用所述组合物治疗癌症的方法。
背景技术：
：：5.rna干扰（rnai）指由短干扰rnas介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程。参见例如，zamore等人，cell(2000)101:25-33和hamilton等人，science(1999)286:950-951。简而言之，细胞中双链rnas（dsrnas）的存在刺激称为切丁酶的核糖核酸酶iii酶的活性。参见，例如，zamore等人，cell.(2000)101:25-33。切丁酶与将dsrna加工成称为短干扰rnas（sirnas）的短dsrna片段有关。衍生自切丁酶活性的短干扰rnas一般长度约21至约23个核苷酸并包含约19碱基对双链体。同上。rnai反应还以通常称为rna诱导性沉默复合物（risc）的内切核酸酶复合物为特色，其介导具有与sirna双链体的反义链互补的序列的单链rna的切割。靶rna的切割发生在与sirna双链体的反义链互补的区域的中间。参见elbashir等人，genesdev.,(2001)15:188。rnai已被广泛研究，例如，tuschl等人，国际pct公开no.wo01/75164，描述了通过在培养的哺乳动物细胞包括人胚肾和hela细胞中引入合成的21-核苷酸rnas的双链体诱导的rnai。6.rna干扰看来似乎是抑制靶mrna翻译的有效技术，且最近fda批准基于sirna的疗法是其治疗潜力的显著的证明。hoy,sm.drugs(2018)78:1625-1631；和schutze,n.molcellendocrinol(2004)213:115-119。然而，多年以来，基于sirna的疗法由于递送媒介物的毒性而受到限制，并且限于某些器官部位，例如肝。例如，已知这些化合物在施用时易受酶降解，这导致差的稳定性。nikam,rr和gore,kr.nucleicacidther.(2018)28:209-224。此外，关于在本领域中使用sirna的研究提供了矛盾的结果。例如，研究已表明，用2'-脱氧（2'-h）或2'-o-甲基核苷酸完全取代一条或两条sirna链消除rnai活性，而用2'-脱氧核苷酸（2'-h）取代3'-末端sirna突出端核苷酸显示是耐受的。sirna双链体中心的单错配序列也显示消除rnai活性。此外，这些研究还表明，靶rna中切割位点的位置是由sirna指导序列的5'-端而非指导序列的3'-端限定的。参见elbashir等人，emboj.(2001)20:6877。其他研究已表明，sirna双链体的靶互补链上的5'-磷酸对于sirna活性是需要的，并且atp用于维持sirna上的5'-磷酸部分。参见nykanen等人，cell(2001)107:309。此外，某些研究已表明，一些碱基修饰，包括在sirna的有义和反义链中用4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶取代尿嘧啶，以及用肌苷取代鸟苷揭示了混乱和矛盾的结果。参见parrish等人，molecularcell(2000)6:1077-1087。例如，4-硫尿嘧啶和5-溴尿嘧啶取代看来似乎是耐受的，而其他取代如在反义链中并入5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶导致rnai活性显著降低。同上。7.根据世界卫生组织（worldhealthorganization），癌症是全世界死亡的主要原因，2015年导致880万人死亡。肺癌是美国男性和女性两者癌症死亡的主要原因，只有18.6%的被诊断患有肺癌的患者存活超过5年。surveillance,epidemiology,andendresultsprogram.seercancerstatfacts:lungandbronchuscancer.nationalcancerinstitute.bethesda,md(2018)。肺癌有两个主要类别：非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌由组织中存在的癌细胞类型进一步描述。因此，非小细胞肺癌分为以下肺癌亚类：鳞状细胞癌（也称为表皮样癌（epidermoidcarcinoma））、大细胞癌、腺癌（即，起源于衬于肺泡的细胞的癌症）、多形性、类癌肿瘤和唾液腺癌。同时，小细胞肺癌主要有两种类型：小细胞癌和混合小细胞癌。seercancerstatfacts:lungandbronchuscancer.nationalcancerinstitute.bethesda,md(2018)。非小细胞肺癌最常见的治疗是吉西他滨（2',2'-二氟2'脱氧胞苷）、红豆杉醇（例如，紫杉醇）、顺铂（一种dna交联剂）及其组合。然而，许多类型的基于抗体的治疗也用于治疗非小细胞肺癌（例如，吉非替尼（gefitinib）、派姆单抗（pembrolizumab）、阿来替尼（alectinib））。小细胞肺癌通常由基于甲氨蝶呤、盐酸阿霉素和拓扑替康的化疗剂治疗。8.结肠直肠癌（crc）是美国第三最常见的恶性肿瘤以及第二最常见的癌症相关死亡原因。参见，hegdesr,等人，expertreviewofgastroenterology&hepatology.(2008)2(1)pp.135-49。有许多用于治疗癌症的化疗剂；然而，嘧啶拮抗剂，例如基于氟嘧啶的化疗剂（例如，5-氟尿嘧啶，s-1）是治疗结肠直肠癌的金标准。嘧啶拮抗剂，阻断含有嘧啶的核苷酸（dna中的胞嘧啶和胸腺嘧啶；rna中的胞嘧啶和尿嘧啶）的合成。因为当与内源性核苷酸相比时，嘧啶拮抗剂具有相似的结构，所用它们与天然嘧啶竞争以抑制与复制过程有关的关键酶活性，从而导致阻止dna和/或rna合成和抑制细胞分裂。9.免疫/淋巴系统的淋巴瘤或癌症，例如，何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤，是癌症的常见形式。通常，淋巴瘤包括例如淋巴结、脾、胸腺和骨髓的肿瘤。淋巴瘤的主要类型是何杰金淋巴瘤（即，何杰金病）、非何杰金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、皮肤b-细胞淋巴瘤、皮肤t-细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。批准用于治疗淋巴瘤的药物包括，例如，盐酸阿霉素、5-fu、环磷酰胺、地塞米松、氮烯咪胺（decarbazine）、甲氨蝶呤、利妥昔单抗（rituximab）、依鲁替尼（ibrutinib）、杜韦利西布（duvelisib）、派姆单抗、维奈托克（venetoclax）和达沙替尼（dasatinib）。10.5-氟尿嘧啶（即，5-fu，或更具体地，5-氟-1h-嘧啶-2,4-二酮）是众所周知的嘧啶拮抗剂，其用于许多辅助化疗药物，例如carac®乳膏、efudex®、fluoroplex®和adrucil®。非常确实的是，5-fu靶向关键酶胸苷酸合酶（tyms或ts），其催化脱氧尿苷酸（dump）甲基化为脱氧胸苷酸（dtmp），dna生物合成中的必需步骤。danenbergp.v.,biochim.biophys.acta.(1977)473(2):73-92。11.尽管如此，但是现有的癌症疗法仍处于初期，仍有许多障碍等待改进或克服。例如，众所周知，尽管在治疗多种癌症中相当有效，但5-fu具有相当大的毒性，并且可引出许多不利副作用。此外，已知肿瘤细胞通过发展对常见的治疗剂（例如5-fu）的抗性来回避凋亡途径。参见gottesmanm.m.等人，naturereviewscancer,(2002)2(1):48-58。12.b-细胞淋巴瘤2（bcl-2）是由bcl2基因编码的线粒体膜蛋白，且是抑制程序性细胞死亡（凋亡）的bcl-2调节蛋白家族的创始成员。cory,s和adams,jmt.natrevcancer(2002).2:647-656。因此，已经进行了许多尝试以靶向bcl2作为和癌症作斗争的治疗策略，包括fda批准的维奈托克（venetoclax）。参见leverson,jd等人，cancerdiscov(2017)7:1376-1393。13.考虑到上述，在用于治疗癌症的更有效、更稳定且更低毒性的药疗法中将具有显著的益处。技术实现要素：14.在不受任何一种特定理论束缚的情况下，本公开内容的前提是发现用5-fu分子置换短干扰rna（sirna）分子的核苷酸序列内的尿嘧啶（u）碱基通下述增加5-fu的功效：向细胞提供5-fu，在那里sirna将靶向bcl-2，通过结合bcl-2核苷酸序列（mrna）抑制bcl-2蛋白合成，以及细胞内释放5-fu以抑制胸苷酸合酶（ts）以治疗癌症，如结肠直肠癌、肺癌和淋巴瘤。15.本公开内容证明用5-fu分子置换至少一个尿嘧啶碱基的修饰的sirna作为抗癌剂具有特别的功效。此外，本文的数据显示使细胞与本公开内容的修饰的sirna组合物接触通过经由调节凋亡途径抑制癌细胞增殖来治疗癌症。此外，显示本公开内容的修饰的sirnas保留bcl-2核酸序列靶特异性，可以在不使用有害和无效的递送媒介物（例如，纳米颗粒）的情况下递送，并且当与已知的bcl-2治疗剂（例如，维奈托克）比较时表现出增强的效力。16.因此，在本公开内容的一个方面，描述了包含修饰的sirna核苷酸序列的核酸组合物，所述修饰的sirna核苷酸序列具有至少一个已被5-fu分子置换的尿嘧啶碱基（u，u-碱基）。在某些实施方案中，修饰的sirna具有不止一个或恰好一个已被5-氟尿嘧啶置换的尿嘧啶。在一些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列用5-fu分子置换了两个、三个、四个、五个或更多个尿嘧啶碱基。在具体实施方案中，抗bcl-2短干扰rna的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。17.在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换。在另一个实施方案中，双链抗-bcl-2短干扰rna的第一链中的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。在某些实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换，并且一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换并且没有尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被5-fu分子置换。在具体的实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换并且一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在一个实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换，并且没有尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在一些实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链。在其他实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链，且第二链是反义链。18.在具体实施方案中，核酸组合物包含双链sirna核苷酸序列，所述序列已通过用5-fu分子置换至少一个尿嘧啶碱基而被修饰。更具体地，核酸组合物是双链rna分子，其含有与bcl-2mrna核苷酸序列的一部分结合的至少以下从5'到3'的核苷酸序列：ggaugccuuuguggaacuguauu[seqidno.1]和互补链，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0019]在一种情况下，本公开内容的修饰的sirna恰好包含一个已被5-fu分子置换的sirna核苷酸序列的尿嘧啶碱基。在其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少两个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在又其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少三个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少四个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少五个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在其他实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少六个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一个实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少七个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在具体实施方案中，sirna核苷酸序列的所有尿嘧啶碱基均各自被5-fu分子置换。可以对双链sirna组合物的第一链（例如，有义链）或互补的第二链（例如，反义链）进行对本公开内容的任何sirna组合物的修饰。在优选的实施方案中，对第一（有义）链和第二（反义）链两者进行对sirna分子的修饰。[0020]在示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从5'到3'的修饰的sirna核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0021]在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0022]在又另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0023]本公开内容还预期具有至少一个被除5-氟尿嘧啶以外的5-卤尿嘧啶（5-halouracil）置换的尿嘧啶碱基的修饰的sirna组合物。因此，在本公开内容的一些修饰的sirna组合物中，一个或多个尿嘧啶碱基被例如5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氟尿嘧啶或其组合置换。在某些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是相同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是不同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止两个5-卤尿嘧啶，由此修饰的sirna核苷酸序列包含不同的5-卤尿嘧啶的组合。[0024]本公开内容还涉及含有本文所述的修饰的sirna组合物的制剂或包含其组合即至少两种不同的修饰的sirnas的制剂。在某些实施方案中，制剂可以包括药物制剂，其包含上述核酸组合物和其他已知的药理学试剂，例如一种或多种药学上可接受的载体。[0025]本公开内容揭示了本发明的修饰的sirnas表现出作为抗癌治疗的有效功效。值得注意的是，所测试的每种修饰的sirna核酸组合物都降低了癌细胞生存力、肿瘤生长和发展。[0026]因此，本公开内容的另一方面涉及用于治疗癌症的方法，其包括向主体施用有效量的一种或多种本文所述的核酸组合物。在本方法的某些实施方案中，核酸组合物包含结合bcl-2mrna的修饰的sirna，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个尿嘧啶碱基被5-氟尿嘧啶分子置换。[0027]在具体实施方案中，本公开内容的sirna组合物结合bcl-2mrna且具有从5'到3'的修饰的核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0028]在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物结合bcl-2mrna且具有从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0029]在又另一个实施方案中，在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物结合bcl-2mrna且具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0030]在一些情况下，通过本方法治疗的主体是哺乳动物。在某些实施方案中，被治疗的主体是人、狗、马、猪、小鼠或大鼠。在具体实施方案中，主体是已被诊断为患有癌症或已被鉴定为具有发展癌症的倾向的人。在一些实施方案中，被治疗的癌症可以是例如肺癌、结肠直肠癌或淋巴瘤。在具体实施方案中，被治疗的癌症是结肠直肠癌。在某些实施方案中，被治疗的癌症是肺癌。在一个实施方案中，被治疗的癌症是淋巴瘤。附图说明[0031]图1a-1d.本公开内容的示例性短干扰rna核苷酸序列的化学表示。a）seqidno:1中所示的未修饰的短干扰bcl-2rna（sibcl2）的化学表示。b）如seqidno:2所示的示例性的修饰的sibcl2rna的化学表示，由此有义链和反义链两者中的所有尿嘧啶残基都在sibcl2中被5-fu置换。c）如seqidno:3所示的示例性的修饰的sibcl2rna的化学表示，由此有义链中的所有尿嘧啶残基都在sibcl2中被5-fu置换。d）如seqidno:4所示的示例性的修饰的sibcl2rna的化学表示，由此反义链中的所有尿嘧啶残基都在sibcl2中被5-fu置换。所描绘的每种sirna的方向都由5'到3'（有义）或3'到5'（反义）指定提供。[0032]图2a-2c.示例性的修饰的sirna分子保持bcl2靶特异性和抑制靶（bcl-2）表达的能力。a）qrt-pcr分析显示在结肠癌细胞（hct116）和肺癌细胞（a549）中，seqidno:2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在mrna水平上抑制bcl-2。（p《0.001）b）5-fu-sibcl2在有或没有转染媒介物的情况下抑制bcl-2表达，以及从而抑制癌症进展。蛋白印迹证明在hct116结肠癌细胞中，seqidno:2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在有或没有转染媒介物的情况下在蛋白水平抑制bcl-2表达，且这不是单独5-fu的效果。c）蛋白印迹证明在a549肺癌细胞中，seqidno:2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在有或没有转染媒介物的情况下在蛋白水平抑制bcl-2表达，且这不是单独5-fu的效果。[0033]图3a-3d.示例性的修饰的sirna分子在结肠癌和淋巴瘤细胞中诱导凋亡并且比已知的治疗剂更有效地杀死癌细胞。a）在有或没有转染媒介物的情况下，50nmseqidno：2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在hct116结肠癌细胞中诱导凋亡。（p《0.05）b）在有或没有转染媒介物的情况下，50nmseqidno：2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在toledo淋巴瘤细胞中诱导凋亡。（p《0.05）c）5-fu-sibcl2在诱导凋亡中比维奈托克更有效。（p《0.05）d）5-fu-sibcl2以低于维奈托克的剂量抑制淋巴瘤细胞生存力。具体实施方式[0034]本公开内容提供了与bcl-2核酸序列结合并并入一个或多个5-氟尿嘧啶（5-fu）分子的短干扰核糖体核酸（sirna）组合物。在不受任何一种特定理论束缚的情况下，令人惊讶的是，本公开内容揭示了用5-卤尿嘧啶（例如，5-氟尿嘧啶）置换结合bcl-2mrna的双链sirna组合物的至少一条链中的尿嘧啶核苷酸增加sirna抑制癌症发展、进展和肿瘤发生的能力。此外，本文的数据显示，将几种类型的癌细胞与本公开内容的修饰的sirna组合物接触通过经由bcl-2mrna翻译的抑制来调节凋亡途径而减少了癌症进展。此外，显示本发明的修饰的sirna保留了对bcl-2mrna的靶特异性，可以在不使用有害和无效的递送媒介物（例如，纳米颗粒）的情况下递送，并且与结合bcl-2mrna的未修饰的sirna组合物比较时表现出增强的效力。因此，本公开内容提供了各种短干扰核酸组合物，其具有在其核酸序列中并入的5-氟尿嘧啶分子，以及使用所述组合物以治疗癌症的方法。本公开内容进一步提供了由修饰的sirna组合物组成的药物制剂，以及用于治疗癌症的方法，其包括将所述药物制剂施用于有需要的主体。[0035]修饰的短干扰核糖体核酸组合物。[0036]术语“短干扰rna”、“sirna分子”和“sirna”在本文中可互换使用，以意指能够抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子，例如通过以核苷酸序列特异性方式介导rna干扰“rnai”或基因沉默。本发明的sirna分子的非限制性实例显示在图1b-1d和本文的实施例1-2中。例如，sirna可以是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列（例如，bcl-2）或其部分的核苷酸序列。sirna可以从两条分开的寡核苷酸装配而成，其中一条链是有义链，且另一条是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的（即每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列）；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区为约15至约30，例如14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个碱基对；反义链包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列（例如，sirna分子的15至25个或更多个核苷酸与靶核酸或其一部分互补）。在某些实施方案中，术语sirna包括sirna的双链体（即，双链）形式和在5'至3'方向和互补链在3'至5'方向的sirna的单链形式两者。在具体实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物由具有彼此互补的第一链和第二链的双链组合物组成。[0037]如本文所用的术语“互补性”或“互补的”应意指核酸可以通过传统的沃森-克里克或其他非传统类型与另一核酸序列形成一个或多个氢键。关于本发明的核酸分子，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能进行，例如，rnai活性。核酸分子的结合自由能的测定在本领域中是众所周知的。参见，例如，frier等人，proc.nat.acad.sci.usa(1986)83:9373-9377。百分比互补性表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键（例如，沃森-克里克碱基配对）的邻接残基的百分比（例如，在与具有10个核苷酸的第二核酸序列配对的第一寡核苷酸中的总共10个核苷酸中的5、6、7、8、9或10个核苷酸分别代表50%、60%、70%、80%、90%和100%互补）。“完全互补”意指核酸序列的所有邻接残基都将与第二核酸序列中相同数目的邻接残基形成氢键。在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含与一个或多个相应的核酸分子或其部分互补的约15至约30个或更多个（例如，14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31个或更多个）核苷酸。[0038]术语“修饰的sirna”和“修饰的短干扰rna”在本文中可互换使用以指包含至少一个5-卤尿嘧啶分子的sirna分子。更具体地，在本公开内容中，修饰的sirna与未改变或未修饰的sirna核酸序列的不同之处在于一个或多个碱基。在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的修饰的sirna包含至少一个被5-卤尿嘧啶置换的尿嘧啶（u）核苷酸碱基。在一些实施方案中，核酸组合物含有已通过在5-位置用提供与卤原子相似作用的基团衍生至少一个尿嘧啶核碱基而被修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供类似效果的基团在重量或空间维度上具有与卤原子类似的大小，例如，最多到或小于20、30、40、50、60、70、80、90或80g/摩尔的分子量。在某些实施方案中，提供与卤原子类似的作用的基团可以是，例如，甲基、三卤甲基（例如，三氟甲基）基团、拟卤化物（例如，三氟甲磺酸盐、氰基或氰酸盐）或氘（d）原子。提供与卤原子相似作用的基团可以在sirna核苷酸序列中不存在5-卤尿嘧啶碱基的情况下或除了5-卤尿嘧啶碱基以外存在。[0039]在具体实施方案中，本公开内容的修饰的sirna包含至少一个被5-氟尿嘧啶置换的尿嘧啶（u）核苷酸碱基。[0040]本公开内容还预期具有至少一个被除5-氟尿嘧啶以外的5-卤尿嘧啶置换的尿嘧啶碱基的修饰的sirna组合物。因此，在本公开内容的一些修饰的sirna组合物中，一个或多个尿嘧啶碱基被例如5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氟尿嘧啶或其组合置换。在某些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是相同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是不同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止两个5-卤尿嘧啶，由此修饰的sirna核苷酸序列包含不同的5-卤尿嘧啶的组合。[0041]在某些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是相同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是不同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止两个5-卤尿嘧啶，由此修饰的sirna核苷酸序列包含不同的5-卤尿嘧啶的组合。[0042]在本公开内容的示例性实施方案中，提供了含有seqidno：1所示的sirna核苷酸序列的核酸组合物，所述sirna核苷酸序列已通过用5-卤尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶置换至少一个尿嘧啶核苷酸碱基而被修饰。在某些实施方案中，修饰的sirna具有不止一个或恰好一个已被5-氟尿嘧啶置换的尿嘧啶。在一些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列用5-fu分子置换了两个、三个、四个、五个或更多个尿嘧啶碱基。在具体实施方案中，抗bcl-2短干扰rna的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。[0043]在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换。在另一个实施方案中，双链抗bcl2短干扰rna的第一链中的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。在某些实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换，并且一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已经在双链sirna分子的第一链中被置换并且没有尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被5-fu分子置换。在具体的实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换并且一个或多个尿嘧啶碱基已经在双链sirna分子的第二链中被置换。在一个实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已经在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换，并且没有尿嘧啶碱基已经在双链sirna分子的第二链中被置换。在一些实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链。在其他实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链，且第二链是反义链。[0044]在具体实施方案中，核酸组合物包含双链sirna核苷酸序列，所述序列已通过用5-fu分子置换至少一个尿嘧啶碱基而被修饰。更具体地，核酸组合物是双链rna分子，其含有结合bcl-2核苷酸序列的一部分的至少以下从5'到3'的核苷酸序列：ggaugccuuuguggaacuguauu[seqidno.1]和互补链，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0045]在一种情况下，本公开内容的修饰的sirna恰好包含一个已被5-fu分子置换的sirna核苷酸序列的尿嘧啶碱基。在其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少两个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在又其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少三个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少四个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少五个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在其他实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少六个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一个实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少七个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在具体实施方案中，sirna核苷酸序列的所有尿嘧啶碱基均各自被5-fu分子置换。可以对双链sirna组合物的第一链（例如，有义链）或互补的第二链（例如，反义链）进行对本公开内容的任何sirna组合物的修饰。在优选的实施方案中，对第一（有义）链和第二（反义）链两者进行对sirna分子的修饰。[0046]在示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从5'到3'的修饰的sirna核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0047]在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0048]在又另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0049]本文所述的修饰的sirna核酸组合物可以使用任何众所周知的用于合成核酸的方法来合成。在特定实施方案中，核酸组合物通过自动寡核苷酸合成产生，例如使用亚磷酰胺化学的任何众所周知的方法。为了将一个或多个5-卤尿嘧啶分子如5-fu引入修饰的sirna核苷酸序列中，可以包括5-卤尿嘧啶核苷亚磷酰胺作为前体碱基，以及将被包括在核酸序列中的含有天然碱基（例如，a、u、g和c）的核苷的亚磷酰胺衍生物。[0050]在一些实施方案中，本公开内容的核酸组合物可以生物合成地产生，例如通过使用来自质粒、pcr片段或合成dna模板的体外rna转录，或通过使用重组（体内）rna表达方法，如例如，如在2'-acerna合成”中，如例如在s.a.scaringe等人,j.am.chem.soc.,(1998)120第11820-11821页中所述的，其整体内容特此引入作为参考。也参见c.m.dunham等人,naturemethods,(2007)4(7),第547-548页。[0051]本公开内容的修饰的sirna序列可以进一步通过本领域众所周知的技术化学修饰，例如通过用聚乙二醇（peg）或烃或靶向剂，特别是癌细胞靶向剂，例如叶酸，进行官能化。为了包括这样的基团，可以首先在寡核苷酸序列中包括可用于附加期望的官能团的反应基（例如，氨基、醛、硫醇或羧酸酯基团）。尽管可以将这种反应基或官能团并入已产生的核酸序列上，但是通过使用自动寡核苷酸合成可以更容易地包括反应基或官能团，其中包括含有反应基或反应前体基团的非核苷亚磷酰胺。[0052]在某些实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物是通过下述产生的双链体分子：合成sirna分子的第一（寡核苷酸序列）链，其中所述第一链的核苷酸序列包含可用作用于合成第二条链的支架的可切割接头分子；在第一链的支架上合成sirna第二链的核苷酸序列，其中第二链序列进一步包含可用于纯化sirna双链体的化学部分；在适合两条sirna链杂交且形成稳定双链体的条件下切割接头分子；和利用第二寡核苷酸序列链的化学部分纯化sirna双链体。[0053]在一些实施方案中，上述接头分子的切割发生在寡核苷酸的脱保护期间，例如，在使用烷基胺碱例如甲胺的水解条件下。在一个实施方案中，合成方法包括在固相支持体如受控孔玻璃（cpg）或聚苯乙烯上的固相合成，其中第一链使用固相支持体作为支架在可切割的接头如琥珀酰接头上合成。可切割接头可用作用于合成第二链的支架，可包含与固体支持体衍生的接头相似的反应性，从而使得固体支持体衍生的接头和可切割接头的切割伴随发生。在另一个实施方案中，可用于分离附着的寡核苷酸序列的化学部分包含三苯甲基基团，例如二甲氧基三苯甲基基团，其可用于如本文所述的三苯甲基开（trityl-on）合成策略中。在又另一个实施方案中，化学部分，例如二甲氧基三苯甲基基团，在纯化过程中被去除，例如，使用酸性条件。[0054]在另一种情况下，用于sirna合成的方法是溶液相合成或杂合相合成，其中sirna双链体的两条链使用充当用于合成第二序列的支架的附着至第一序列的可切割接头串联合成。在适合分离的sirna链杂交的条件下切割接头导致双链sirna分子的形成。[0055]在某些情况下，本公开内容的修饰的sirna组合物调节bcl-2蛋白表达。[0056]术语“调节”意指基因的表达，或编码基因的一种或多种蛋白或蛋白亚基的rna分子或等效rna分子的水平，或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性被上调或下调，从而使得表达、水平或活性大于或小于在没有调节剂的情况下所观察到的。例如，术语“调节”可以意指“抑制”，但词语“调节”的使用不限于所述定义。[0057]所谓“抑制”、“下调”或“降低”指的是基因的表达，或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的mrna分子或等效rna分子的水平，或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性被降低到低于在不没有本发明的核酸分子（例如，sirna）的情况下所观察到的。在一个实施方案中，用修饰的sirna分子的抑制、下调或降低低于在有无活性或对照分子的情况下或在没有sirna分子的情况下观察到的水平。在另一个实施方案中，用sirna分子的抑制、下调或降低低于在有例如具有混乱序列或具有错配的sirna分子的情况下观察到的水平。在另一个实施方案中，用本发明的修饰的sirna组合物对表达的抑制、下调或降低在有所述修饰的sirna分子的情况下大于在其不存在或存在未修饰的sirna分子的情况下。在一个实施方案中，表达的抑制、下调或降低与转录后沉默有关，例如rnai介导的靶核酸分子（例如，rna或mrna）的切割或基因产物翻译的抑制。在一个实施方案中，抑制、下调或降低表达与细胞中bcl-2mrna的翻译前沉默有关。[0058]术语“b-细胞淋巴瘤2”或“bcl-2”或“bcl2”意指分别在refseqng_009361.1、nm_000633、np_000624中所述的基因、rna转录物和蛋白，包括其部分和其同种型α（nm_000633.2、np_000624.2）和βnm_000657.2、np_000648.2，其由bcl-2基因编码，所述基因是经由内在的凋亡途径调节线粒体调节的细胞死亡的调节蛋白的bcl-2家族的成员。bcl-2是众所周知的整合外线粒体膜蛋白，其通过结合bad和bak蛋白来阻断细胞的凋亡死亡。例如，有许多已知的bcl-2抑制剂，例如bcl2抑制剂的非限制性例子包括维奈托克（c45h50cln7o7s，genentech,inc.），反义寡核苷酸，例如奥利默森（oblimersen）（genasense;gentainc.），bh3模拟小分子抑制剂，包括abt-737（abbottlaboratories,inc.），abt-199（abbottlaboratories,inc.）和奥巴克拉（obatoclax）（cephaloninc.）。[0059]修饰的短干扰核糖体核酸制剂本公开内容揭示了本发明的修饰的sirna组合物显示出作为抗癌治疗的有效功效。因此，本公开内容还涉及包含本文所述的修饰的sirna组合物的制剂或包含其组合即至少两种不同的修饰的sirnas的制剂。在某些实施方案中，制剂可以包括药物制剂，其包含上述核酸组合物和其他已知的药理学试剂，例如一种或多种药学上可接受的载体。[0060]在一些实施方案中，制剂由结合bcl-2核苷酸序列的本公开内容的sirna组合物组成。在具体实施方案中，制剂包含短干扰rna组合物，所述组合物具有结合bcl-2mrna的修饰的核苷酸序列。[0061]在某些情况下，制剂包含短干扰rna组合物，所述短干扰rna组合物具有从5'到3'的修饰的核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。在另一个实施方案中，制剂包含短干扰rna组合物，所述短干扰rna组合物具有结合bcl-2mrna的修饰的核苷酸序列且具有从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。在又另一个实施方案中，制剂包含短干扰rna组合物，所述短干扰rna组合物具有结合bcl-2mrna的修饰的核苷酸序列且具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0062]术语“药学上可接受的载体”在本文中如与药学上可接受的稀释剂、媒介物或赋形剂同义的那样使用。取决于其中的制剂或sirna组合物的类型和预期的施用方式，sirna组合物可以溶解或悬浮（例如，作为乳剂）在药学上可接受的载体中。药学上可接受的载体可以是液体或固体化合物、材料、组合物和/或剂型的任何一种，它们在合理的医学判断范围内适合与主体的组织接触使用。载体在不对被提供给的主体有害并且与制剂的其他成分相容即不改变它们的生物或化学功能的意义上应该是“可接受的”。[0063]可用作药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；明胶；滑石；蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二元醇类，例如乙二醇和丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂；水；等渗盐水；ph缓冲溶液；和其他用于药物制剂中的无毒相容物质。药学上可接受的载体还可以包括制造助剂（例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸）、溶剂或胶囊化材料。如果期望，可以添加某些增甜剂和/或调味剂和/或着色剂。其他合适的赋形剂可以在标准药学教科书中找到，例如在“remington'spharmaceuticalsciences”,thescienceandpracticeofpharmacy,第19版.mackpublishingcompany,easton,pa.,(1995)中。[0064]在一些实施方案中，药学上可接受的载体可以包括稀释剂，其增加固体药物组合物的体积并使药物剂型更易于患者和护理人员处理。用于固体组合物的稀释剂包括，例如，微晶纤维素（例如，avicel®）、超细纤维素、乳糖、淀粉、预凝胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡萄糖结合剂（dextrates）、糊精、葡萄糖、磷酸氢钙二水合物、正磷酸钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、甘露糖醇、聚甲基丙烯酸酯（例如，eudragit®）、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨糖醇和滑石。[0065]在某些实施方案中，本公开内容的制剂包括纳米颗粒。适合用于本发明制剂的纳米颗粒是本领域普通技术人员已知的。例如，本公开内容的制剂可以包含有效量的至少一种修饰的sirna组合物和金纳米颗粒、铁芯磁性可富集纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒或它们的组合。[0066]在一个实施方案中，本公开内容的制剂可以包含有效量的至少一种修饰的sirna组合物和转染剂，例如聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺盐酸化物、脱酰基聚乙烯亚胺和oligofectamine。然而，用于本发明制剂的其他转染剂是本领域普通技术人员已知的。[0067]在一些情况下，本公开内容的短干扰核酸组合物可以根据本领域已知的方法配制成组合物和剂型。在某些实施方案中，配制的组合物可以具体配制用于以固体或液体形式施用，包括适合于以下的那些：（1）口服施用，例如，片剂、胶囊、粉末、颗粒、用于应用于舌的糊剂、水或非水溶液或悬浮液、浸液或糖浆；（2）肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液通过皮下、肌内或静脉内注射；（3）局部应用，例如，作为应用于皮肤、肺或黏膜的乳膏、软膏或喷雾剂；或（4）阴道内或直肠内，例如，作为阴道栓、乳膏或泡沫；（5）舌下或口腔含化；（6）眼；（7）经皮；或（8）鼻。[0068]在一些实施方案中，本公开内容的制剂包括压制成剂型例如片剂的固体药剂，可以包括赋形剂，其功能包括在压缩后帮助将活性成分和其他赋形剂结合在一起。用于固体药物组合物的粘合剂包括阿拉伯胶、藻酸、卡波姆（例如卡波泊尔）、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜耳胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素（例如klucel®）、羟丙基甲基纤维素（例如methocel®）、液体葡萄糖、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯酮（例如kollidon®、plasdone®）、预凝胶化淀粉、藻酸钠和淀粉。[0069]通过向组合物添加崩解剂可以增加压制的固体药物组合物在主体胃中的溶解速率。崩解剂包括藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠（例如ac-di-sol®、primellose®）、胶体二氧化硅、交联甲羧纤维素钠、交联聚乙烯吡咯酮（crospovidone）（例如kollidon®、polyplasdone®）、瓜耳胶、硅酸铝镁、甲基纤维素、微晶纤维素、聚克立林（polacrilin）钾、粉状纤维素、预凝胶化淀粉、藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠（例如explotab®）和淀粉。[0070]因此，在某些实施方案中，可将助流剂添加到制剂中以提高非压制的固体试剂的流动性和提高给药准确度。可起助流剂作用的赋形剂包括胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石和正磷酸钙。[0071]当通过压制粉末组合物制备剂型例如片剂时，所述组合物经受来自冲压机和染料的压力。一些赋形剂和活性成分有黏附在冲压机和染料表面的趋势，这可导致产品具有纹孔式和其他表面不规则性。可以将润滑剂添加到组合物中以降低黏附并使得容易从染料中释放产品。润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、甘油单硬脂酸酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯（glycerylpalmitostearate）、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酰延胡索酸钠、硬脂酸、滑石和硬脂酸锌。[0072]可通过湿法制粒（wetgranulation）制备用于压片或胶囊填充的配制的药物组合物。在湿法制粒中，将一些或所有粉末形式的活性成分和赋形剂掺合，且然后在有导致粉末聚集成颗粒的液体（一般是水）的情况下进一步混合。将颗粒筛分和/或研磨，干燥，且然后筛分和/或研磨至期望的颗粒大小。然后可以将颗粒压片，或者可以在压片之前添加其他赋形剂，例如助流剂和/或润滑剂。压片组合物可以常规地通过干掺合来制备。例如，活性物和赋形剂的掺合的组合物可以压制成条或片，且然后粉碎成压实的颗粒。接着可将压实的颗粒压缩成片剂。[0073]在其他实施方案中，作为干法制粒（drygranulation）的备择方案，可以使用直接压缩技术将掺合的组合物直接压缩成压制的剂型。直接压缩产生更均匀的无颗粒片剂。特别地十分适合直接压缩压片的赋形剂包括微晶纤维素、喷雾干燥的乳糖、磷酸二钙二水合物和胶体二氧化硅。这些和其他赋形剂在直接压缩压片中的正确使用对于在直接压缩压片的特定制剂挑战方面具有经验和技能的本领域技术人员来说是已知的。胶囊填充可以包括参考压片所描述的任何上述掺合物和颗粒；然而，它们没有经受最后的压片步骤。[0074]在本公开内容的液体药物组合物（即，制剂）中，试剂（修饰的sirna组合物）和任何其他固体赋形剂溶解或悬浮在液体载体中，例如水、注射用水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油。液体药物组合物可含有乳化剂以在整个组合物中均匀分散不溶于液体载体的活性成分或其他赋形剂。液体制剂可以用作可注射、肠或润滑药类型的制剂。可用于本发明液体组合物中的乳化剂包括，例如，明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯胶、西黄蓍胶、角叉菜、果胶、甲基纤维素、卡波姆、十六醇十八醇混合物和鲸蜡醇。[0075]在一些实施方案中，本公开内容的液体药物组合物还可以含有黏度增强剂以改善产品的口感和/或覆盖胃肠道的衬里。这种试剂包括阿拉伯胶、藻酸皂土、卡波姆、羧甲基纤维素钙或钠、十六醇十八醇混合物、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶瓜耳胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糖糊精、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、碳酸丙二酯（propylenecarbonate）、藻酸丙二酯、藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠、淀粉西黄蓍胶和黄原胶。[0076]在其他实施方案中，本公开内容的液体组合物还可以含有缓冲液，例如葡糖酸、乳酸、柠檬酸或乙酸、葡糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或乙酸钠。[0077]防腐剂和螯合剂，如醇、苯甲酸钠、丁化羟基甲苯、丁化羟基苯甲醚和乙二胺四乙酸，可以以对于摄食安全的水平添加以提高贮藏稳定性。也可以使用任何药学上可接受的着色剂对固体和液体组合物进行染色，以改善它们的外观和/或便于患者识别产品和单位剂量水平。[0078]本公开内容的剂量制剂可以是在硬壳或软壳内含有组合物，例如，本公开内容的粉末状或颗粒状固体组合物的胶囊。壳可由明胶制成并且任选地含有增塑剂例如甘油和山梨糖醇，以及不透明剂或着色剂。[0079]在某些情况下，本公开内容的制剂将在没有用于靶向癌细胞的靶向剂、载体或其他媒介物的情况下包含有效量的至少一种修饰的sirna组合物。在一个实施方案中，这种制剂将是液体，并且适合于注射。在一些情况下，将配制用于向主体静脉内注射的液体组合物。在其他情况下，将配制用于直接注射到肿瘤或其细胞中的液体组合物。[0080]用于治疗癌症的方法如上所述的，本公开内容的修饰的短干扰核糖体核酸组合物及其制剂当与相应的未修饰的sirna的外源表达和/或其他已知癌症疗法所表现出的活性相比时显示出出乎意料的和优越的抗癌活性。参见图3a-3c。因此，本公开内容的另一方面提供了一种用于通过向哺乳动物施用有效量的一种或多种本公开内容的修饰的sirna组合物或其制剂来治疗哺乳动物中癌症的方法。[0081]如图2a至2c所示的，本公开内容的示例性修饰的sirna组合物（即，seqidno：2）在有或没有递送媒介物的情况下结合bcl-2mrna并抑制癌细胞中的bcl-2蛋白表达。[0082]此外，且如图3a-3b所示的，本文所述的示例性修饰的sirna通过诱导凋亡以及细胞生存力来减少结肠直肠癌和淋巴瘤。更具体地，如seqidno:2所示的所有u碱基都被5-fu分子置换的修饰的sirnas降低结肠直肠癌细胞生存力（图3a）和淋巴瘤细胞生存力（图3b）。此外，测试了本发明修饰的sirna组合物，且发现当与已知的淋巴瘤癌症治疗组合物（例如，维奈托克）比较时，其在淋巴瘤细胞中的治疗功效中提供了出乎意料的增加。参见，例如，图3c和3d。因此，所公开的用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的主体施用一种或多种本公开内容的修饰的短干扰核糖体核酸组合物。[0083]在某些实施方案中，修饰的短干扰核糖体核酸组合物可以作为包含如上所述的修饰的核酸组合物的制剂施用。在具体实施方案中，本公开内容的核酸组合物可以在没有递送媒介物或药物载体的情况下（即，裸露的）施用。参见，例如，图2a和2c。[0084]如本文所用的术语“主体”指任何哺乳动物。哺乳动物可以是任何哺乳动物，尽管本文的方法更一般地涉及人。如本文所用的短语“有需要的主体”包括在术语主体内并且指任何需要治疗的哺乳动物主体，特别是癌症或具有医学上确定的癌性或癌前状况的升高的风险。在具体实施方案中，主体包括人癌症患者。[0085]术语“治疗（treatment）”、“治疗（treat）”和“治疗（treating）”与术语“施用有效量”同义。这些术语应意指意图治愈、改善、稳定、减轻疾病、病理状况或病症例如癌症的一种或多种症状或预防疾病、病理状况或病症例如癌症的主体的医学管理。这些术语可互换使用，且包括积极疗法，即，具体目的在于疾病、病理状况或病症的改善的治疗，且还包括病因疗法，即，目的在于去除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，治疗包括姑息疗法，即，设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防疗法，即，目的在于最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；和支持疗法，即，用于补充另一种目的在于改善相关疾病、病理状况或病症的具体疗法的治疗。可理解的是，治疗虽然意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症，但不需要实际上导致治愈、改善、稳定或预防。治疗的效果可以如本文所述的和如本领域已知适合于所涉及的疾病、病理状况或病症的那样测量或评估。这种测量和评估可以在定性和/或定量意义上进行。因此，例如，可以将疾病、病理状况或病症的特征或特点和/或疾病、病理状况或病症的症状降低到任何效果或降低到任何量。在具体的实施方案中，疾病例如癌症的治疗包括抑制癌细胞的增殖。在一些实施方案中，癌症的治疗可以通过检测主体中增殖癌细胞量的减少、肿瘤生长或肿瘤大小的减少来确定。[0086]在某些实施方案中，本公开内容的修饰的短干扰核糖体核酸组合物用于治疗癌症。[0087]如本文所用的，术语“癌症”包括由异常细胞不受控制的分裂和生长引起的任何疾病，包括例如肿瘤的恶性和转移性生长。术语“癌症”还包括癌前状况或特征在于升高的癌性或癌前状况风险的状况。癌症或初癌（致瘤性状况）可以位于身体的任何部分，包括内部器官和皮肤。如众所周知的，癌症通过经由淋巴结和血管侵入肿瘤周围的正常、非癌性组织，以及在肿瘤侵入主体的静脉、毛细血管和动脉后通过血液贯穿主体扩散。当癌细胞离开原发肿瘤（“转移”）时，继发肿瘤遍及受折磨的主体发生，从而形成转移性病变。[0088]使用本发明方法治疗的适用癌细胞的一些非限制性实例包括肺、结肠、直肠、血液、淋巴系统或免疫系统。癌症或肿瘤还可以包括一种或多种癌、肉瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤或畸胎瘤（生殖细胞肿瘤）的存在。[0089]在具体实例中，已显示修饰的sirna组合物通过遍及以下实验模型结肠直肠癌细胞（图3a）和淋巴瘤细胞（图3b-3d）增加凋亡来减少癌细胞增殖。[0090]在一些实施方案中，施用包括本公开内容的修饰的sirna的治疗的主体患有结肠直肠癌，或具有医学上确定的升高的患结肠直肠癌的风险。[0091]在某些实施方案中，本公开内容的主体患有肺癌，或具有医学上确定的升高的患肺癌的风险。[0092]在其他实施方案中，主体患有淋巴瘤，或具有医学上确定的升高的患淋巴瘤的风险。[0093]根据本公开内容，治疗癌症的方法包括通过本领域通常已知的任何途径施用本发明的一种或多种短干扰核糖体核酸组合物。这包括，例如，（1）口服施用；（2）肠胃外施用，例如，通过皮下、肌内或静脉内注射；（3）局部施用；或（4）阴道内或直肠内施用；（5）舌下或口腔含化施用；（6）眼施用；（7）经皮施用；（8）鼻施用；和（9）直接施用于有需要的器官或细胞。[0094]在具体实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物通过注射施用于主体。在一个实施方案中，静脉内注射治疗有效量的修饰的sirna组合物。在另一个实施方案中，将治疗有效量的修饰的sirna组合物腹膜内或皮下注射到肿瘤或其细胞。[0095]施用的本公开内容的核酸组合物的量（剂量）取决于若干因素，包括癌症的类型和病期、附属或辅助药物的存在或不存在以及主体的重量、年龄、健康和对试剂的耐受性。取决于这些各种因素，剂量可以是，例如，约2mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约15mg/kg体重、约20mg/kg体重、约25mg/kg体重、约30mg/kg体重、约40mg/kg体重、约50mg/kg体重、约60mg/kg体重、约70mg/kg体重、约80mg/kg体重、约90mg/kg体重、约100mg/kg体重、约125mg/kg体重、约150mg/kg体重、约175mg/kg体重、约200mg/kg体重、约250mg/kg体重、约300mg/kg体重、约350mg/kg体重、约400mg/kg体重、约500mg/kg体重、约600mg/kg体重、约700mg/kg体重、约800mg/kg体重、约900mg/kg体重或约1000mg/kg体重，其中术语“约”通常理解为在指示值的±10%、5%、2%或1%内。剂量也可以在由上述值中的任何两个定界的范围内。常规实验可用于通过监控组合物或其制剂对癌性或癌前状况的作用或修饰的sirna的表达对bcl-2蛋白或核酸序列表达的作用或疾病病理学来确定每个个体主体的适当剂量方案，所有这些都可以根据本领域中已知的方法频繁且容易地监控。取决于上面讨论的各种因素，任何上述示例性剂量的核酸都可以每天、每周或每月一次、两次或多次施用。[0096]本文所述的核酸组合物以及任选地任何额外的化疗剂供当前方法使用的的能力可以使用本领域众所周知的药理学模型来确定，例如细胞毒性测定、凋亡染色测定、异种移植测定和结合测定。[0097]本文所述的本发明的短干扰核酸组合物可以或可以不也与一种或多种化疗剂共同施用，所述化疗剂可以是不同于本文所述的核酸组合物的附属或辅助药物。[0098]如本文所用的，“化学疗法”或短语“化疗剂”是用于治疗癌症的试剂。与本文所述的方法一起使用的化疗剂包括，例如，直接或间接调节bmi1的任何试剂。化疗剂的实例包括：抗代谢物，例如甲氨蝶呤和基于氟嘧啶的嘧啶拮抗剂，5-氟尿嘧啶（5-fu）（carac®乳膏、efudex®、fluoroplex®、adrucil®）和s-1；抗叶酸剂（antifolates），包括聚谷氨酸抗叶酸化合物（polyglutamatableantifolatecompounds）；雷替曲塞（tomudex®），gw1843和培美曲塞（pemetrexed）（alimta®）和非聚谷氨酸抗叶酸化合物；诺拉曲塞（nolatrexed）（thymitaq®），普来曲塞（plevitrexed），bgc945；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特；和嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶、依诺他宾、氟尿苷。在本公开内容的具体实施方案中，化疗剂是能够抑制和异常细胞增殖或凋亡中牵连的信号传导途径有关的基因或基因产物（如例如bcl2、胸苷酸合酶或e2f3）的表达或活性的化合物；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。[0099]e2f转录因子3，e2f3（refseqng_029591.1，nm_001243076.2，np_001230005.1）是一种转录因子，其与dna结合并与效应蛋白包括但不限于成视网膜细胞瘤蛋白相互作用，以调节与细胞周期调节有关的基因的表达。因此，任何抑制e2f3表达的药物在本文中都可以被认为是共同药物（co-drug）。[0100]胸苷酸合酶（refseq:ng_028255.1，nm_001071.2，np_001062.1）是一种普遍存在的酶，其催化dump的必需甲基化以产生构成dna的四种碱基之一dtmp。反应需要chh4-叶酸作为辅因子，既作为甲基供体，又独特地作为还原剂。对chh4-叶酸的恒定需要意指胸苷酸合酶活性与负责补充细胞叶酸库的两种酶：二氢叶酸还原酶和丝氨酸转羟甲基酶的活性有强烈联系。胸苷酸合酶是30-35kda亚基的同二聚体。活性位点同时结合叶酸辅因子和dump底物两者，其中dump经由亲核半胱氨酸残基与酶共价结合（参见，carreras等人,annu.rev.biochem.,(1995)64:721-762）。胸苷酸合酶反应是产生用于并入dna的dctp和dttp的嘧啶生物合成途径的关键部分。所述反应是dna复制和细胞生长所需要的。因此，所有快速分裂的细胞例如癌细胞都需要胸苷酸合酶活性。由于其与dna合成以及因此与细胞复制的联系，胸苷酸合酶多年来一直是抗癌药物的靶。胸苷酸合酶抑制剂的非限制性实例包括叶酸和dump类似物，例如5-氟尿嘧啶（5-fu）。任何抑制胸苷酸合酶表达的药物在本文中都可以被认为是共同药物。[0101]b细胞淋巴瘤2（bcl-2），（refseqng_009361.1、nm_000633、np_000624）包括其同种型α（nm_000633.2、np_000624.2）和β（nm_000657.2、np_000648.2），由bcl-2基因编码，其是经由内在的凋亡途径调节线粒体调节的细胞死亡的调节蛋白的bcl2家族的成员。bcl2是整合外线粒体膜蛋白，其通过结合bad和bak蛋白来阻断细胞的凋亡死亡。[0102]在具体的实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物与已知的bcl-2抑制剂一起施用，如例如，维奈托克（c45h50cln7o7s，genentech,inc.），反义寡核苷酸，例如奥利默森（genasense;gentainc.），bh3模拟小分子抑制剂，包括abt-737（abbottlaboratories,inc.），abt-199（abbottlaboratories,inc.）和奥巴克拉（cephaloninc.）。在一个实施方案中，将本公开内容的修饰的sirna组合物与维奈托克（ventoclax）一起施用于主体。在具体实施方案中，将本公开内容的修饰的sirna组合物与维奈托克一起施用于患有淋巴瘤的主体。[0103]化疗剂可以在开始用核酸组合物的疗法之前、期间或之后施用。[0104]在具体实施方案中，其他核酸是短发夹rna（shrna）、mirna、修饰的mirna或与bcl-2核酸序列的一部分结合或互补的其他形式的核酸。[0105]如果期望，本文所述的短干扰核酸组合物的施用可以与一种或多种非药物疗法组合，如例如放射治疗和/或外科手术。如本领域所众所周知的，可以在外科手术前给予放射治疗和/或化疗剂（在所述情况下，本文描述的核酸组合物，和任选地，任何额外的化疗剂）的施用，以例如在外科手术前缩小肿瘤或停止癌症扩散。如本领域也众所周知的，可以在外科手术后给予放射治疗和/或化疗剂的施用以破坏任何剩余的癌症。[0106]为了举例说明起见和描述本发明的某些特定实施方案，下面已陈述了实施例。然而，本发明的范围不以任何方式受限于本文所陈述的实施例。[0107]实施例实施例1：材料和方法。[0108]修饰的短干扰rnas。所有sirnas均通过自动寡核苷酸合成方法作为单链合成，并通过hplc纯化。将两条链（有义和反义）退火以制备与bcl-2mrna结合的双链修饰的sirnas。对于含有5氟尿嘧啶的与bcl-2mrna结合的修饰的sirna，使用了称为“2'-acerna合成”的方法。2'-acerna合成基于保护基方案，其中与2'-羟基上的酸不稳定原酸酯保护基（2'-ace）组合使用甲硅烷醚以保护5'-羟基。然后将所述保护基的组合与标准亚磷酰胺固相合成技术一起使用。参见，例如，s.a.scaringe,f.e.wincott和m.h.caruthers,j.am.chem.soc.,120(45),11820-11821(1998)；国际pct申请wo/1996/041809；m.d.matteucci,m.h.caruthers,j.am.chem.soc.,103,3185-3191(1981)；s.l.beaucage,m.h.caruthers,tetrahedronlett.22,1859-1862(1981)，其每一篇的全fischer）和抗-gapdh抗体（1:100000）（santacruz）探测蛋白。添加辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或兔第二抗体（1:5000，santacruzbiotechinc.）。然后使用supersignalwestpico化学发光底物（chemiluminescentsubstrate）（thermofischer）用放射自显影胶片显示蛋白条带。[0111]凋亡和细胞生存力测定。为了测量由示例性修饰的bcl2结合sirna组合物诱导的凋亡以及用示例性修饰的sirna或维奈托克处理后的细胞生存力，使用异硫氰酸荧光素（fitc）-膜联蛋白测定（bectondickinson）。转染前24小时，将细胞（1×105）个细胞/孔平板接种到6孔平板中。用各种浓度的示例性修饰的sirnas转染细胞或用各种浓度的维奈托克处理细胞。转染后48小时，收获细胞，按照制造商的规程用碘化丙啶和抗膜联蛋白-v抗体（膜联蛋白v-fitc凋亡检测试剂盒，invitrogen,ca,美国）染色，并通过流式细胞术检测染色的细胞。[0112]统计学分析。所有统计学分析均使用graphpadprism8软件进行。使用斯氏t-检验确定两组之间的统计学显著性。对于不止两组的比较，使用单因素方差分析（anova）。数据表示为平均值±标准差（s.d.）。[0113]实施例2：修饰的sirna核酸具有抗癌活性。[0114]在以下实验中，抗-bcl-2sirna分子（seqidno:1）的有义链和反义链中的所有尿嘧啶碱基都被5-fu置换以形成seqidno:2中所示的示例性修饰的sirna。参见图1b。为了测试所述sirna是否保留了抑制bcl-2并在没有转染媒介物的情况下被递送到癌细胞中的能力，在有或没有转染媒介物的情况下，用50nm对照sirna、与bcl2的一部分结合的未修饰的sirna或seqidno：2的修饰的sibcl2转染hct116结肠癌细胞和a549肺癌细胞。参见图2a。qrt-pcr用于评估转染后bcl-2的表达。[0115]图2a中描绘的数据显示，在有转染媒介物的情况下，未修饰的sibcl2和修饰的sibcl2两者都降低了细胞中bcl-2的表达，而在没有转染媒介物的情况下，未修饰的sibcl2对bcl-2mrna的水平没有影响，而修饰的sibcl2降低了bcl2mrna的水平。[0116]还检查了示例性修饰的sirna组合物对bcl-2蛋白水平的影响。如图2b和2c中所示的，当与mrna水平相比时，在蛋白水平上显示出类似的效果。在有转染媒介物的情况下，未修饰的sibcl2和修饰的sibcl2两者均抑制bcl-2蛋白表达。在没有转染媒介物的情况下，只有修饰的sibcl2能够抑制bcl-2表达。还用单独的5-fu处理癌细胞以显示单独的5-fu不导致bcl-2表达的降低。参见图2c和2d。这些数据提示，置换与bcl-2的一部分结合的sirna的尿嘧啶碱基不破坏靶结合，并且还允许sirna在没有转染媒介物的情况下进入细胞，这在单独的5-fu中没有显示。[0117]5-fu-sibcl2触发凋亡并且比维奈托克更有效。为了测量5-fu-sibcl2的治疗效果，并将其与已知的癌症治疗（即，维奈托克）进行比较，将凋亡测定和流式细胞术用于评估用本公开内容的示例性修饰的sirna分子、sibcl2或维奈托克处理后凋亡的诱导以及细胞生存力。[0118]图3a-3b显示结肠癌细胞（hct116，图3a）以及淋巴瘤细胞（toledo，图3b）通过施用seqidno：2中所示的示例性修饰的sirna比未修饰的sibcl2对照sirna更有效地被杀死。[0119]还在淋巴瘤细胞中将seqidno:2中所示的示例性修饰的sirna的治疗功效与fda批准的bcl-2选择性抑制剂维奈托克（abt-199）的治疗功效进行了比较。参见图3c-3d。图3c揭示seqidno：2中所示的示例性修饰sirna在诱导凋亡方面比维奈托克更有效。此外，观察到seqidno：2中所示的示例性修饰的sirna在比维奈托克更低的剂量有效抑制细胞生存力。参见图3d。[0120]总之，本公开内容显示新的sirna组合物可用于在没有递送媒介物的帮助并且不干扰靶结合和相互作用的情况下有效治疗结肠直肠、肺或淋巴瘤。此外，在诱导凋亡和抑制淋巴瘤细胞生存力方面，seqidno：2中所示的示例性修饰的sirna比已知的bcl-2抑制剂（例如，维奈托克）更有效。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：4.本公开内容总的来说涉及包含5-氟尿嘧啶（5-fu）分子的短干扰核糖体核酸（sirna）组合物。更具体地，本公开内容提供了含有一个或多个5-fu分子的修饰的sirna组合物及其使用方法。本技术还提供了包含本发明的短干扰核酸组合物的药物组合物和使用所述组合物治疗癌症的方法。
背景技术：
：：5.rna干扰（rnai）指由短干扰rnas介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程。参见例如，zamore等人，cell(2000)101:25-33和hamilton等人，science(1999)286:950-951。简而言之，细胞中双链rnas（dsrnas）的存在刺激称为切丁酶的核糖核酸酶iii酶的活性。参见，例如，zamore等人，cell.(2000)101:25-33。切丁酶与将dsrna加工成称为短干扰rnas（sirnas）的短dsrna片段有关。衍生自切丁酶活性的短干扰rnas一般长度约21至约23个核苷酸并包含约19碱基对双链体。同上。rnai反应还以通常称为rna诱导性沉默复合物（risc）的内切核酸酶复合物为特色，其介导具有与sirna双链体的反义链互补的序列的单链rna的切割。靶rna的切割发生在与sirna双链体的反义链互补的区域的中间。参见elbashir等人，genesdev.,(2001)15:188。rnai已被广泛研究，例如，tuschl等人，国际pct公开no.wo01/75164，描述了通过在培养的哺乳动物细胞包括人胚肾和hela细胞中引入合成的21-核苷酸rnas的双链体诱导的rnai。6.rna干扰看来似乎是抑制靶mrna翻译的有效技术，且最近fda批准基于sirna的疗法是其治疗潜力的显著的证明。hoy,sm.drugs(2018)78:1625-1631；和schutze,n.molcellendocrinol(2004)213:115-119。然而，多年以来，基于sirna的疗法由于递送媒介物的毒性而受到限制，并且限于某些器官部位，例如肝。例如，已知这些化合物在施用时易受酶降解，这导致差的稳定性。nikam,rr和gore,kr.nucleicacidther.(2018)28:209-224。此外，关于在本领域中使用sirna的研究提供了矛盾的结果。例如，研究已表明，用2'-脱氧（2'-h）或2'-o-甲基核苷酸完全取代一条或两条sirna链消除rnai活性，而用2'-脱氧核苷酸（2'-h）取代3'-末端sirna突出端核苷酸显示是耐受的。sirna双链体中心的单错配序列也显示消除rnai活性。此外，这些研究还表明，靶rna中切割位点的位置是由sirna指导序列的5'-端而非指导序列的3'-端限定的。参见elbashir等人，emboj.(2001)20:6877。其他研究已表明，sirna双链体的靶互补链上的5'-磷酸对于sirna活性是需要的，并且atp用于维持sirna上的5'-磷酸部分。参见nykanen等人，cell(2001)107:309。此外，某些研究已表明，一些碱基修饰，包括在sirna的有义和反义链中用4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶取代尿嘧啶，以及用肌苷取代鸟苷揭示了混乱和矛盾的结果。参见parrish等人，molecularcell(2000)6:1077-1087。例如，4-硫尿嘧啶和5-溴尿嘧啶取代看来似乎是耐受的，而其他取代如在反义链中并入5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶导致rnai活性显著降低。同上。7.根据世界卫生组织（worldhealthorganization），癌症是全世界死亡的主要原因，2015年导致880万人死亡。肺癌是美国男性和女性两者癌症死亡的主要原因，只有18.6%的被诊断患有肺癌的患者存活超过5年。surveillance,epidemiology,andendresultsprogram.seercancerstatfacts:lungandbronchuscancer.nationalcancerinstitute.bethesda,md(2018)。肺癌有两个主要类别：非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌由组织中存在的癌细胞类型进一步描述。因此，非小细胞肺癌分为以下肺癌亚类：鳞状细胞癌（也称为表皮样癌（epidermoidcarcinoma））、大细胞癌、腺癌（即，起源于衬于肺泡的细胞的癌症）、多形性、类癌肿瘤和唾液腺癌。同时，小细胞肺癌主要有两种类型：小细胞癌和混合小细胞癌。seercancerstatfacts:lungandbronchuscancer.nationalcancerinstitute.bethesda,md(2018)。非小细胞肺癌最常见的治疗是吉西他滨（2',2'-二氟2'脱氧胞苷）、红豆杉醇（例如，紫杉醇）、顺铂（一种dna交联剂）及其组合。然而，许多类型的基于抗体的治疗也用于治疗非小细胞肺癌（例如，吉非替尼（gefitinib）、派姆单抗（pembrolizumab）、阿来替尼（alectinib））。小细胞肺癌通常由基于甲氨蝶呤、盐酸阿霉素和拓扑替康的化疗剂治疗。8.结肠直肠癌（crc）是美国第三最常见的恶性肿瘤以及第二最常见的癌症相关死亡原因。参见，hegdesr,等人，expertreviewofgastroenterology&hepatology.(2008)2(1)pp.135-49。有许多用于治疗癌症的化疗剂；然而，嘧啶拮抗剂，例如基于氟嘧啶的化疗剂（例如，5-氟尿嘧啶，s-1）是治疗结肠直肠癌的金标准。嘧啶拮抗剂，阻断含有嘧啶的核苷酸（dna中的胞嘧啶和胸腺嘧啶；rna中的胞嘧啶和尿嘧啶）的合成。因为当与内源性核苷酸相比时，嘧啶拮抗剂具有相似的结构，所用它们与天然嘧啶竞争以抑制与复制过程有关的关键酶活性，从而导致阻止dna和/或rna合成和抑制细胞分裂。9.免疫/淋巴系统的淋巴瘤或癌症，例如，何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤，是癌症的常见形式。通常，淋巴瘤包括例如淋巴结、脾、胸腺和骨髓的肿瘤。淋巴瘤的主要类型是何杰金淋巴瘤（即，何杰金病）、非何杰金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、皮肤b-细胞淋巴瘤、皮肤t-细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。批准用于治疗淋巴瘤的药物包括，例如，盐酸阿霉素、5-fu、环磷酰胺、地塞米松、氮烯咪胺（decarbazine）、甲氨蝶呤、利妥昔单抗（rituximab）、依鲁替尼（ibrutinib）、杜韦利西布（duvelisib）、派姆单抗、维奈托克（venetoclax）和达沙替尼（dasatinib）。10.5-氟尿嘧啶（即，5-fu，或更具体地，5-氟-1h-嘧啶-2,4-二酮）是众所周知的嘧啶拮抗剂，其用于许多辅助化疗药物，例如carac®乳膏、efudex®、fluoroplex®和adrucil®。非常确实的是，5-fu靶向关键酶胸苷酸合酶（tyms或ts），其催化脱氧尿苷酸（dump）甲基化为脱氧胸苷酸（dtmp），dna生物合成中的必需步骤。danenbergp.v.,biochim.biophys.acta.(1977)473(2):73-92。11.尽管如此，但是现有的癌症疗法仍处于初期，仍有许多障碍等待改进或克服。例如，众所周知，尽管在治疗多种癌症中相当有效，但5-fu具有相当大的毒性，并且可引出许多不利副作用。此外，已知肿瘤细胞通过发展对常见的治疗剂（例如5-fu）的抗性来回避凋亡途径。参见gottesmanm.m.等人，naturereviewscancer,(2002)2(1):48-58。12.b-细胞淋巴瘤2（bcl-2）是由bcl2基因编码的线粒体膜蛋白，且是抑制程序性细胞死亡（凋亡）的bcl-2调节蛋白家族的创始成员。cory,s和adams,jmt.natrevcancer(2002).2:647-656。因此，已经进行了许多尝试以靶向bcl2作为和癌症作斗争的治疗策略，包括fda批准的维奈托克（venetoclax）。参见leverson,jd等人，cancerdiscov(2017)7:1376-1393。13.考虑到上述，在用于治疗癌症的更有效、更稳定且更低毒性的药疗法中将具有显著的益处。技术实现要素：14.在不受任何一种特定理论束缚的情况下，本公开内容的前提是发现用5-fu分子置换短干扰rna（sirna）分子的核苷酸序列内的尿嘧啶（u）碱基通下述增加5-fu的功效：向细胞提供5-fu，在那里sirna将靶向bcl-2，通过结合bcl-2核苷酸序列（mrna）抑制bcl-2蛋白合成，以及细胞内释放5-fu以抑制胸苷酸合酶（ts）以治疗癌症，如结肠直肠癌、肺癌和淋巴瘤。15.本公开内容证明用5-fu分子置换至少一个尿嘧啶碱基的修饰的sirna作为抗癌剂具有特别的功效。此外，本文的数据显示使细胞与本公开内容的修饰的sirna组合物接触通过经由调节凋亡途径抑制癌细胞增殖来治疗癌症。此外，显示本公开内容的修饰的sirnas保留bcl-2核酸序列靶特异性，可以在不使用有害和无效的递送媒介物（例如，纳米颗粒）的情况下递送，并且当与已知的bcl-2治疗剂（例如，维奈托克）比较时表现出增强的效力。16.因此，在本公开内容的一个方面，描述了包含修饰的sirna核苷酸序列的核酸组合物，所述修饰的sirna核苷酸序列具有至少一个已被5-fu分子置换的尿嘧啶碱基（u，u-碱基）。在某些实施方案中，修饰的sirna具有不止一个或恰好一个已被5-氟尿嘧啶置换的尿嘧啶。在一些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列用5-fu分子置换了两个、三个、四个、五个或更多个尿嘧啶碱基。在具体实施方案中，抗bcl-2短干扰rna的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。17.在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换。在另一个实施方案中，双链抗-bcl-2短干扰rna的第一链中的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。在某些实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换，并且一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换并且没有尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被5-fu分子置换。在具体的实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换并且一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在一个实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换，并且没有尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在一些实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链。在其他实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链，且第二链是反义链。18.在具体实施方案中，核酸组合物包含双链sirna核苷酸序列，所述序列已通过用5-fu分子置换至少一个尿嘧啶碱基而被修饰。更具体地，核酸组合物是双链rna分子，其含有与bcl-2mrna核苷酸序列的一部分结合的至少以下从5'到3'的核苷酸序列：ggaugccuuuguggaacuguauu[seqidno.1]和互补链，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0019]在一种情况下，本公开内容的修饰的sirna恰好包含一个已被5-fu分子置换的sirna核苷酸序列的尿嘧啶碱基。在其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少两个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在又其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少三个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少四个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少五个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在其他实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少六个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一个实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少七个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在具体实施方案中，sirna核苷酸序列的所有尿嘧啶碱基均各自被5-fu分子置换。可以对双链sirna组合物的第一链（例如，有义链）或互补的第二链（例如，反义链）进行对本公开内容的任何sirna组合物的修饰。在优选的实施方案中，对第一（有义）链和第二（反义）链两者进行对sirna分子的修饰。[0020]在示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从5'到3'的修饰的sirna核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0021]在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0022]在又另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0023]本公开内容还预期具有至少一个被除5-氟尿嘧啶以外的5-卤尿嘧啶（5-halouracil）置换的尿嘧啶碱基的修饰的sirna组合物。因此，在本公开内容的一些修饰的sirna组合物中，一个或多个尿嘧啶碱基被例如5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氟尿嘧啶或其组合置换。在某些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是相同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是不同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止两个5-卤尿嘧啶，由此修饰的sirna核苷酸序列包含不同的5-卤尿嘧啶的组合。[0024]本公开内容还涉及含有本文所述的修饰的sirna组合物的制剂或包含其组合即至少两种不同的修饰的sirnas的制剂。在某些实施方案中，制剂可以包括药物制剂，其包含上述核酸组合物和其他已知的药理学试剂，例如一种或多种药学上可接受的载体。[0025]本公开内容揭示了本发明的修饰的sirnas表现出作为抗癌治疗的有效功效。值得注意的是，所测试的每种修饰的sirna核酸组合物都降低了癌细胞生存力、肿瘤生长和发展。[0026]因此，本公开内容的另一方面涉及用于治疗癌症的方法，其包括向主体施用有效量的一种或多种本文所述的核酸组合物。在本方法的某些实施方案中，核酸组合物包含结合bcl-2mrna的修饰的sirna，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个尿嘧啶碱基被5-氟尿嘧啶分子置换。[0027]在具体实施方案中，本公开内容的sirna组合物结合bcl-2mrna且具有从5'到3'的修饰的核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0028]在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物结合bcl-2mrna且具有从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0029]在又另一个实施方案中，在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物结合bcl-2mrna且具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0030]在一些情况下，通过本方法治疗的主体是哺乳动物。在某些实施方案中，被治疗的主体是人、狗、马、猪、小鼠或大鼠。在具体实施方案中，主体是已被诊断为患有癌症或已被鉴定为具有发展癌症的倾向的人。在一些实施方案中，被治疗的癌症可以是例如肺癌、结肠直肠癌或淋巴瘤。在具体实施方案中，被治疗的癌症是结肠直肠癌。在某些实施方案中，被治疗的癌症是肺癌。在一个实施方案中，被治疗的癌症是淋巴瘤。附图说明[0031]图1a-1d.本公开内容的示例性短干扰rna核苷酸序列的化学表示。a）seqidno:1中所示的未修饰的短干扰bcl-2rna（sibcl2）的化学表示。b）如seqidno:2所示的示例性的修饰的sibcl2rna的化学表示，由此有义链和反义链两者中的所有尿嘧啶残基都在sibcl2中被5-fu置换。c）如seqidno:3所示的示例性的修饰的sibcl2rna的化学表示，由此有义链中的所有尿嘧啶残基都在sibcl2中被5-fu置换。d）如seqidno:4所示的示例性的修饰的sibcl2rna的化学表示，由此反义链中的所有尿嘧啶残基都在sibcl2中被5-fu置换。所描绘的每种sirna的方向都由5'到3'（有义）或3'到5'（反义）指定提供。[0032]图2a-2c.示例性的修饰的sirna分子保持bcl2靶特异性和抑制靶（bcl-2）表达的能力。a）qrt-pcr分析显示在结肠癌细胞（hct116）和肺癌细胞（a549）中，seqidno:2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在mrna水平上抑制bcl-2。（p《0.001）b）5-fu-sibcl2在有或没有转染媒介物的情况下抑制bcl-2表达，以及从而抑制癌症进展。蛋白印迹证明在hct116结肠癌细胞中，seqidno:2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在有或没有转染媒介物的情况下在蛋白水平抑制bcl-2表达，且这不是单独5-fu的效果。c）蛋白印迹证明在a549肺癌细胞中，seqidno:2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在有或没有转染媒介物的情况下在蛋白水平抑制bcl-2表达，且这不是单独5-fu的效果。[0033]图3a-3d.示例性的修饰的sirna分子在结肠癌和淋巴瘤细胞中诱导凋亡并且比已知的治疗剂更有效地杀死癌细胞。a）在有或没有转染媒介物的情况下，50nmseqidno：2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在hct116结肠癌细胞中诱导凋亡。（p《0.05）b）在有或没有转染媒介物的情况下，50nmseqidno：2的示例性的修饰的sirna（5-fu-sibcl2）在toledo淋巴瘤细胞中诱导凋亡。（p《0.05）c）5-fu-sibcl2在诱导凋亡中比维奈托克更有效。（p《0.05）d）5-fu-sibcl2以低于维奈托克的剂量抑制淋巴瘤细胞生存力。具体实施方式[0034]本公开内容提供了与bcl-2核酸序列结合并并入一个或多个5-氟尿嘧啶（5-fu）分子的短干扰核糖体核酸（sirna）组合物。在不受任何一种特定理论束缚的情况下，令人惊讶的是，本公开内容揭示了用5-卤尿嘧啶（例如，5-氟尿嘧啶）置换结合bcl-2mrna的双链sirna组合物的至少一条链中的尿嘧啶核苷酸增加sirna抑制癌症发展、进展和肿瘤发生的能力。此外，本文的数据显示，将几种类型的癌细胞与本公开内容的修饰的sirna组合物接触通过经由bcl-2mrna翻译的抑制来调节凋亡途径而减少了癌症进展。此外，显示本发明的修饰的sirna保留了对bcl-2mrna的靶特异性，可以在不使用有害和无效的递送媒介物（例如，纳米颗粒）的情况下递送，并且与结合bcl-2mrna的未修饰的sirna组合物比较时表现出增强的效力。因此，本公开内容提供了各种短干扰核酸组合物，其具有在其核酸序列中并入的5-氟尿嘧啶分子，以及使用所述组合物以治疗癌症的方法。本公开内容进一步提供了由修饰的sirna组合物组成的药物制剂，以及用于治疗癌症的方法，其包括将所述药物制剂施用于有需要的主体。[0035]修饰的短干扰核糖体核酸组合物。[0036]术语“短干扰rna”、“sirna分子”和“sirna”在本文中可互换使用，以意指能够抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子，例如通过以核苷酸序列特异性方式介导rna干扰“rnai”或基因沉默。本发明的sirna分子的非限制性实例显示在图1b-1d和本文的实施例1-2中。例如，sirna可以是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列（例如，bcl-2）或其部分的核苷酸序列。sirna可以从两条分开的寡核苷酸装配而成，其中一条链是有义链，且另一条是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的（即每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列）；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区为约15至约30，例如14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个碱基对；反义链包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列（例如，sirna分子的15至25个或更多个核苷酸与靶核酸或其一部分互补）。在某些实施方案中，术语sirna包括sirna的双链体（即，双链）形式和在5'至3'方向和互补链在3'至5'方向的sirna的单链形式两者。在具体实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物由具有彼此互补的第一链和第二链的双链组合物组成。[0037]如本文所用的术语“互补性”或“互补的”应意指核酸可以通过传统的沃森-克里克或其他非传统类型与另一核酸序列形成一个或多个氢键。关于本发明的核酸分子，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能进行，例如，rnai活性。核酸分子的结合自由能的测定在本领域中是众所周知的。参见，例如，frier等人，proc.nat.acad.sci.usa(1986)83:9373-9377。百分比互补性表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键（例如，沃森-克里克碱基配对）的邻接残基的百分比（例如，在与具有10个核苷酸的第二核酸序列配对的第一寡核苷酸中的总共10个核苷酸中的5、6、7、8、9或10个核苷酸分别代表50%、60%、70%、80%、90%和100%互补）。“完全互补”意指核酸序列的所有邻接残基都将与第二核酸序列中相同数目的邻接残基形成氢键。在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含与一个或多个相应的核酸分子或其部分互补的约15至约30个或更多个（例如，14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31个或更多个）核苷酸。[0038]术语“修饰的sirna”和“修饰的短干扰rna”在本文中可互换使用以指包含至少一个5-卤尿嘧啶分子的sirna分子。更具体地，在本公开内容中，修饰的sirna与未改变或未修饰的sirna核酸序列的不同之处在于一个或多个碱基。在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的修饰的sirna包含至少一个被5-卤尿嘧啶置换的尿嘧啶（u）核苷酸碱基。在一些实施方案中，核酸组合物含有已通过在5-位置用提供与卤原子相似作用的基团衍生至少一个尿嘧啶核碱基而被修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供类似效果的基团在重量或空间维度上具有与卤原子类似的大小，例如，最多到或小于20、30、40、50、60、70、80、90或80g/摩尔的分子量。在某些实施方案中，提供与卤原子类似的作用的基团可以是，例如，甲基、三卤甲基（例如，三氟甲基）基团、拟卤化物（例如，三氟甲磺酸盐、氰基或氰酸盐）或氘（d）原子。提供与卤原子相似作用的基团可以在sirna核苷酸序列中不存在5-卤尿嘧啶碱基的情况下或除了5-卤尿嘧啶碱基以外存在。[0039]在具体实施方案中，本公开内容的修饰的sirna包含至少一个被5-氟尿嘧啶置换的尿嘧啶（u）核苷酸碱基。[0040]本公开内容还预期具有至少一个被除5-氟尿嘧啶以外的5-卤尿嘧啶置换的尿嘧啶碱基的修饰的sirna组合物。因此，在本公开内容的一些修饰的sirna组合物中，一个或多个尿嘧啶碱基被例如5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氟尿嘧啶或其组合置换。在某些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是相同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是不同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止两个5-卤尿嘧啶，由此修饰的sirna核苷酸序列包含不同的5-卤尿嘧啶的组合。[0041]在某些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是相同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止一个5-卤尿嘧啶，由此每个5-卤尿嘧啶都是不同的。在其他实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列包含不止两个5-卤尿嘧啶，由此修饰的sirna核苷酸序列包含不同的5-卤尿嘧啶的组合。[0042]在本公开内容的示例性实施方案中，提供了含有seqidno：1所示的sirna核苷酸序列的核酸组合物，所述sirna核苷酸序列已通过用5-卤尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶置换至少一个尿嘧啶核苷酸碱基而被修饰。在某些实施方案中，修饰的sirna具有不止一个或恰好一个已被5-氟尿嘧啶置换的尿嘧啶。在一些实施方案中，修饰的sirna核苷酸序列用5-fu分子置换了两个、三个、四个、五个或更多个尿嘧啶碱基。在具体实施方案中，抗bcl-2短干扰rna的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。[0043]在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换。在另一个实施方案中，双链抗bcl2短干扰rna的第一链中的所有尿嘧啶碱基均已被5-fu分子置换。在某些实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第一链中被置换，并且一个或多个尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被置换。在其他实施方案中，修饰的sirna组合物中的一个或多个尿嘧啶碱基已经在双链sirna分子的第一链中被置换并且没有尿嘧啶碱基已在双链sirna分子的第二链中被5-fu分子置换。在具体的实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换并且一个或多个尿嘧啶碱基已经在双链sirna分子的第二链中被置换。在一个实施方案中，修饰的sirna组合物中的所有尿嘧啶碱基都已经在双链sirna分子的第一链中被5-fu分子置换，并且没有尿嘧啶碱基已经在双链sirna分子的第二链中被置换。在一些实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链。在其他实施方案中，第一链是双链sirna分子的有义链，且第二链是反义链。[0044]在具体实施方案中，核酸组合物包含双链sirna核苷酸序列，所述序列已通过用5-fu分子置换至少一个尿嘧啶碱基而被修饰。更具体地，核酸组合物是双链rna分子，其含有结合bcl-2核苷酸序列的一部分的至少以下从5'到3'的核苷酸序列：ggaugccuuuguggaacuguauu[seqidno.1]和互补链，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0045]在一种情况下，本公开内容的修饰的sirna恰好包含一个已被5-fu分子置换的sirna核苷酸序列的尿嘧啶碱基。在其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少两个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在又其他情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少三个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少四个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一种情况下，sirna核苷酸序列中的恰好或至少五个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在其他实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少六个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在另一个实施方案中，sirna核苷酸序列中的恰好或至少七个尿嘧啶碱基各自被5-fu分子置换。在具体实施方案中，sirna核苷酸序列的所有尿嘧啶碱基均各自被5-fu分子置换。可以对双链sirna组合物的第一链（例如，有义链）或互补的第二链（例如，反义链）进行对本公开内容的任何sirna组合物的修饰。在优选的实施方案中，对第一（有义）链和第二（反义）链两者进行对sirna分子的修饰。[0046]在示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从5'到3'的修饰的sirna核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0047]在另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。[0048]在又另一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0049]本文所述的修饰的sirna核酸组合物可以使用任何众所周知的用于合成核酸的方法来合成。在特定实施方案中，核酸组合物通过自动寡核苷酸合成产生，例如使用亚磷酰胺化学的任何众所周知的方法。为了将一个或多个5-卤尿嘧啶分子如5-fu引入修饰的sirna核苷酸序列中，可以包括5-卤尿嘧啶核苷亚磷酰胺作为前体碱基，以及将被包括在核酸序列中的含有天然碱基（例如，a、u、g和c）的核苷的亚磷酰胺衍生物。[0050]在一些实施方案中，本公开内容的核酸组合物可以生物合成地产生，例如通过使用来自质粒、pcr片段或合成dna模板的体外rna转录，或通过使用重组（体内）rna表达方法，如例如，如在2'-acerna合成”中，如例如在s.a.scaringe等人,j.am.chem.soc.,(1998)120第11820-11821页中所述的，其整体内容特此引入作为参考。也参见c.m.dunham等人,naturemethods,(2007)4(7),第547-548页。[0051]本公开内容的修饰的sirna序列可以进一步通过本领域众所周知的技术化学修饰，例如通过用聚乙二醇（peg）或烃或靶向剂，特别是癌细胞靶向剂，例如叶酸，进行官能化。为了包括这样的基团，可以首先在寡核苷酸序列中包括可用于附加期望的官能团的反应基（例如，氨基、醛、硫醇或羧酸酯基团）。尽管可以将这种反应基或官能团并入已产生的核酸序列上，但是通过使用自动寡核苷酸合成可以更容易地包括反应基或官能团，其中包括含有反应基或反应前体基团的非核苷亚磷酰胺。[0052]在某些实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物是通过下述产生的双链体分子：合成sirna分子的第一（寡核苷酸序列）链，其中所述第一链的核苷酸序列包含可用作用于合成第二条链的支架的可切割接头分子；在第一链的支架上合成sirna第二链的核苷酸序列，其中第二链序列进一步包含可用于纯化sirna双链体的化学部分；在适合两条sirna链杂交且形成稳定双链体的条件下切割接头分子；和利用第二寡核苷酸序列链的化学部分纯化sirna双链体。[0053]在一些实施方案中，上述接头分子的切割发生在寡核苷酸的脱保护期间，例如，在使用烷基胺碱例如甲胺的水解条件下。在一个实施方案中，合成方法包括在固相支持体如受控孔玻璃（cpg）或聚苯乙烯上的固相合成，其中第一链使用固相支持体作为支架在可切割的接头如琥珀酰接头上合成。可切割接头可用作用于合成第二链的支架，可包含与固体支持体衍生的接头相似的反应性，从而使得固体支持体衍生的接头和可切割接头的切割伴随发生。在另一个实施方案中，可用于分离附着的寡核苷酸序列的化学部分包含三苯甲基基团，例如二甲氧基三苯甲基基团，其可用于如本文所述的三苯甲基开（trityl-on）合成策略中。在又另一个实施方案中，化学部分，例如二甲氧基三苯甲基基团，在纯化过程中被去除，例如，使用酸性条件。[0054]在另一种情况下，用于sirna合成的方法是溶液相合成或杂合相合成，其中sirna双链体的两条链使用充当用于合成第二序列的支架的附着至第一序列的可切割接头串联合成。在适合分离的sirna链杂交的条件下切割接头导致双链sirna分子的形成。[0055]在某些情况下，本公开内容的修饰的sirna组合物调节bcl-2蛋白表达。[0056]术语“调节”意指基因的表达，或编码基因的一种或多种蛋白或蛋白亚基的rna分子或等效rna分子的水平，或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性被上调或下调，从而使得表达、水平或活性大于或小于在没有调节剂的情况下所观察到的。例如，术语“调节”可以意指“抑制”，但词语“调节”的使用不限于所述定义。[0057]所谓“抑制”、“下调”或“降低”指的是基因的表达，或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的mrna分子或等效rna分子的水平，或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性被降低到低于在不没有本发明的核酸分子（例如，sirna）的情况下所观察到的。在一个实施方案中，用修饰的sirna分子的抑制、下调或降低低于在有无活性或对照分子的情况下或在没有sirna分子的情况下观察到的水平。在另一个实施方案中，用sirna分子的抑制、下调或降低低于在有例如具有混乱序列或具有错配的sirna分子的情况下观察到的水平。在另一个实施方案中，用本发明的修饰的sirna组合物对表达的抑制、下调或降低在有所述修饰的sirna分子的情况下大于在其不存在或存在未修饰的sirna分子的情况下。在一个实施方案中，表达的抑制、下调或降低与转录后沉默有关，例如rnai介导的靶核酸分子（例如，rna或mrna）的切割或基因产物翻译的抑制。在一个实施方案中，抑制、下调或降低表达与细胞中bcl-2mrna的翻译前沉默有关。[0058]术语“b-细胞淋巴瘤2”或“bcl-2”或“bcl2”意指分别在refseqng_009361.1、nm_000633、np_000624中所述的基因、rna转录物和蛋白，包括其部分和其同种型α（nm_000633.2、np_000624.2）和βnm_000657.2、np_000648.2，其由bcl-2基因编码，所述基因是经由内在的凋亡途径调节线粒体调节的细胞死亡的调节蛋白的bcl-2家族的成员。bcl-2是众所周知的整合外线粒体膜蛋白，其通过结合bad和bak蛋白来阻断细胞的凋亡死亡。例如，有许多已知的bcl-2抑制剂，例如bcl2抑制剂的非限制性例子包括维奈托克（c45h50cln7o7s，genentech,inc.），反义寡核苷酸，例如奥利默森（oblimersen）（genasense;gentainc.），bh3模拟小分子抑制剂，包括abt-737（abbottlaboratories,inc.），abt-199（abbottlaboratories,inc.）和奥巴克拉（obatoclax）（cephaloninc.）。[0059]修饰的短干扰核糖体核酸制剂本公开内容揭示了本发明的修饰的sirna组合物显示出作为抗癌治疗的有效功效。因此，本公开内容还涉及包含本文所述的修饰的sirna组合物的制剂或包含其组合即至少两种不同的修饰的sirnas的制剂。在某些实施方案中，制剂可以包括药物制剂，其包含上述核酸组合物和其他已知的药理学试剂，例如一种或多种药学上可接受的载体。[0060]在一些实施方案中，制剂由结合bcl-2核苷酸序列的本公开内容的sirna组合物组成。在具体实施方案中，制剂包含短干扰rna组合物，所述组合物具有结合bcl-2mrna的修饰的核苷酸序列。[0061]在某些情况下，制剂包含短干扰rna组合物，所述短干扰rna组合物具有从5'到3'的修饰的核苷酸序列：ggaufgccufufufgufggaacufgufaufuf，其中uf是5-fu分子，和如seqidno.2所示的互补的反义链（从3'到5'），其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。在另一个实施方案中，制剂包含短干扰rna组合物，所述短干扰rna组合物具有结合bcl-2mrna的修饰的核苷酸序列且具有从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：uuccuacggaaacaccuugacau，和如seqidno:3所示的互补的有义链，其中每个尿嘧啶碱基都被5-fu分子置换。在又另一个实施方案中，制剂包含短干扰rna组合物，所述短干扰rna组合物具有结合bcl-2mrna的修饰的核苷酸序列且具有结合bcl-2mrna的从3'到5'的修饰的sirna核苷酸序列：ufufccufacggaaacaccufufgacauf，和如seqidno:4所示的互补的有义链，其中没有尿嘧啶碱基被5-fu分子置换。[0062]术语“药学上可接受的载体”在本文中如与药学上可接受的稀释剂、媒介物或赋形剂同义的那样使用。取决于其中的制剂或sirna组合物的类型和预期的施用方式，sirna组合物可以溶解或悬浮（例如，作为乳剂）在药学上可接受的载体中。药学上可接受的载体可以是液体或固体化合物、材料、组合物和/或剂型的任何一种，它们在合理的医学判断范围内适合与主体的组织接触使用。载体在不对被提供给的主体有害并且与制剂的其他成分相容即不改变它们的生物或化学功能的意义上应该是“可接受的”。[0063]可用作药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；明胶；滑石；蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二元醇类，例如乙二醇和丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂；水；等渗盐水；ph缓冲溶液；和其他用于药物制剂中的无毒相容物质。药学上可接受的载体还可以包括制造助剂（例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸）、溶剂或胶囊化材料。如果期望，可以添加某些增甜剂和/或调味剂和/或着色剂。其他合适的赋形剂可以在标准药学教科书中找到，例如在“remington'spharmaceuticalsciences”,thescienceandpracticeofpharmacy,第19版.mackpublishingcompany,easton,pa.,(1995)中。[0064]在一些实施方案中，药学上可接受的载体可以包括稀释剂，其增加固体药物组合物的体积并使药物剂型更易于患者和护理人员处理。用于固体组合物的稀释剂包括，例如，微晶纤维素（例如，avicel®）、超细纤维素、乳糖、淀粉、预凝胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡萄糖结合剂（dextrates）、糊精、葡萄糖、磷酸氢钙二水合物、正磷酸钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、甘露糖醇、聚甲基丙烯酸酯（例如，eudragit®）、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨糖醇和滑石。[0065]在某些实施方案中，本公开内容的制剂包括纳米颗粒。适合用于本发明制剂的纳米颗粒是本领域普通技术人员已知的。例如，本公开内容的制剂可以包含有效量的至少一种修饰的sirna组合物和金纳米颗粒、铁芯磁性可富集纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒或它们的组合。[0066]在一个实施方案中，本公开内容的制剂可以包含有效量的至少一种修饰的sirna组合物和转染剂，例如聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺盐酸化物、脱酰基聚乙烯亚胺和oligofectamine。然而，用于本发明制剂的其他转染剂是本领域普通技术人员已知的。[0067]在一些情况下，本公开内容的短干扰核酸组合物可以根据本领域已知的方法配制成组合物和剂型。在某些实施方案中，配制的组合物可以具体配制用于以固体或液体形式施用，包括适合于以下的那些：（1）口服施用，例如，片剂、胶囊、粉末、颗粒、用于应用于舌的糊剂、水或非水溶液或悬浮液、浸液或糖浆；（2）肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液通过皮下、肌内或静脉内注射；（3）局部应用，例如，作为应用于皮肤、肺或黏膜的乳膏、软膏或喷雾剂；或（4）阴道内或直肠内，例如，作为阴道栓、乳膏或泡沫；（5）舌下或口腔含化；（6）眼；（7）经皮；或（8）鼻。[0068]在一些实施方案中，本公开内容的制剂包括压制成剂型例如片剂的固体药剂，可以包括赋形剂，其功能包括在压缩后帮助将活性成分和其他赋形剂结合在一起。用于固体药物组合物的粘合剂包括阿拉伯胶、藻酸、卡波姆（例如卡波泊尔）、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜耳胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素（例如klucel®）、羟丙基甲基纤维素（例如methocel®）、液体葡萄糖、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯酮（例如kollidon®、plasdone®）、预凝胶化淀粉、藻酸钠和淀粉。[0069]通过向组合物添加崩解剂可以增加压制的固体药物组合物在主体胃中的溶解速率。崩解剂包括藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠（例如ac-di-sol®、primellose®）、胶体二氧化硅、交联甲羧纤维素钠、交联聚乙烯吡咯酮（crospovidone）（例如kollidon®、polyplasdone®）、瓜耳胶、硅酸铝镁、甲基纤维素、微晶纤维素、聚克立林（polacrilin）钾、粉状纤维素、预凝胶化淀粉、藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠（例如explotab®）和淀粉。[0070]因此，在某些实施方案中，可将助流剂添加到制剂中以提高非压制的固体试剂的流动性和提高给药准确度。可起助流剂作用的赋形剂包括胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石和正磷酸钙。[0071]当通过压制粉末组合物制备剂型例如片剂时，所述组合物经受来自冲压机和染料的压力。一些赋形剂和活性成分有黏附在冲压机和染料表面的趋势，这可导致产品具有纹孔式和其他表面不规则性。可以将润滑剂添加到组合物中以降低黏附并使得容易从染料中释放产品。润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、甘油单硬脂酸酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯（glycerylpalmitostearate）、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酰延胡索酸钠、硬脂酸、滑石和硬脂酸锌。[0072]可通过湿法制粒（wetgranulation）制备用于压片或胶囊填充的配制的药物组合物。在湿法制粒中，将一些或所有粉末形式的活性成分和赋形剂掺合，且然后在有导致粉末聚集成颗粒的液体（一般是水）的情况下进一步混合。将颗粒筛分和/或研磨，干燥，且然后筛分和/或研磨至期望的颗粒大小。然后可以将颗粒压片，或者可以在压片之前添加其他赋形剂，例如助流剂和/或润滑剂。压片组合物可以常规地通过干掺合来制备。例如，活性物和赋形剂的掺合的组合物可以压制成条或片，且然后粉碎成压实的颗粒。接着可将压实的颗粒压缩成片剂。[0073]在其他实施方案中，作为干法制粒（drygranulation）的备择方案，可以使用直接压缩技术将掺合的组合物直接压缩成压制的剂型。直接压缩产生更均匀的无颗粒片剂。特别地十分适合直接压缩压片的赋形剂包括微晶纤维素、喷雾干燥的乳糖、磷酸二钙二水合物和胶体二氧化硅。这些和其他赋形剂在直接压缩压片中的正确使用对于在直接压缩压片的特定制剂挑战方面具有经验和技能的本领域技术人员来说是已知的。胶囊填充可以包括参考压片所描述的任何上述掺合物和颗粒；然而，它们没有经受最后的压片步骤。[0074]在本公开内容的液体药物组合物（即，制剂）中，试剂（修饰的sirna组合物）和任何其他固体赋形剂溶解或悬浮在液体载体中，例如水、注射用水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油。液体药物组合物可含有乳化剂以在整个组合物中均匀分散不溶于液体载体的活性成分或其他赋形剂。液体制剂可以用作可注射、肠或润滑药类型的制剂。可用于本发明液体组合物中的乳化剂包括，例如，明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯胶、西黄蓍胶、角叉菜、果胶、甲基纤维素、卡波姆、十六醇十八醇混合物和鲸蜡醇。[0075]在一些实施方案中，本公开内容的液体药物组合物还可以含有黏度增强剂以改善产品的口感和/或覆盖胃肠道的衬里。这种试剂包括阿拉伯胶、藻酸皂土、卡波姆、羧甲基纤维素钙或钠、十六醇十八醇混合物、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶瓜耳胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糖糊精、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、碳酸丙二酯（propylenecarbonate）、藻酸丙二酯、藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠、淀粉西黄蓍胶和黄原胶。[0076]在其他实施方案中，本公开内容的液体组合物还可以含有缓冲液，例如葡糖酸、乳酸、柠檬酸或乙酸、葡糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或乙酸钠。[0077]防腐剂和螯合剂，如醇、苯甲酸钠、丁化羟基甲苯、丁化羟基苯甲醚和乙二胺四乙酸，可以以对于摄食安全的水平添加以提高贮藏稳定性。也可以使用任何药学上可接受的着色剂对固体和液体组合物进行染色，以改善它们的外观和/或便于患者识别产品和单位剂量水平。[0078]本公开内容的剂量制剂可以是在硬壳或软壳内含有组合物，例如，本公开内容的粉末状或颗粒状固体组合物的胶囊。壳可由明胶制成并且任选地含有增塑剂例如甘油和山梨糖醇，以及不透明剂或着色剂。[0079]在某些情况下，本公开内容的制剂将在没有用于靶向癌细胞的靶向剂、载体或其他媒介物的情况下包含有效量的至少一种修饰的sirna组合物。在一个实施方案中，这种制剂将是液体，并且适合于注射。在一些情况下，将配制用于向主体静脉内注射的液体组合物。在其他情况下，将配制用于直接注射到肿瘤或其细胞中的液体组合物。[0080]用于治疗癌症的方法如上所述的，本公开内容的修饰的短干扰核糖体核酸组合物及其制剂当与相应的未修饰的sirna的外源表达和/或其他已知癌症疗法所表现出的活性相比时显示出出乎意料的和优越的抗癌活性。参见图3a-3c。因此，本公开内容的另一方面提供了一种用于通过向哺乳动物施用有效量的一种或多种本公开内容的修饰的sirna组合物或其制剂来治疗哺乳动物中癌症的方法。[0081]如图2a至2c所示的，本公开内容的示例性修饰的sirna组合物（即，seqidno：2）在有或没有递送媒介物的情况下结合bcl-2mrna并抑制癌细胞中的bcl-2蛋白表达。[0082]此外，且如图3a-3b所示的，本文所述的示例性修饰的sirna通过诱导凋亡以及细胞生存力来减少结肠直肠癌和淋巴瘤。更具体地，如seqidno:2所示的所有u碱基都被5-fu分子置换的修饰的sirnas降低结肠直肠癌细胞生存力（图3a）和淋巴瘤细胞生存力（图3b）。此外，测试了本发明修饰的sirna组合物，且发现当与已知的淋巴瘤癌症治疗组合物（例如，维奈托克）比较时，其在淋巴瘤细胞中的治疗功效中提供了出乎意料的增加。参见，例如，图3c和3d。因此，所公开的用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的主体施用一种或多种本公开内容的修饰的短干扰核糖体核酸组合物。[0083]在某些实施方案中，修饰的短干扰核糖体核酸组合物可以作为包含如上所述的修饰的核酸组合物的制剂施用。在具体实施方案中，本公开内容的核酸组合物可以在没有递送媒介物或药物载体的情况下（即，裸露的）施用。参见，例如，图2a和2c。[0084]如本文所用的术语“主体”指任何哺乳动物。哺乳动物可以是任何哺乳动物，尽管本文的方法更一般地涉及人。如本文所用的短语“有需要的主体”包括在术语主体内并且指任何需要治疗的哺乳动物主体，特别是癌症或具有医学上确定的癌性或癌前状况的升高的风险。在具体实施方案中，主体包括人癌症患者。[0085]术语“治疗（treatment）”、“治疗（treat）”和“治疗（treating）”与术语“施用有效量”同义。这些术语应意指意图治愈、改善、稳定、减轻疾病、病理状况或病症例如癌症的一种或多种症状或预防疾病、病理状况或病症例如癌症的主体的医学管理。这些术语可互换使用，且包括积极疗法，即，具体目的在于疾病、病理状况或病症的改善的治疗，且还包括病因疗法，即，目的在于去除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，治疗包括姑息疗法，即，设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防疗法，即，目的在于最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；和支持疗法，即，用于补充另一种目的在于改善相关疾病、病理状况或病症的具体疗法的治疗。可理解的是，治疗虽然意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症，但不需要实际上导致治愈、改善、稳定或预防。治疗的效果可以如本文所述的和如本领域已知适合于所涉及的疾病、病理状况或病症的那样测量或评估。这种测量和评估可以在定性和/或定量意义上进行。因此，例如，可以将疾病、病理状况或病症的特征或特点和/或疾病、病理状况或病症的症状降低到任何效果或降低到任何量。在具体的实施方案中，疾病例如癌症的治疗包括抑制癌细胞的增殖。在一些实施方案中，癌症的治疗可以通过检测主体中增殖癌细胞量的减少、肿瘤生长或肿瘤大小的减少来确定。[0086]在某些实施方案中，本公开内容的修饰的短干扰核糖体核酸组合物用于治疗癌症。[0087]如本文所用的，术语“癌症”包括由异常细胞不受控制的分裂和生长引起的任何疾病，包括例如肿瘤的恶性和转移性生长。术语“癌症”还包括癌前状况或特征在于升高的癌性或癌前状况风险的状况。癌症或初癌（致瘤性状况）可以位于身体的任何部分，包括内部器官和皮肤。如众所周知的，癌症通过经由淋巴结和血管侵入肿瘤周围的正常、非癌性组织，以及在肿瘤侵入主体的静脉、毛细血管和动脉后通过血液贯穿主体扩散。当癌细胞离开原发肿瘤（“转移”）时，继发肿瘤遍及受折磨的主体发生，从而形成转移性病变。[0088]使用本发明方法治疗的适用癌细胞的一些非限制性实例包括肺、结肠、直肠、血液、淋巴系统或免疫系统。癌症或肿瘤还可以包括一种或多种癌、肉瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤或畸胎瘤（生殖细胞肿瘤）的存在。[0089]在具体实例中，已显示修饰的sirna组合物通过遍及以下实验模型结肠直肠癌细胞（图3a）和淋巴瘤细胞（图3b-3d）增加凋亡来减少癌细胞增殖。[0090]在一些实施方案中，施用包括本公开内容的修饰的sirna的治疗的主体患有结肠直肠癌，或具有医学上确定的升高的患结肠直肠癌的风险。[0091]在某些实施方案中，本公开内容的主体患有肺癌，或具有医学上确定的升高的患肺癌的风险。[0092]在其他实施方案中，主体患有淋巴瘤，或具有医学上确定的升高的患淋巴瘤的风险。[0093]根据本公开内容，治疗癌症的方法包括通过本领域通常已知的任何途径施用本发明的一种或多种短干扰核糖体核酸组合物。这包括，例如，（1）口服施用；（2）肠胃外施用，例如，通过皮下、肌内或静脉内注射；（3）局部施用；或（4）阴道内或直肠内施用；（5）舌下或口腔含化施用；（6）眼施用；（7）经皮施用；（8）鼻施用；和（9）直接施用于有需要的器官或细胞。[0094]在具体实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物通过注射施用于主体。在一个实施方案中，静脉内注射治疗有效量的修饰的sirna组合物。在另一个实施方案中，将治疗有效量的修饰的sirna组合物腹膜内或皮下注射到肿瘤或其细胞。[0095]施用的本公开内容的核酸组合物的量（剂量）取决于若干因素，包括癌症的类型和病期、附属或辅助药物的存在或不存在以及主体的重量、年龄、健康和对试剂的耐受性。取决于这些各种因素，剂量可以是，例如，约2mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约15mg/kg体重、约20mg/kg体重、约25mg/kg体重、约30mg/kg体重、约40mg/kg体重、约50mg/kg体重、约60mg/kg体重、约70mg/kg体重、约80mg/kg体重、约90mg/kg体重、约100mg/kg体重、约125mg/kg体重、约150mg/kg体重、约175mg/kg体重、约200mg/kg体重、约250mg/kg体重、约300mg/kg体重、约350mg/kg体重、约400mg/kg体重、约500mg/kg体重、约600mg/kg体重、约700mg/kg体重、约800mg/kg体重、约900mg/kg体重或约1000mg/kg体重，其中术语“约”通常理解为在指示值的±10%、5%、2%或1%内。剂量也可以在由上述值中的任何两个定界的范围内。常规实验可用于通过监控组合物或其制剂对癌性或癌前状况的作用或修饰的sirna的表达对bcl-2蛋白或核酸序列表达的作用或疾病病理学来确定每个个体主体的适当剂量方案，所有这些都可以根据本领域中已知的方法频繁且容易地监控。取决于上面讨论的各种因素，任何上述示例性剂量的核酸都可以每天、每周或每月一次、两次或多次施用。[0096]本文所述的核酸组合物以及任选地任何额外的化疗剂供当前方法使用的的能力可以使用本领域众所周知的药理学模型来确定，例如细胞毒性测定、凋亡染色测定、异种移植测定和结合测定。[0097]本文所述的本发明的短干扰核酸组合物可以或可以不也与一种或多种化疗剂共同施用，所述化疗剂可以是不同于本文所述的核酸组合物的附属或辅助药物。[0098]如本文所用的，“化学疗法”或短语“化疗剂”是用于治疗癌症的试剂。与本文所述的方法一起使用的化疗剂包括，例如，直接或间接调节bmi1的任何试剂。化疗剂的实例包括：抗代谢物，例如甲氨蝶呤和基于氟嘧啶的嘧啶拮抗剂，5-氟尿嘧啶（5-fu）（carac®乳膏、efudex®、fluoroplex®、adrucil®）和s-1；抗叶酸剂（antifolates），包括聚谷氨酸抗叶酸化合物（polyglutamatableantifolatecompounds）；雷替曲塞（tomudex®），gw1843和培美曲塞（pemetrexed）（alimta®）和非聚谷氨酸抗叶酸化合物；诺拉曲塞（nolatrexed）（thymitaq®），普来曲塞（plevitrexed），bgc945；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特；和嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶、依诺他宾、氟尿苷。在本公开内容的具体实施方案中，化疗剂是能够抑制和异常细胞增殖或凋亡中牵连的信号传导途径有关的基因或基因产物（如例如bcl2、胸苷酸合酶或e2f3）的表达或活性的化合物；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。[0099]e2f转录因子3，e2f3（refseqng_029591.1，nm_001243076.2，np_001230005.1）是一种转录因子，其与dna结合并与效应蛋白包括但不限于成视网膜细胞瘤蛋白相互作用，以调节与细胞周期调节有关的基因的表达。因此，任何抑制e2f3表达的药物在本文中都可以被认为是共同药物（co-drug）。[0100]胸苷酸合酶（refseq:ng_028255.1，nm_001071.2，np_001062.1）是一种普遍存在的酶，其催化dump的必需甲基化以产生构成dna的四种碱基之一dtmp。反应需要chh4-叶酸作为辅因子，既作为甲基供体，又独特地作为还原剂。对chh4-叶酸的恒定需要意指胸苷酸合酶活性与负责补充细胞叶酸库的两种酶：二氢叶酸还原酶和丝氨酸转羟甲基酶的活性有强烈联系。胸苷酸合酶是30-35kda亚基的同二聚体。活性位点同时结合叶酸辅因子和dump底物两者，其中dump经由亲核半胱氨酸残基与酶共价结合（参见，carreras等人,annu.rev.biochem.,(1995)64:721-762）。胸苷酸合酶反应是产生用于并入dna的dctp和dttp的嘧啶生物合成途径的关键部分。所述反应是dna复制和细胞生长所需要的。因此，所有快速分裂的细胞例如癌细胞都需要胸苷酸合酶活性。由于其与dna合成以及因此与细胞复制的联系，胸苷酸合酶多年来一直是抗癌药物的靶。胸苷酸合酶抑制剂的非限制性实例包括叶酸和dump类似物，例如5-氟尿嘧啶（5-fu）。任何抑制胸苷酸合酶表达的药物在本文中都可以被认为是共同药物。[0101]b细胞淋巴瘤2（bcl-2），（refseqng_009361.1、nm_000633、np_000624）包括其同种型α（nm_000633.2、np_000624.2）和β（nm_000657.2、np_000648.2），由bcl-2基因编码，其是经由内在的凋亡途径调节线粒体调节的细胞死亡的调节蛋白的bcl2家族的成员。bcl2是整合外线粒体膜蛋白，其通过结合bad和bak蛋白来阻断细胞的凋亡死亡。[0102]在具体的实施方案中，本公开内容的修饰的sirna组合物与已知的bcl-2抑制剂一起施用，如例如，维奈托克（c45h50cln7o7s，genentech,inc.），反义寡核苷酸，例如奥利默森（genasense;gentainc.），bh3模拟小分子抑制剂，包括abt-737（abbottlaboratories,inc.），abt-199（abbottlaboratories,inc.）和奥巴克拉（cephaloninc.）。在一个实施方案中，将本公开内容的修饰的sirna组合物与维奈托克（ventoclax）一起施用于主体。在具体实施方案中，将本公开内容的修饰的sirna组合物与维奈托克一起施用于患有淋巴瘤的主体。[0103]化疗剂可以在开始用核酸组合物的疗法之前、期间或之后施用。[0104]在具体实施方案中，其他核酸是短发夹rna（shrna）、mirna、修饰的mirna或与bcl-2核酸序列的一部分结合或互补的其他形式的核酸。[0105]如果期望，本文所述的短干扰核酸组合物的施用可以与一种或多种非药物疗法组合，如例如放射治疗和/或外科手术。如本领域所众所周知的，可以在外科手术前给予放射治疗和/或化疗剂（在所述情况下，本文描述的核酸组合物，和任选地，任何额外的化疗剂）的施用，以例如在外科手术前缩小肿瘤或停止癌症扩散。如本领域也众所周知的，可以在外科手术后给予放射治疗和/或化疗剂的施用以破坏任何剩余的癌症。[0106]为了举例说明起见和描述本发明的某些特定实施方案，下面已陈述了实施例。然而，本发明的范围不以任何方式受限于本文所陈述的实施例。[0107]实施例实施例1：材料和方法。[0108]修饰的短干扰rnas。所有sirnas均通过自动寡核苷酸合成方法作为单链合成，并通过hplc纯化。将两条链（有义和反义）退火以制备与bcl-2mrna结合的双链修饰的sirnas。对于含有5氟尿嘧啶的与bcl-2mrna结合的修饰的sirna，使用了称为“2'-acerna合成”的方法。2'-acerna合成基于保护基方案，其中与2'-羟基上的酸不稳定原酸酯保护基（2'-ace）组合使用甲硅烷醚以保护5'-羟基。然后将所述保护基的组合与标准亚磷酰胺固相合成技术一起使用。参见，例如，s.a.scaringe,f.e.wincott和m.h.caruthers,j.am.chem.soc.,120(45),11820-11821(1998)；国际pct申请wo/1996/041809；m.d.matteucci,m.h.caruthers,j.am.chem.soc.,103,3185-3191(1981)；s.l.beaucage,m.h.caruthers,tetrahedronlett.22,1859-1862(1981)，其每一篇的全fischer）和抗-gapdh抗体（1:100000）（santacruz）探测蛋白。添加辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或兔第二抗体（1:5000，santacruzbiotechinc.）。然后使用supersignalwestpico化学发光底物（chemiluminescentsubstrate）（thermofischer）用放射自显影胶片显示蛋白条带。[0111]凋亡和细胞生存力测定。为了测量由示例性修饰的bcl2结合sirna组合物诱导的凋亡以及用示例性修饰的sirna或维奈托克处理后的细胞生存力，使用异硫氰酸荧光素（fitc）-膜联蛋白测定（bectondickinson）。转染前24小时，将细胞（1×105）个细胞/孔平板接种到6孔平板中。用各种浓度的示例性修饰的sirnas转染细胞或用各种浓度的维奈托克处理细胞。转染后48小时，收获细胞，按照制造商的规程用碘化丙啶和抗膜联蛋白-v抗体（膜联蛋白v-fitc凋亡检测试剂盒，invitrogen,ca,美国）染色，并通过流式细胞术检测染色的细胞。[0112]统计学分析。所有统计学分析均使用graphpadprism8软件进行。使用斯氏t-检验确定两组之间的统计学显著性。对于不止两组的比较，使用单因素方差分析（anova）。数据表示为平均值±标准差（s.d.）。[0113]实施例2：修饰的sirna核酸具有抗癌活性。[0114]在以下实验中，抗-bcl-2sirna分子（seqidno:1）的有义链和反义链中的所有尿嘧啶碱基都被5-fu置换以形成seqidno:2中所示的示例性修饰的sirna。参见图1b。为了测试所述sirna是否保留了抑制bcl-2并在没有转染媒介物的情况下被递送到癌细胞中的能力，在有或没有转染媒介物的情况下，用50nm对照sirna、与bcl2的一部分结合的未修饰的sirna或seqidno：2的修饰的sibcl2转染hct116结肠癌细胞和a549肺癌细胞。参见图2a。qrt-pcr用于评估转染后bcl-2的表达。[0115]图2a中描绘的数据显示，在有转染媒介物的情况下，未修饰的sibcl2和修饰的sibcl2两者都降低了细胞中bcl-2的表达，而在没有转染媒介物的情况下，未修饰的sibcl2对bcl-2mrna的水平没有影响，而修饰的sibcl2降低了bcl2mrna的水平。[0116]还检查了示例性修饰的sirna组合物对bcl-2蛋白水平的影响。如图2b和2c中所示的，当与mrna水平相比时，在蛋白水平上显示出类似的效果。在有转染媒介物的情况下，未修饰的sibcl2和修饰的sibcl2两者均抑制bcl-2蛋白表达。在没有转染媒介物的情况下，只有修饰的sibcl2能够抑制bcl-2表达。还用单独的5-fu处理癌细胞以显示单独的5-fu不导致bcl-2表达的降低。参见图2c和2d。这些数据提示，置换与bcl-2的一部分结合的sirna的尿嘧啶碱基不破坏靶结合，并且还允许sirna在没有转染媒介物的情况下进入细胞，这在单独的5-fu中没有显示。[0117]5-fu-sibcl2触发凋亡并且比维奈托克更有效。为了测量5-fu-sibcl2的治疗效果，并将其与已知的癌症治疗（即，维奈托克）进行比较，将凋亡测定和流式细胞术用于评估用本公开内容的示例性修饰的sirna分子、sibcl2或维奈托克处理后凋亡的诱导以及细胞生存力。[0118]图3a-3b显示结肠癌细胞（hct116，图3a）以及淋巴瘤细胞（toledo，图3b）通过施用seqidno：2中所示的示例性修饰的sirna比未修饰的sibcl2对照sirna更有效地被杀死。[0119]还在淋巴瘤细胞中将seqidno:2中所示的示例性修饰的sirna的治疗功效与fda批准的bcl-2选择性抑制剂维奈托克（abt-199）的治疗功效进行了比较。参见图3c-3d。图3c揭示seqidno：2中所示的示例性修饰sirna在诱导凋亡方面比维奈托克更有效。此外，观察到seqidno：2中所示的示例性修饰的sirna在比维奈托克更低的剂量有效抑制细胞生存力。参见图3d。[0120]总之，本公开内容显示新的sirna组合物可用于在没有递送媒介物的帮助并且不干扰靶结合和相互作用的情况下有效治疗结肠直肠、肺或淋巴瘤。此外，在诱导凋亡和抑制淋巴瘤细胞生存力方面，seqidno：2中所示的示例性修饰的sirna比已知的bcl-2抑制剂（例如，维奈托克）更有效。当前第1页12当前第1页12
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