一种生物相容性好的可视化pH控释载药体系制备方法

(rcqds)。rcqds的发射波长为680nm，具有很强红色荧光发射、优良的生物相容性和稳定性，以制备的rcqds为模板，采用rcqds作为模板，rcqds上的羧基等官能团可以隔离钙离子，使caco3纳米粒表面极性改变，让纳米颗粒进行自组装，得到尺寸小的 caco
3-rcqds纳米载药体系，提高载药体系靶向性、稳定性及负载率。同时，以rcqds为模板的碳酸钙药物载体，可以借助rcqds的荧光影像性好性能，让医生对药物载体一路可视化“示踪”，监控药物的分布与代谢，并可实时动态揭示药物释放与肿瘤治疗效果的相关性，为更高效的药物递送系统设计提供研究基础。本项目的实施有望为可视化ph控释载药天使的研制及应用于抗肿瘤可视化治疗提供新的理论指导和实践依据；同时，有望提高本地特色碳酸钙资源与淮山农产品的附加值，促进本地经济发展。


技术实现要素：

5.本发明以淮山叶提取物为前驱体，采用一步微波法成功制备了rcqds。rcqds的发射波长为680nm，具有优良的生物相容性和稳定性，以制备的rcqds为模板，采用模板法制备了caco
3-rcqds杂化复合纳米材料。得到caco
3-rcqds复合纳米载药体系具有可视化 ph控释、可控释放药物和高效的负载能力，通过考察负载水溶性的抗肿瘤药物盐酸阿霉素 (dox)的量，对caco
3-rcqds复合纳米粒载药体系的性能进行了评价。
6.一种具良好生物相容性的可视化ph控释载药体系制备方法，其特征在于，该纳米载药体系制备方法包括如下步骤：
7.(1)碳量子点rcqds的制备
8.将新鲜淮山叶洗净晾干后，取适量的淮山叶浸入一定量无水乙醇中，连续搅拌2-5h，再在7000rpm转速下离心20min，得到绿色的上层清液，采用旋转蒸发器对上层清液进行浓缩，直至出现浆体样品，将浆体样品置于烧杯中，采用600-800w功率微波炉加热4-6min得到残渣，残渣分散于超纯水中得分散液，分散液通过0.22μm滤膜过滤器进一步过滤得到含小粒径的rcqds的滤液，经旋蒸、干燥后得到固体样品，将固体样品存储于4℃下备用；
9.(2)可视化ph控释载药体系制备
10.采用模板法制备了caco
3-rcqds纳米复合载药体系。首先，200mg rcqds分散在10 mlcacl2溶液(0.4mol/l)中，在持续搅拌下。将10ml 0.2-0.6mol/l的na2co3溶液快速加入 rcqds/cacl2混合物中，并在2000rpm-5000rpm的磁搅拌下进行15-25h，即可形成rcqds
‑ꢀ
caco3杂化复合载药体系。加载上抗肿瘤药物dox，就得到具可视化ph控释的caco3‑ꢀ
rcqds-dox复合载药体系。
11.(3)可视化ph控释碳量子点-碳酸钙纳米载药体系性能的评估
12.37℃下，将caco
3-rcqds-dox在不同ph值(ph＝5.5、6.5和7.4)的磷酸盐缓冲盐水 (pbs)中溶解1-10min。在不同时间点离心收集上清液。采用紫外-可见光谱法测定上清液中dox的释放量(吸收波长：490nm)。
13.优先地，步骤(1)中淮山叶与无水乙醇的比例为3g：6ml。
14.优先地，步骤(1)中所述的一种rcqds制备方法中，搅拌时间为4h。
15.优先地，步骤(1)中所述的微波处理的条件：微波功率为700w，时间为5min。
16.优先地，步骤(2)中所述将200mg rcqds分散在10ml cacl2溶液(0.4mol/l)中。
17.优先地，步骤(2)中所述将10ml 0.4mol/l的na2co3溶液快速加入rcqds/cacl2混合
物中。
18.优先地，步骤(2)中所述在4000rpm的磁搅拌下进行24h，即可形成caco
3-rcqds 杂化复合载药体系。
19.优先地，在步骤(3)中所述将caco
3-rcqds-dox在不同ph值(ph＝5.5、6.5和7.4) 的pbs中溶解5min。
20.本发明一种具良好生物相容性的可视化ph控释载药体系制备方法具有如下优点：
21.(1)具有绿色环保、生物相容性好、毒性低、生物降解性好、比表面积大、易于大规模生产、成本低、原料来源广泛及合成简单等优点；
22.(2)制备得到caco
3-rcqds-dox复合载药体系具有ph敏感、可控释放药物和高效的负载能力；
23.(3)caco
3-rcqds-dox复合载药体系能满足肿瘤治疗中靶向药物递送和可控释放的需求，可广泛应用于高效抗肿瘤治疗等医学领域中。
附图说明
24.图1为rcqds的tem图像及粒径分布图；
25.图2为rcqds紫外-可见光谱及rcqds荧光发射光谱图；
26.图3为不同时间(a)及不同浓度的nacl(b)对caco
3-rcqds荧光强度的影响；
27.图4为caco
3-rcqds-dox在不同ph值pbs缓冲液中的tem图像；
28.图5为不同ph值pbs下caco
3-rcqds-dox中dox释放随时间的变化；
29.图6为孵育不同浓度caco
3-rcqds24h后对hepg2细胞的毒性。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，对本发明不构成任何限制。
31.一、实施例所用到的试剂
32.淮山叶采集于贺州学院东校区。dox、氯化钙、碳酸钠、二甲亚砜、胎牛血清(fbs)、高糖培养基(dmem)、胰酶、100u/青霉素-链霉菌霉素购自美国sigma公司。人肝癌细胞 (hepg2细胞)购自鼎国生物科技股份有限公司(北京)。cell countingkit-8(cck-8)购自aladdin corporation(shanghai,china)。透析袋(mwco:1000da，孔径约1.0nm)购自上海生物工程有限公司。实验中使用的磷酸盐缓冲溶液(pbs)等化学试剂均为分析纯，均为中国采购。实验用水由水净化系统(millipore,bedford,ma)制备。
33.二、实施例所用到的仪器
34.实施例所用到的仪器如表1。
35.表1实验仪器
[0036][0037]
三、实施例样品制备及评估
[0038]
(1)rcqds的制备：将新鲜淮山叶洗净晾干后，取适量的淮山叶浸入一定量无水乙醇中，连续搅拌4h，再在7000rpm转速下离心20min，得到绿色的上层清液，采用旋转蒸发器对上层清液进行浓缩，直至出现浆体样品，将浆体样品置于烧杯中，采用700w功率微波炉加热5min得到残渣，残渣分散于超纯水中得分散液，分散液通过0.22μm滤膜过滤器进一步过滤得到含小粒径的rcqds的滤液；
[0039]
(2)可视化ph控释caco
3-rcqds载药体系制备
[0040]
采用模板法制备了caco
3-rcqds纳米复合载药体系。首先，200mg rcqds分散在10 mlcacl2溶液(0.4mol/l)中，在持续搅拌下。将10ml 0.4mol/l的na2co3溶液快速加入rcqds/cacl2混合物中，并在4000rpm的磁搅拌下进行24h，即可形成caco
3-rcqds杂化复合载药体系。加载上抗肿瘤药物dox，就得到具可视化ph控释的caco
3-rcqds-dox复合载药体系。
[0041]
(3)可视化ph控释caco
3-rcqds载药体系性能的评估
[0042]
37℃下，将caco
3-rcqds-dox在不同ph值(ph＝5.5、6.5和7.4)的磷酸盐缓冲盐水 (pbs)中溶解5min。在不同时间点离心收集上清液。采用紫外-可见-近红外光谱法测定上清液中dox的释放量(吸收波长：490nm)。
[0043]
(4)细胞毒性和细胞成像：将hepg2细胞接种到96孔细胞培养板中，培养箱温度37℃， co2浓度5％。当hepg2细胞生长密度约为80％时，去除细胞外培养基，分别在每个培养板上加入0、10、30、50、100、300μg/ml的caco
3-rcqds溶液，在相同条件下返回孵育24h。然后用200μl的新鲜培养基清洗细胞并孵育4h。再将混合物孵育4h，取出培养基，每个培养皿中加入100μl二甲亚砜，与细胞反应15min。培养皿用570nm的免疫吸附试验(elisa)评估 caco
3-rcqds的细胞毒性。
[0044]
四、实施例结果与讨论
[0045]
1.rcqds纳米粒子的表征
[0046]
设工作电压为200kv，放大倍数450000倍，将10μl近红外荧光碳量子点溶液滴加到超薄喷碳铜网上，然后将铜网置于真空干燥箱中干燥后即可测定，所得tem图像使用gatan digital micrograph软件分析处理，测试结果如图1所示。由图1a可知，rcqds具有良好的分散性和均一性，制备的rcqds的粒径较小。rcqds直径范围在1.0-5.0nm之间，平均粒径为3.5nm。caco
3-rcqds纳米粒子的表征方法和rcqds纳米粒子的相同。直径范围在 5.0-15.0nm之间，平均粒径为8.5nm(图1b)。
[0047]
取制备的rcqds溶液1ml在200-900nm进行紫外-可见光谱分析，取rcqds溶液100 μl在400-900nm进行荧光发射光谱分析，其光谱图如图2所示，从图可看出，rcqds在室温下的uv-vis光谱在330nm处有一个特征峰(abc)，分别被认为是羰基c＝o的n-π*跃迁。在417nm激发下其荧光最大发射峰为680nm(em)。
[0048]
2.caco
3-rcqds的荧光稳定性
[0049]
为了评价caco
3-rcqds的稳定性，对不同条件下caco
3-rcqds的性能进行了测试分析，取caco
3-rcqds以溶液形式在室温条件下保存6个月的时间，或用紫外光照射2h(图 3a)，其荧光强度和形状都没有变化，说明caco
3-rcqds具有良好的抗光漂白性能。另取 rcqds溶液与不同浓度nacl溶液混合，rcqds的荧光强度也几乎不随nacl浓度的变化而变化(图3b)，以上的结果这说明caco
3-rcqds具有良好的稳定性。
[0050]
3.一种具良好生物相容性的可视化ph控释载药体系制备方法性能的评估
[0051]
众所周知，caco3在酸性介质中可以溶解为ca
2
和co2。因此，我们通过将 caco
3-rcqds-dox载药体系纳米粒子浸泡在不同ph值(5.5、6.5和7.4)的缓冲液中来测试其可视化ph控释性。通过图4的tem成像，观察不同时间点的颗粒形态。可见 caco
3-rcqds-dox载药体系纳米在ph 7.4下表现得相当稳定，没有显示出任何尺寸和结构的显著变化。相反，在ph为6.5的温和酸性缓冲液中，caco
3-rcqds-dox载药体系纳米粒子逐渐分离。更令人惊讶的是，我们观察到caco
3-rcqds-dox载药体系纳米粒子在ph 5.5 下可以快速分解，在tem下5min内没有可见的颗粒结构，2h后大部分失去球形形态，说明caco
3-rcqds-dox载药体系纳米粒子对ph的响应性极高。由于caco3纳米颗粒的分解依赖于ph值，因此实验考察caco
3-rcqds-dox载药体系纳米粒子的可视化ph控释释放抗肿瘤药物dox的行为，37℃下，将caco
3-rcqds-dox在不同ph值(ph＝5.5、6.5和7.4) 的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中溶解5min。在不同时间点离心收集上清液。采用紫外-可见光谱法测定上清液中dox的释放量。
[0052]
根据dox的特征吸收峰(吸收波长：490nm)，实验测量了dox在不同ph值下的释放值(图5)。与caco3纳米粒子的ph依赖分解行为相一致的是，caco
3-rcqds-dox在 ph 5.5下释放dox的速度超快，而在ph升高时释放dox的速度明显变慢。实验结果表明， dox的释放具有明显的可视化ph控释依赖性，这种可视化ph控释酸触发结构转变的特性可以适应在生理ph下长时间稳定的血液循环，以及在ph降低的肿瘤微环境中快速的药物释放。caco
3-rcqds-dox复合纳米载药体系能满足肿瘤治疗中靶向药物递送和控制释放的需求，可广泛应用于高效抗肿瘤治疗等医学领域中。
[0053]
4.caco
3-rcqds的细胞毒性
[0054]
为了研究caco
3-rcqds的生物学应用，我们对hepg2细胞株进行了细胞毒性实验。从图6可以看出，当caco
3-rcqds浓度达到300μg/ml时，细胞存活率仍能达到90％以上，表明caco
3-rcqds具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性。可见，它在广泛应用于高效抗肿瘤治疗等医学领域中有很大的应用潜力。