一种自组装五味子多糖纳米硒的制备方法及应用

1.本发明涉及纳米药物技术领域，尤其涉及一种自组装五味子多糖纳米硒的制备方法及应用。


背景技术：

2.肠道作为机体重要的消化吸收器官，与外界环境直接相连通，时刻进行着各种物质交换和营养代谢。包括细菌感染、病毒感染和毒素等多种多样的外界不利因素均可以导致肠道损伤的发生，引发动物肠炎。如何有效改善和缓解肠道炎性损伤恢复肠道屏障功能是当前人医临床和兽医临床普遍面临的严峻挑战。
3.硒是一种与生命活动密切相关的必需微量元素，具有抗氧化、抗癌、抗炎等多种生理功能。研究表明，适量补硒可缓解肠道炎症、改善肠道菌群结构、丰富肠道菌群多样性。硒的存在形式有无机硒、有机硒和纳米硒三种，无机硒和有机硒均是极毒元素，营养剂量范围小，使用时剂量难以控制。相比之下纳米硒具有更高的安全性和生物利用度，是制药和食品科学领域重要的硒源。但纳米硒胶体稳定性差，极易聚集转化成热力学稳定但生物惰性的灰色单质硒。
4.五味子是一味极具药用价值的传统上品中药材，中医理论认为五味子味酸、甘，性温，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心等功效，常用于久泻不止，自汗盗汗，梦遗滑精，遗尿尿频等病症。五味子多糖是五味子中药材中含量丰富且药理作用显著的功效成分之一，大量现代药理研究发现五味子多糖具有抗炎，维持肠道免疫平衡，抵抗肠道免受病原微生物侵袭等功效。
5.中药多糖类化合物和其他生物大分子物质一样，往往生物利用度极低，因此对其进行化学修饰改造提高生物利用度和活性成为近些年研究的热点。而纳米硒化修饰一方面可以提高多糖生物利用度，另一方面多糖作为软模板对维持纳米硒胶体稳定性及生物活性方面具有重要应用前景。目前，关于五味子多糖纳米硒的制备方法和活性研究尚未见报道。


技术实现要素：

6.1.要解决的技术问题
7.本发明的目的是为了解决现有技术中纳米硒在液相合成过程中容易团聚成大颗粒灰色或黑色硒而失去活性的问题，而提出的一种自组装五味子多糖纳米硒的制备方法。
8.2.技术方案
9.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
10.一种自组装五味子多糖纳米硒，包括五味子多糖3-6份、亚硒酸钠0.5-1份和维生素c 3-6.5份。
11.优选地，包括五味子多糖3份、亚硒酸钠1份和维生素c 3份。
12.优选地，包括五味子多糖6份、亚硒酸钠0.5份和维生素c 6.5份。
13.优选地，包括五味子多糖4份、亚硒酸钠0.7份和维生素c 4份。
14.本发明还提出了一种自组装五味子多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
15.步骤1：五味子多糖的分离，准确称取500g中药五味子饮片，加蒸馏水煎煮3次，每次1.5h，合并滤液，离心取上清并浓缩，80％乙醇进行醇沉，放置4℃环境静置过夜，收集沉淀，冷冻干燥得五味子粗多糖；
16.步骤2：五味子多糖的纯化，将步骤1中真空干燥后的五味子粗多糖用蒸馏水溶解，按多糖水溶液体积的1/4加入sevage试剂，剧烈振荡离心，收集上层液体，重复操作一定次数，然后将水相部分浓缩后，低温真空冷冻干燥得到脱蛋白的精制五味子多糖；
17.步骤3：然后分别配置50mm的亚硒酸钠溶液、100mm的维生素c溶液；
18.步骤4：称取步骤2中一定量纯化后的五味子多糖配置成一定浓度的储备液，在磁力搅拌下，将3ml五味子多糖储备溶液与0.5ml的亚硒酸钠溶液混合，30min后向混合液中逐滴加入1ml维生素c溶液，反应混合液混合均匀得五味子多糖纳米硒。
19.优选地，所述步骤1中按料水比1：30加蒸馏水。
20.优选地，所述步骤2中剧烈振荡30min，3500r/min离心5min。
21.优选地，所述步骤2中重复操作8-10次，至中间层无混浊沉淀为止。
22.本发明还提出了一种自组装五味子多糖纳米硒，其在肠道炎性损伤保护作用中的应用。
23.3.有益效果
24.相比于现有技术，本发明的优点在于：
25.本发明中，自组装五味子多糖纳米硒一方面克服了纳米硒在液相合成过程中容易团聚成大颗粒灰色或黑色硒而失去活性的弊端，另一方面通过对五味子多糖的纳米化改造提高其生物利用度和生物活性。
附图说明
26.图1为本发明中通过苯酚-硫酸法对各管多糖含量测定所得的洗脱曲线示意图；
27.图2为本发明中分别通过眼观观察纳米粒分散状态、紫外双波长比色法、激光粒度仪和电势仪对纳米溶胶稳态的检测结果图；
28.图3为本发明中对所获产物进行tem、xrd和sem-edx分析的结果图；
29.图4为本发明中五味子多糖纳米硒溶胶最佳保存条件测试中眼观状态及粒径分布和电势变化图；
30.图5为本发明中五味子多糖纳米硒对肠炎模型小鼠腹泻的缓解作用统计图；
31.图6为本发明中五味子多糖纳米硒对小鼠空肠组织形态影响的检测结果图；
32.图7为本发明中五味子多糖纳米硒对肠炎模型小鼠空肠组织中炎性因子表达影响的结果检测图。
33.图中：scp代表五味子多糖，scp-se nps代表五味子多糖纳米硒。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
35.实施例1：
36.一种自组装五味子多糖纳米硒，包括五味子多糖3-6份、亚硒酸钠0.5-1份和维生素c 3-6.5份。
37.本发明中，一种自组装五味子多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
38.步骤1：五味子多糖的分离，准确称取500g中药五味子饮片，加蒸馏水煎煮3次，每次1.5h，合并滤液，离心取上清并浓缩，80％乙醇进行醇沉，放置4℃环境静置过夜，收集沉淀，冷冻干燥得五味子粗多糖；
39.将真空干燥后的五味子粗多糖用蒸馏水溶解，按多糖水溶液体积的1/4加入sevage试剂，剧烈振荡30min，3500r/min离心5min，收集上层液体，重复操作8-10次，至中间层无混浊沉淀为止。然后将水相部分浓缩后，低温真空冷冻干燥得到脱蛋白的精制五味子多糖；
40.步骤2：五味子多糖的纯化，将步骤1中真空干燥后的五味子粗多糖用蒸馏水溶解，按多糖水溶液体积的1/4加入sevage试剂，剧烈振荡离心，收集上层液体，重复操作一定次数，然后将水相部分浓缩后，低温真空冷冻干燥得到脱蛋白的精制五味子多糖；
41.称取100mg精制五味子多糖溶于10ml去离子水中，上样于deae-52层析(2.6cm
×
30cm)柱中，每10min收集一管，流速1ml/min，分别通过去离子水、0.2m、0.4m和0.6mnacl溶液洗脱，分别每种洗脱液收集50管，通过苯酚-硫酸法测定各管多糖含量并绘制洗脱曲线，合并含有多糖的收集管，透析48h后冻干，得到纯五味子多糖，结果见图1。
42.本发明中，结果表明，纯化五味子多糖主要集中在10-22，38-44和60-74管；
43.步骤3：然后分别配置50mm的亚硒酸钠溶液、100mm的维生素c溶液，称取一定量纯化后的五味子多糖配置成一定浓度的储备液，在磁力搅拌下，将3ml五味子多糖储备溶液与0.5ml的亚硒酸钠溶液混合，30min后向混合液中逐滴加入1ml维生素c溶液，反应混合液混合均匀。
44.使五味子多糖最终添加量为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，获得溶胶经过48h透析(截留分子量3500da)后，通过眼观观察纳米粒分散状态，紫外双波长比色法、激光粒度仪和电势仪检测纳米溶胶的稳态,确定五味子多糖最佳添加浓度，结果见图2。
45.本发明中，结果表明当五味子多糖作为软模板浓度达到0.1mg/ml时，所制备的纳米粒子粒径最小且更稳定性更好；
46.步骤4：称取步骤2中一定量纯化后的五味子多糖配置成一定浓度的储备液，在磁力搅拌下，将3ml五味子多糖储备溶液与0.5ml的亚硒酸钠溶液混合，30min后向混合液中逐滴加入1ml维生素c溶液，反应混合液混合均匀得五味子多糖纳米硒。
47.本发明中，使五味子多糖最终添加量为0.1mg/ml，获得溶胶经过48h透析(截留分子量3500da)后，对所获产物进行tem、xrd和sem-edx分析，结果见图3。
48.本发明中，结果表明本发明所制备的五味子多糖纳米硒形貌规则、分散均匀、粒径适中(120nm左右)，呈无定形态，c，o和se的元素组成比例分别为65.6％，15.3％和18.5％。
49.实施例2：
50.其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本技术实施例中，其与上述实施例的区别在于：
51.本发明中，一种自组装五味子多糖纳米硒，其在肠道屏障保护作用中的应用。
52.实施例3：
53.其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本技术实施例中，其与上述实施例的区别在于：
54.本发明中，五味子多糖纳米硒溶胶最佳保存条件考察：称取一定量纯化后的五味子多糖配置成一定浓度的储备液，在磁力搅拌下，将3ml五味子多糖储备溶液与0.5ml的亚硒酸钠溶液混合，30min后向混合液中逐滴加入1ml维生素c溶液，反应混合液混合均匀，使五味子多糖最终添加量为0.1mg/ml，获得溶胶经过48h透析(截留分子量3500da)后，均分为两份分别置于4℃和室温环境中观察样品在0、3、7和14天的眼观状态及粒径分布和电势变化，结果见图4。
55.本发明中，结果表明本发明所制备的五味子多糖纳米硒在4℃保存稳定性更佳，至少可以稳定保存14天。
56.实施例4：
57.其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本技术实施例中，其与上述实施例的区别在于：
58.一种自组装五味子多糖纳米硒，其特征在于，包括五味子多糖3份、亚硒酸钠1份和维生素c 3份。
59.实施例5：
60.其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本技术实施例中，其与上述实施例的区别在于：
61.一种自组装五味子多糖纳米硒，其特征在于，包括五味子多糖6份、亚硒酸钠0.5份和维生素c 6.5份。
62.实施例6：
63.其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本技术实施例中，其与上述实施例的区别在于：
64.一种自组装五味子多糖纳米硒，其特征在于，包括五味子多糖4份、亚硒酸钠0.7份和维生素c 4份。
65.本发明中，自组装五味子多糖纳米硒一方面克服了纳米硒在液相合成过程中容易团聚成大颗粒灰色或黑色硒而失去活性的弊端，另一方面通过对五味子多糖的纳米化改造提高其生物利用度和生物活性。
66.实施例7：五味子多糖纳米硒对肠炎模型小鼠腹泻的缓解作用
67.其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本技术实施例中，其与上述实施例的区别在于：
68.取28只小鼠，分为空白对照组、模型组、五味子多糖组和五味子多糖纳米硒组。具体试验设计如下：(1)正常对照组灌胃生理盐水；(2)模型组灌胃生理盐水；(3)五味子多糖组灌胃五味子多糖溶液；(4)五味子多糖纳米硒组灌胃五味子多糖纳米硒溶液。灌胃给药14d后，模型组、五味子多糖组及五味子多糖纳米硒组腹腔注射脂多糖(lps)，正常对照组腹腔注射等量生理盐水。腹腔给药后观察并记录6h内小鼠的体重、粪便潜血及腹泻情况，用于疾病活动指数评分(dai)。6h后，使用乙醚麻醉小鼠后解剖并采集0.5cm左右的空肠组织于trizol裂解液中用于后续荧光定量pcr实验，取1cm左右空肠组织固定于4％多聚甲醛溶液中，固定空肠组织24h后，脱水，透明，石蜡包埋，切片厚度3μm。对切片进行苏木精伊红染色。
拍摄图像，测量空肠组织的绒毛高度及隐窝深度，计算二者的比值。
69.五味子多糖纳米硒对肠炎模型小鼠行为的影响：
70.对照组小鼠反应灵活，活动频繁，被毛干净光滑，大便成形。模型组小鼠精神沉郁，懒动，喜扎堆，竖毛且被毛无光泽，腹泻，肛门周围粪污污染，粪便腥臭，潜血呈阳性，说明模型建立成功。五味子多糖及五味子多糖纳米硒组小鼠腹泻症状较模型组明显缓解，且五味子多糖纳米硒组优于五味子多糖组。疾病活动指数评分结果如图5所示。
71.五味子多糖纳米硒对肠炎模型小鼠空肠组织形态影响：
72.对照组中，小鼠空肠绒毛结构完整，排列有序。模型组中，小鼠空肠绒毛结构被破坏，上皮细胞脱落，绒毛发生断裂、脱落和萎缩，绒毛高度显著降低，隐窝深度显著增加，绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低。与模型组相比，经五味子多糖和五味子多糖纳米硒处理的小鼠空肠绒毛结构破坏均得到明显缓解，绒毛结构趋于完整，没有出现大面积的绒毛脱落，且绒毛排列也比较整齐，其绒毛高度增高和隐窝深度变浅，绒毛高度与隐窝深度的比值显著升高，结果如图6所示。
73.五味子多糖纳米硒对肠炎模型小鼠空肠组织中炎性因子表达的影响：
74.与对照组相比，肠炎模型组小鼠空肠组织中促炎细胞因子il-1β、il-6和tnf-α表达量显著升高，而五味子多糖与五味子多糖纳米硒组上述指标的表达量均较模型组显著降低，且五味子多糖纳米硒效果更明显，结果如图7所示。
75.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。