ADGRA2作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物的应用

adgra2作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物的应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤标志物技术领域，具体涉及adgra2作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物的应用。


背景技术：

2.最新的全球癌症负担统计数据显示，2020年新增乳腺癌病例230万例(11.7％)，超过肺癌，成为最常见的癌症。乳腺癌也是全世界妇女因癌症死亡的主要原因，给女性健康带来了巨大威胁。乳腺癌患者的发病率增加和不良预后仍然是全球乳腺癌防控的关键。由于乳腺癌存在的复杂性和异质性，目前的预后标记物在提高预测效率方面能力不足。因此，识别具有预后能力的新型乳腺癌生物标志物至关重要。
3.粘附g蛋白偶联受体a2(adhesion g protein-coupled receptor a2，adgra2)能够参与调控肿瘤的血管生成，抑制adgra2能够克服非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药；另外，adgra2还可以通过调节有丝分裂进程的持续时间影响胶质母细胞瘤细胞的增殖。但是，adgra2在乳腺癌发生发展中的作用尚未见报道。


技术实现要素：

4.本发明发现在乳腺癌组织中adgra2的表达与患者的化疗疗效和预后相关，乳腺癌组织中高表达adgra2会明显降低患者的化疗反应和生存期。
5.本发明目的在于提供一种可以实际应用于乳腺癌化疗疗效和预后评价的生物标志物及其制备方法。经验证，adgra2的表达情况可以用于乳腺癌患者化疗疗效和预后情况的判断，能够作为评估乳腺癌患者化疗疗效和预后的生物标志物进行临床应用。
6.本发明提供了一种adgra2作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物的应用，其特征在于，通过检测患者的adgra2来作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物。
7.优选地，检测的样本为患者的临床生物样本，包括血清、血浆、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片、肿瘤组织、循环肿瘤dna或源生的外泌体中的一种或几种。
8.本发明还提供了一种能够评价乳腺癌化疗疗效和预后的试剂，所述试剂能够在基因水平或蛋白水平上检测adgra2表达及其产物。
9.优选地，所述试剂包括adgra2的引物、探针、基因芯片或抗体。
10.本发明还提供了一种能够评价乳腺癌化疗疗效和预后的试剂盒，所述试剂盒包括能够在基因水平或蛋白水平上检测adgra2表达及其产物的试剂。
11.优选地，所述试剂包括adgra2的引物、探针、基因芯片或抗体。
12.本发明还提供了一种adgra2作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物在构建乳腺癌化疗疗效和预后评估模型中的应用，通过检测患者的adgra2来作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物，并将其应用于构建乳腺癌化疗疗效和预后评估模型。
13.本发明还提供了一种靶向adgra2的试剂在制备改善乳腺癌预后药物中的应用，靶
向adgra2的试剂包括针对adgra2或其上游基因或其下游基因设计的功能性表达的抑制剂，所述adgra2功能性表达的抑制剂包括特异抑制adgra2基因/蛋白质表达或活性的小分子物质、特异性抗体。
14.本发明还提供了一种乳腺癌治疗药物，所述乳腺癌治疗药物以adgra2作为治疗靶点，包括针对adgra2或其上游基因或其下游基因设计的功能性表达的抑制剂，所述adgra2功能性表达的抑制剂包括特异抑制adgra2基因/蛋白质表达或活性的小分子物质、特异性抗体。
15.本发明发现乳腺癌组织中adgra2的表达情况与患者化疗疗效和生存期具有显著的相关性，adgra2高表达的患者，新辅助化疗后的病理完全缓解(pcr)率、乳腺癌特异性生存期和无疾病生存期明显降低。在肿瘤组织中进行adgra2的表达情况分析，能够预测患者的化疗反应和预后情况，更好的指导临床决策，为患者治疗方案的选择提供参考，以便及时对患者进行治疗，延长生存时间，提高生存率，对于乳腺癌的精准诊疗具有重要的意义。
16.本发明综合利用了临床样本的免疫组织化学分析和外部公共测序数据验证，明确了adgra2可以作为乳腺癌患者化疗疗效和预后评价生物标志物，弥补了现有乳腺癌相关指标的不足，具有良好的临床价值。
17.通过本发明，提供了adgra2作为乳腺癌化疗疗效和预后生物标志物的应用，特别是在制备乳腺癌化疗疗效和预后评价试剂盒以及在构建乳腺癌预后评估模型中的应用。
18.通过本发明，提供了靶向adgra2在乳腺癌治疗和改善乳腺癌预后药物中的临床应用。
附图说明
19.图1为adgra2表达与乳腺癌患者预后相关性分析。
20.图2为在公共数据库中验证adgra2表达与乳腺癌患者新辅助化疗病理完全缓解(pcr)率和生存的相关性。
具体实施方式
21.实施例1：
22.利用免疫组织化学分析乳腺癌患者肿瘤组织中adgra2的表达情况及其与预后的相关性。
23.(1)选取2013-2018年在山东大学第二医院就诊且在术前接受了至少2周期新辅助化疗的女性乳腺癌患者，纳入初诊、病理诊断为乳腺癌，年龄在25-70岁，接受系统治疗，具有完整随访资料的患者，共计156人。
24.(2)收集该156例患者的活检组织石蜡样本，制作成组织芯片，切成4μm厚的石蜡组织切片备用。
25.(3)通过免疫组织化学方法检测组织芯片石蜡切片中adgra2的表达情况。具体步骤如下：
26.步骤1.脱蜡至水
27.石蜡切片60℃烤箱烤片1h；
28.二甲苯10min
×
3次；
29.依次经过100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、双蒸水，各5min；
30.步骤2.抗原修复
31.3％h2o2甲醇液20min；
32.双蒸水洗5min
×
3次；
33.抗原修复(高压修复)：切片放入盛有edta碱性修复液(2mm edta、2mm na2hpo4)的高压锅中，高压煮沸2min，自然冷却至室温；
34.步骤3.一抗孵育
35.pbs洗5min；滴加50μl adgra2抗体，在湿盒中4℃孵育过夜；
36.步骤4.二抗孵育
37.吸弃一抗，pbs洗5min
×
4次；
38.滴加50μl hrp标记的二抗，37℃孵育30-45min；
39.步骤5.显色、反蓝
40.pbs洗5min
×
4次；
41.dab(1:50)显色3-10min，至出现砖红色沉淀，双蒸水终止显色；
42.苏木素复染10min，盐酸酒精分化后自来水冲洗反蓝20-30min；
43.步骤6.脱水封片
44.依次经过双蒸水、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、石炭酸、二甲苯，各5min。滴加树脂封片；
45.步骤7.观察评价和评分
46.由2名病理科医生对染色后切片进行评价，显微镜下观察乳腺癌细胞中adgra2的表达水平。2名病理科医生在不明确患者任何临床信息的前提下以“背靠背”的方式进行。评分结果分为两部分：adgra2染色强度和adgra2染色阳性细胞比例。染色强度分为0(无着色)、1 (弱着色)、2 (中等着色)和3 (强着色)分别记为0分、1分、2分和3分。统计乳腺癌细胞adgra2染色阳性的比例，使用百分比表示。最终将强度评分与比例相乘得到免疫组化评分的总分(总分范围0-300)。
47.(4)对入组的所有患者进行随访，收集患者诊断为乳腺癌后5年的随访资料，明确患者的生存状态，根据乳腺癌组织中adgra2的免疫组化评分总分和生存数据绘制受试者工作特征(roc)曲线，获得adgra2表达高低的临界值(cut-off值)，按照cut-off值将乳腺癌患者分为adgra2高表达和低表达组。使用spss 23.0软件中kaplan-meier生存分析法和cox比例风险回归模型对患者的预后情况进行分析，明确adgra2表达高低对患者的无病生存期和乳腺癌特异性生存期的影响。
48.结果如图1显示，乳腺癌组织中adgra2高表达的患者与低表达的患者相比，无病生存期(dfs)与乳腺癌特异生存期(bcss)显著降低，在校正了年龄、月经状态、临床t/n分期、组织学分级、er/pr/her2/ki67状态、内分泌治疗和放疗等临床病理因素后，adgra2表达与患者生存期仍具有相关性，相关性具有统计学意义，表明adgra2表达能够作为独立的预后预测因素判断乳腺癌患者的生存情况。
49.实施例2：
50.利用公共数据库tcga和geo网站数据验证adgra2表达与乳腺癌患者化疗疗效和生存的相关性。
51.(1)从gdc data portal(https://portal.gdc.cancer.gov)下载tcga数据库中接受化疗的乳腺癌患者的临床数据及乳腺癌组织的rna-seq转录组数据，其中rna-seq转录组数据以ht-seq tpm形式显示。
52.(2)获取tcga乳腺癌组织转录组数据中adgra2的表达情况，结合随访数据，利用kaplan-meier生存分析adgra2表达与患者无病生存期(dfs)与乳腺癌特异生存期(bcss)的相关性。
53.(3)在geo网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载接受新辅助化疗的乳腺癌组织样本的基因芯片检测数据(gse25066)，分析adgra2表达情况与患者病理完全缓解(pcr)率和无病生存期(dfs)的相关性。
54.结果表明，adgra2高表达的患者与低表达患者相比，新辅助化疗后病理完全缓解(pcr)率、无病生存期(dfs)与乳腺癌特异生存期(bcss)显著降低，具有统计学意义(参见图2)，从而在外部数据库中验证了adgra2表达作为乳腺癌患者化疗疗效和预后评估标志物的临床应用价值。