一种抗大豆疫霉根腐病种质资源的鉴定方法

1.本发明涉及病菌鉴定技术领域，尤其涉及一种抗大豆疫霉根腐病种质资源的鉴定方法。


背景技术：

2.大豆疫霉根腐病是一种由大豆疫霉菌(phytophthora sojae)引起的，对大豆生产危害程度极大并且具有毁灭性的重要病害。大豆疫霉菌在大豆整个生育时期的任何阶段均可侵染，引起种子和幼苗根茎腐烂。刚刚出土的感病幼苗表现为近地表部分植株茎杆出现病斑，呈水渍状软腐，叶子变暗灰色或红色，感染严重时叶片发黄萎蔫从茎部或基部腐烂并折断，导致幼苗停止生长或死亡。感病品种成株期受侵染后茎秆变为棕色，并不同程度向上扩展，茎基部出现黑褐色病斑，茎中空易断裂，豆荚减少易脱落。植株感染严重时侧根和根瘤几乎全部腐烂，棕色下垂的叶子在植株死亡以后也不会掉落，而是仍然附着在茎上。抗病品种一般表现为侧根出现轻微腐烂、植株矮化、叶片轻度失绿发黄，偶尔在植株茎部出现褐色病斑。
3.大豆对疫霉根腐病的抗性类型有两种，一类是质量性状称为垂直抗性(vertieal resistance)，又称小种专化性抗性(race-spceific resistance)或完全抗性(complete resistanee)。由单基因(resistance gene，r基因)控制，寄主表现出对某些生理小种高抗或免疫，而对其他生理小种感病的特性；另一种是数量性状称为水平抗性(horizontal resistance)，又称为非小种专化抗性(race-nonspecific resistance)、部分抗性(partial resistance)或抗病性(tolerance)。由多基因(quantitative trait loci，qtl)控制，寄主表现出对目前发现的大豆疫霉菌生理小种都具有大致相同的抗性。
4.防治大豆疫霉根腐病最经济、有效的方法就是种植抗病品种。目前筛选大豆疫霉根腐病抗性资源的方法主要有：下胚轴接种法、黄化苗接种法、离体子叶接种法、豆荚接种法、温室菌盘接种法、斜板箱接种法、田间鉴定法等。目前较为常用的是下胚轴接种法。具体操作为：挑选籽粒饱满、无病斑的种子放置在塑料钵中，待幼苗第一对真叶完全展开时，用无菌刀片在子叶下胚轴1cm处划开一条伤口，伤口长度大约为1cm，深度为不超过大豆幼苗茎粗的1/3。将已培养10d的长满大豆疫霉菌菌丝的ca培养基切成1cm
×
1cm大小的菌块接种在伤口处，接种后的大豆幼苗继续培养，接种7d后进行抗性调查。表现为抗病的植株可正常生长，只接种部位局部变褐色，长势挺拔，轻触不会断裂。感病种质接种部位变红棕色并伴有水渍，从接种伤口处上方折断、死亡。该方法简单方便、结果直观，但是鉴定结果不够准确。因此，有必要提供一种新的改良的抗大豆疫霉根腐病种质资源的鉴定方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种抗大豆疫霉根腐病种质资源的鉴定方法，提高传统鉴定方法的准确性。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种抗大豆疫霉根腐病种质资源的鉴定方法，包括如下步骤：
8.(1)培育待鉴定大豆幼苗至第1～2片真叶完全展开；
9.(2)在子叶下胚轴1～2cm处划开伤口接种大豆疫霉菌；
10.(3)接种后的大豆幼苗置于相对湿度80％～90％的条件下培养；
11.(4)培养结束后，进行抗性观察。
12.优选的，所述大豆疫霉菌的接种量为0.5～1.5cm2/株。
13.优选的，步骤(3)中，所述培养时光照培养8～16h，黑暗培养8～16h。
14.优选的，所述光照培养时的温度为26～30℃，所述黑暗培养时的温度为16～20℃。
15.优选的，所述培养的时间为5～9天。
16.本发明提供了一种抗大豆疫霉根腐病种质资源的鉴定方法，本发明通过优化接种后大豆幼苗的培养条件，提高了鉴定结果的准确性。
具体实施方式
17.本发明提供了一种抗大豆疫霉根腐病种质资源的鉴定方法，包括如下步骤：
18.(1)培育待鉴定大豆幼苗至第1～2片真叶完全展开；
19.(2)在子叶下胚轴1～2cm处划开伤口接种大豆疫霉菌；
20.(3)接种后的大豆幼苗置于相对湿度80％～90％的条件下培养；
21.(4)培养结束后，进行抗性观察。
22.本发明将待鉴定大豆幼苗培育至第1～2片真叶完全展开。
23.在本发明中，所述待鉴定大豆幼苗优选在塑料钵中培育。
24.在本发明中，所述待鉴定大豆幼苗的培养温度优选为10～15℃，进一步优选为12℃。
25.培育得到待鉴定大豆幼苗后，在子叶下胚轴1～2cm处划开伤口接种大豆疫霉菌，优选在子叶下胚轴1cm处划开伤口。
26.在本发明中，所述大豆疫霉菌的接种量为0.5～1.5cm2/株，优选为1cm2/株。
27.在本发明中所述大豆疫霉菌优选为培养10天的长满大豆疫霉菌菌丝的ca培养基。
28.本发明将接种后的大豆幼苗置于相对湿度80％～90％的条件下培养。
29.在本发明中，所述培养的相对湿度进一步优选为85％。
30.在本发明中，所述培养时光照培养8～16h，黑暗培养8～16h，优选为光照培养12h，黑暗培养12h。
31.在本发明中，所述光照培养时的温度为26～30℃，优选为28℃。
32.在本发明中，所述黑暗培养时的温度为16～20℃，优选为18℃。
33.在本发明中，所述培养的时间为5～9天，优选为7天。
34.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
35.实施例1
36.采用本发明的方法和现有方法对以下大豆种质资源(表1)的抗性进行鉴定。
37.本发明方法：每种大豆种质资源挑选籽粒饱满、无病斑的种子置于塑料钵中在12℃下培养发芽，待幼苗第一对真叶完全展开时，用无菌刀片在子叶下胚轴1cm处划开一条伤
口，用于接种。山口长度为1cm，深度不超过大豆幼苗茎粗的1/3。将已培养10d的长满大豆疫霉菌菌丝的ca培养基，切成1cm
×
1cm大小的菌块接种在伤口处，种后的大豆幼苗放置在12h光照12h黑暗的条件下培养，控制光照条件下培养温度为28℃，黑暗条件下培养温度为18℃，全天相对湿度85％，试验进行三次重复。接种7d后进行抗性调查。
38.现有方法：每种大豆种质资源挑选籽粒饱满、无病斑的种子置于塑料钵中在12℃下培养发芽，待幼苗第一对真叶完全展开时，用无菌刀片在子叶下胚轴1cm处划开一条伤口，用于接种。山口长度为1cm，深度不超过大豆幼苗茎粗的1/3。将已培养10d的长满大豆疫霉菌菌丝的ca培养基，切成1cm
×
1cm大小的菌块接种在伤口处，接种后的大豆幼苗在12h光照12h黑暗，全天温度为28℃、相对湿度100％的环境条件下进行培养，试验进行三次重复。接种7d后进行抗性调查。
39.判断方法：表现为抗病的植株可正常生长，只接种部位局部变褐色，长势挺拔，轻触不会断裂。感病种质接种部位变红棕色并伴有水渍，从接种伤口处上方折断、死亡。倒伏率≤30％为抗病(resistant，r)，倒伏率≥70％为感病(susceptible，s)，30％＜倒伏率＜70％记为中间类型(interminate，i)。统计结果如表1所示。
40.表1大豆种质资源及其抗性和鉴定结果
41.42.[0043][0044]
注：r为抗性，s为感性，i为中间型。
[0045]
从实验结果可以看出，本发明提供的鉴定方法要比传统鉴定方法更加准确。
[0046]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。