一种基于冷冻结晶-高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方法

1.本发明属于分析化学分离分析技术领域，涉及一种基于冷冻结晶-高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方法。


背景技术：

2.橄榄油是由新鲜的油橄榄果实直接经过物理冷榨获得的，不经过任何化学处理。在冷榨过程中，油橄榄果实中的天然脂溶性色素（类胡萝卜素和叶绿素）转移至油相，构成了橄榄油独特的颜色。且橄榄油的颜色会在一定程度上影响消费者的选择，研究发现，黄绿色较深的橄榄油更受消费者欢迎。和其它一般食品一样，橄榄油的不良加工或不适宜的储存条件会导致其天然色素的变质或破坏。因此，橄榄油的颜色与其真实性、新鲜度和质量指标密切相关。
3.类胡萝卜素和叶绿素是重要的营养物质和天然脂溶性抗氧化剂。在橄榄油储存期间，类胡萝卜素和叶绿素可以作为保护剂，防止光氧化，其抗氧化潜力与其在橄榄油中的含量呈正相关。此外，类胡萝卜素和叶绿素的生物活性对人类健康极为有利。具有特定结构的类胡萝卜素作为维生素a前体，对于人体健康有极大益处，如叶黄素和β-胡萝卜素，可以改善认知功能和心血管健康，防止老年性黄斑变性和白内障的形成。而叶绿素和一系列叶绿素衍生物在预防退行性疾病方面显示出巨大的潜力，主要表现在抗氧化和抗突变活性，调节生物酶活性，以及诱导癌细胞系的凋亡等方面。
4.橄榄油的高脂含量是影响从其中提取分离类胡萝卜素和叶绿素等脂溶性成分的主要原因，除去甘油三脂对分析检测橄榄油中的脂溶性成分至关重要。固相萃取法和液液萃取法是目前同时从榨橄榄油中提取分离类胡萝卜素和叶绿素的常用方法。但这两种方法均需进行皂化实验以除去脂质获得β-胡萝卜素，操作较为繁琐且皂化过程易造成色素的损失。为了简化从橄榄油中分离检测色素的过程，本文开发了一种基于冷冻结晶-高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方法。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于冷冻结晶-高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方法；本发明可以同时从橄榄油中得到类胡萝卜素和叶绿素，避免了皂化过程，且整体色素提取率高。
6.本发明提供的基于冷冻结晶-高效液相色谱法分离检测橄榄油中色素的方法，包括如下的步骤：（1）冷冻结晶提取分离色素将橄榄油与提取溶剂按照料液比1：10~1：80充分混合，提取溶剂为由甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一种、两种或者三种的混合溶剂；将样品置于-18℃~-80℃环境中，冷冻4h~24 h，使橄榄油中的甘油三酯完全固化
结晶；迅速抽滤除去固化甘油三酯，得到含有类胡萝卜素和叶绿素的滤液；将滤液在25℃下用旋转蒸发器蒸发至干，残余物溶于600μl乙酸乙酯中，经0.45 μm有机滤膜过滤后，得到含类胡萝卜素和叶绿素的样品。
7.（2）样品高效液相色谱检测：采用高效液相色谱对提取得到色素样品在如下色谱条件下使色素完全分离，同时可以得到色素样品的色谱峰面积；分离的类胡萝卜素包括叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素，叶绿素包括脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素b、焦脱镁叶绿素a；高效液相色谱条件如下：色谱柱为依利特sinochrom ods-bp柱（250 mm
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4.6 mm, 5 μm）；柱温为25℃；流动相为甲醇：乙酸乙酯（1:1 v/v）（a相）和甲醇：水：1 m乙酸铵（8:1:1 v/v/v）（b相）；洗脱方式为梯度洗脱（梯度洗脱中，各时间段流动相a所占体积比分别为：0~10 min，a相25%~55%；10~15 min，a相55%~75%；15~20 min，a相75%~90%；20~25 min，90%~100%；25~28 min，a相100%；28~30 min，a相100%~25%）；流速为1.0 ml/min；注射量为20 μl；类胡萝卜素和叶绿素分别在波长为450nm和670 nm处被检测。
8.（3）样品定量检测分别准确配置了不同浓度的叶黄素乙酸乙酯溶液（5.0、10、50、100、400μg/ml）、β-胡萝卜素乙酸乙酯溶液（5.0、20、100、200、400μg/ml）和脱镁叶绿素a乙酸乙酯溶液（0.7、1.4、7.0、35、70μg/ml），在上述色谱条件下，测定系列不同浓度的叶黄素、β-胡萝卜素和脱镁叶绿素a的峰面积，建立色谱峰面积和浓度之间的定量标准曲线线性关系；叶黄素在浓度为5.0~400 μg/ml范围内，色素的浓度与色谱峰面积之间的线性关系为y=23753x 7.5787，线性相关系数r2=0.9995，其中x为叶黄素的浓度，单位μg/ml，y为色谱峰面积；β-胡萝卜素在浓度为5.0~400 μg/ml范围内，色素的浓度与色谱峰面积之间的线性关系为y=24294x 26.826，线性相关系数r2=0.9999，其中x为β-胡萝卜素的浓度，单位μg/ml，y为色谱峰面积；脱镁叶绿素a在浓度为0.7~70 μg/ml范围内，色素的浓度与色谱峰面积之间的线性关系为y=69652x 7.8345，线性相关系数r2=0.9999，其中x为脱镁叶绿素a的浓度，单位μg/ml，y为色谱峰面积。
9.根据步骤（2）得到的色素样品的色谱峰面积并结合标准曲线的线性关系，定量得到色素样品中所含色素的浓度。
10.（4）方法验证：采用叶黄素、β-胡萝卜素和脱镁叶绿素a进行方法验证（色谱图分别如图1、图2、图3）。标准曲线相关系数r2≥0.9995；方法检测限和定量限分别为0.125~0.625μg/ml和0.5~2.5 μg/ml；日内和日间精密度度分别为1.4%~2.4%和2.7%~3.6%；加标回收率为84.2%~113.1%。
11.（5）本发明与其他传统固相萃取法和液液萃取法比较（色谱图分别如图4、图5、图6），以叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素和脱镁叶绿素a的峰面积进行比较，结果如下表，可以看出对色素的提取效率分别是传统固相萃取法和液液萃取法的1.0~1.9倍和1.0~2.5倍，优于传统方法。
12.综上所述，本发明首次采用冷冻结晶法提取橄榄油中的色素，可以同时使橄榄油中的类胡萝卜素和叶绿素及其衍生物被最大限度的分离出来，操作简单，避免皂化过程及皂化过程对目标物造成的损失；本发明中流动相采用乙酸乙酯代替报道的丙酮，避免了使用管制试剂，并且采用优化后的洗脱梯度，可以在29min内使色素完全分离；通过方法验证，本发明具有良好的准确性、稳定性和重复性。
附图说明
13.图1是在450 nm波长处叶黄素的标准色谱图。
14.图2是在450 nm波长处β-胡萝卜素的标准色素图。
15.图3是在670 nm波长处脱镁叶绿素a的标准色谱图。
16.图4是采用本发明方法处理橄榄油测得的色谱图。a为在波长为450 nm处检测，b为在波长为670 nm处检测（1：叶黄素，2：cis-叶黄素及其异构体，3：cis-β-胡萝卜素，4：β-胡萝卜素，5：脱镁叶绿素a及其异构体）。
17.图5是采用固相萃取法处理橄榄油测得的色谱图。a为在波长为450 nm处检测，b为在波长为670 nm处检测（1：叶黄素，2：cis-叶黄素及其异构体，3：cis-β-胡萝卜素，4：β-胡萝卜素，5：脱镁叶绿素a及其异构体）。
18.图6是采用液液萃取法处理橄榄油测得的色谱图。a为在波长为450 nm处检测，b为在波长为670 nm处检测。（1：叶黄素，2：cis-叶黄素及其异构体，3：cis-β-胡萝卜素，4：β-胡萝卜素，5：脱镁叶绿素a及其异构体）。
具体实施方式
19.下面通过具体实施对本发明基于冷冻结晶-高效液相色谱法分离及检测特级初榨橄榄油中色素的方法做进一步说明，以下实施例用于本发明，但不用来限制本发明的范围。
20.实施例1准确称取特级初榨橄榄油1.0 g于100 ml离心管中，向其中加入提取溶剂甲醇：乙酸乙酯：乙醇（5:3:2 v/v/v）60ml，上下振摇2~3次；将样品在-18℃冷冻24小时；迅速抽滤除去固化甘油三酯，得到含有类胡萝卜素和叶绿素的滤液；将滤液在25℃旋转蒸发至干，残余物溶于600 μl乙酸乙酯中，经0.45 μm有机滤膜过滤后，采用高效液相色谱进行分析检测，各色素的峰面积如表1。并采用峰面积对特级初榨橄榄油中的类胡萝卜素（叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素）和叶绿素（脱镁叶绿素a）进行定量分析，计算得到类胡萝卜素中叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素的含量分别为24.65
±
0.28、2.38
±
0.02、0.56
±
0.02、11.43
±
0.10 mg/kg（其中cis-叶黄素和cis-β-胡萝卜素的浓度分别根据叶黄素和β-胡萝卜素的标准曲线计算得到）；叶绿素中脱镁叶绿素a的含量为2.00
±
0.01 mg/kg。
21.高效液相色谱分析条件为：色谱柱：依利特sinochrom ods-bp (250 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm, 5 μm)；柱温：25℃；流动相组成：流相a：甲醇乙酸：乙酯（1:1 v/v）、流动相b：甲醇：水：1 m乙酸铵（8:1:1 v/v/v）；洗脱方式：梯度洗脱（0~10 min，a相25%~55%；10~15 min，a相55%~75%；15~20 min，a相75%~90%；20~25 min，90%~100%；25~28 min，a相100%；28~30 min，a相100%~25%）；流速：1.0 ml/min；检测波长：450 nm、670 nm。
22.实施例2准确称取特级初榨橄榄油1.0 g于100 ml离心管中，向其中加入提取溶剂甲醇：乙酸乙酯：乙醇（5:3:2 v/v/v）60ml，上下振摇2~3次；将样品在-40℃冷冻24小时；迅速抽滤除去固化甘油三酯，得到含有类胡萝卜素和叶绿素的滤液；将滤液在25℃旋转蒸发至干，残余物溶于600 μl乙酸乙酯中，经0.45 μm有机滤膜过滤后，采用高效液相色谱进行分析检测，，各色素的峰面积如表2。并采用峰面积对特级初榨橄榄油中的类胡萝卜素（叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素）和叶绿素（脱镁叶绿素a）进行定量分析，计算得到类胡萝卜素中叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素的含量分别为26.25
±
0.34、2.82
±
0.09、0.67
±
0.03、13.24
±
0.15 mg/kg（其中cis-叶黄素和cis-β-胡萝卜素的浓度分别根据叶黄素和cis-β-胡萝卜素的标准曲线计算得到）；叶绿素中脱镁叶绿素a的含量为2.04
±
0.01mg/kg。
23.高效液相色谱条件与实施例1相同。
24.实施例3准确称取特级初榨橄榄油1.0 g于100 ml离心管中，向其中加入提取溶剂甲醇：乙酸乙酯：乙醇（5:3:2 v/v/v）50ml，上下振摇2~3次；将样品在-40℃冷冻24小时，使甘油三酯充分固化结晶；迅速抽滤除去固化甘油三酯，得到含有类胡萝卜素和叶绿素的滤液；将滤液
在25℃旋转蒸发至干，残余物溶于600 μl乙酸乙酯中，经0.45 μm有机滤膜过滤后，采用高效液相色谱进行分析检测，各色素的峰面积如表3。并采用峰面积对特级初榨橄榄油中的类胡萝卜素（叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素）和叶绿素（脱镁叶绿素a）进行定量分析，计算得到类胡萝卜素中叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素的含量分别为28.26
±
0.32、2.78
±
0.07、0.67
±
0.02、12.37
±
0.46 mg/kg（其中cis-叶黄素和cis-β-胡萝卜素的浓度分别根据叶黄素和cis-β-胡萝卜素的标准曲线计算得到）；叶绿素中脱镁叶绿素a的含量为1.99
±
0.05 mg/kg。
25.高效液相色谱条件与实施例1相同。
26.实施例4准确称取特级初榨橄榄油1.0 g于100 ml离心管中，向其中加入提取溶剂甲醇：乙酸乙酯：乙醇（5:3:2 v/v/v）60 ml，上下振摇2~3次；将样品在-40℃冷冻18小时，使甘油三酯充分固化结晶；迅速抽滤除去固化甘油三酯，得到含有类胡萝卜素和叶绿素的滤液；将滤液在25℃旋转蒸发至干，残余物溶于600 μl乙酸乙酯中，经0.45 μm有机滤膜过滤后，采用高效液相色谱进行分析检测，用于定量的各色素的峰面积如表4。并采用峰面积对特级初榨橄榄油中的类胡萝卜素（叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素）和叶绿素（脱镁叶绿素a）进行定量分析，计算得到类胡萝卜素中叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素的含量分别为26.25
±
0.34、2.83
±
0.09、0.67
±
0.03、13.24
±
0.15 mg/kg（其中cis-叶黄素和cis-β-胡萝卜素的浓度分别根据叶黄素和cis-β-胡萝卜素的标准曲线计算得到）；叶绿素中脱镁叶绿素a的含量为2.04
±
0.01 mg/kg。
27.液相色谱条件与实施例1相同。
28.实施例5准确称取特级初榨橄榄油1.0 g于100 ml离心管中，向其中加入提取溶剂甲醇：乙酸乙酯：乙醇（5:3:2 v/v/v）50 ml，上下振摇2~3次；将样品在-60℃冷冻24小时，使甘油三
酯充分固化结晶；迅速抽滤除去固化甘油三酯，得到含有类胡萝卜素和叶绿素的滤液；将滤液在25℃旋转蒸发至干，残余物溶于600 μl乙酸乙酯中，经0.45 μm有机滤膜过滤后，采用高效液相色谱进行分析检测，并采用峰面积对特级初榨橄榄油中的类胡萝卜素（叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素）和叶绿素（脱镁叶绿素a）进行定量分析，计算得到类胡萝卜素中叶黄素、cis-叶黄素、cis-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素的含量分别为28.22
±
1.03、2.48
±
0.13、0.43
±
0.03、11.10
±
0.05 mg/kg（其中cis-叶黄素和cis-β-胡萝卜素的浓度分别根据叶黄素和cis-β-胡萝卜素的标准曲线计算得到）；叶绿素中脱镁叶绿素a的含量为1.71
±
0.04 mg/kg。
29.液相色谱条件与实施例1相同。