一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法及其降解率检测方法和降解液环境安全性评价方法

1.本发明属于煤的微生物转化技术领域，具体涉及一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法及其降解率检测方法和降解液环境安全性评价方法。


背景技术：

2.我国有高达55亿亩的退化土壤亟待修复，在化肥减量化的背景下，腐殖酸成为一种公认的绿色高效的土壤改良剂，风化煤和褐煤是目前生产腐殖酸的主要原料。煤可以在好氧微生物的作用下发生降解，研究表明煤的好氧微生物降解的主要产物是腐殖酸，相比于需要用到强酸强碱的化学提取法，生物法具有绿色温和等优点。
3.我国煤层气资源丰富，埋深2000m以浅煤层气地质资源量约26万亿立方米。煤可以在厌氧微生物的作用下产气，其基本原理是厌氧微生物利用煤中的部分有机质产生甲烷，从而增产煤层气，将煤转化为低碳清洁能源。为了促进煤的降解提高生物气产率，国内外学者尝试了各种预处理方法，如微生物预处理、外加电场强化、过氧化氢氧化预处理、超临界二氧化碳萃取、氢氧化钠预处理、硝酸氧化预处理等。微生物预处理中常用的白腐真菌、假单胞菌等同时也是煤的好氧微生物降解中常见的菌种。
4.重金属指的是原子量》55的金属。重金属可污染环境并通过食物链在人体中富集从而危害人体健康。我国各省区煤中均还有重金属，由重金属导致的煤系含水层的健康风险大于其他含水层、煤矸石山堆放过程中释放一定量的重金属进入土壤、煤散烧过程中造成大气的重金属污染。煤炭加工利用过程中重金属的转化排放等问题需要格外关注。细菌与真菌对金属元素的吸附作用，微生物对煤矸石中的铁、锰、镉的释放的促进作用等均表明煤降解过程中重金属的变化需要引起注意。
5.综上所述，研究煤的微生物降解可促进煤的清洁低碳利用，对于实现“双碳”目标具有重要意义，尤其是煤的好氧微生物降解，既可以作为煤的微生物气化的预处理步骤，也可以作为独立的工艺产生土壤改良剂等产品。研究煤的微生物降解过程中重金属含量的变化，进行环境污染评价及人体健康评价，对于掌握技术应用过程中可能产生的环境影响具有一定意义。
6.现有研究表面，可降解煤的微生物包括：细菌如：芽孢杆菌属如多粘类芽孢杆菌（paenibacilluspolymyxa）、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)等，链霉菌属（streptomyces）如浅黄链霉菌(streptomyces flaveolus)、沙阿霉素链霉菌(streptomyces zoamyceticu)、绿孢链霉菌(streptomyces vridosporus)、黄微绿链霉菌(streptomyces flavovirens)、西唐氏链霉菌(streptomyces setonii)、栗褐链霉菌(streptomyces badius)等，假单胞菌属如恶臭假单胞菌(pseudomonos putida)、球红假单胞菌(rhodopseudomonas spheroids)、绿脓杆菌（pseudomonas aeruginosa）等以及葡萄球菌属的金黄色葡萄球菌
（staphylococcusaureus）、棒杆菌属的牛肾盂炎棒杆菌（corynebacterium renale）、埃希氏菌属的大肠杆菌（escherichia coli）、节杆菌属（arthrobacter）、黄杆菌属（flavobacterium）等。假单胞菌（pseudomonas）能够利用硬煤中的有机组分作为其生长的唯一碳源和能量来源，硬煤出现了部分溶解现象，形成有色液体。
7.与煤降解相关的真菌从最初的云芝（polyporousversicolor）、山地卧孔菌（poriamonticolar）扩展到现在的黄孢原毛平革菌（phanerochaetechrysosporium）、念珠菌（candida sp.）、假丝酵母（candida mycoderma）、曲霉（aspergillus）、土曲霉（aspergillus terreusl）、栖土曲霉(aspergillus terricola)、白色拟青霉（simplicilliumlanosoniveum）、青霉菌（penicillium）、枯青霉(penicilliumcitrinum)、绳状青霉(penicilliumfumiculosum)、瓦克青霉(penicilliumwaksmanii)、斜卧青霉(penicilliumdecumbens)、黄绿青霉(penicilliumcitreoviridebiourge)、康氏木霉(trichoderma pseudokoningii)、绿色木霉(trichoderma viride)、镰孢霉菌/镰刀菌属（fusariumsp.）、毛霉(mucor)、褐腐菌(brownrot fungus)、云芝栓孔菌/彩绒革盖菌（trametes versicolor）、粗糙脉孢菌/红色面包霉（neurospore）、根霉菌（rhizopus）等。云芝（polyporousversicolor）和山地卧孔菌（poriamonticolar）可以将褐煤氧化成黑色液滴，生成的液滴可将smb培养基染成黑色。
8.细菌发酵两种类型，纯菌发酵研究单一真菌或细菌对煤的降解作用，混菌发酵则是研究真菌细菌组合对煤的降解作用。纯菌发酵只涉及单一菌种，作用过程清晰，是最常见的作用方式。
9.为了提高微生物对煤的降解效率，往往考虑将不同的菌种混合使用，然而对于混合的作用，目前尚无定论。
10.从上世纪80年代煤的微生物降解兴起以来，经过近40年的发展，已经有上百种与煤降解相关的微生物被分离出来，研究涵盖了褐煤、硬煤、风化煤、硝酸氧化煤等各种煤，研究表明含氧量越高、变质程度越低的煤越容易被微生物降解。煤的微生物降解的机理可概括为a碱性物质机理(alkaline substance)、b生物氧化酶(biological oxidase)、c螯合剂（chelating agent）、d表面活性剂（detergent）、e酯酶（esterase）机理。
11.碱性物质机理(alkaline substance)是微生物通过分泌氨、碱性多肽等碱性物质中和煤中的羧酸官能团实现煤的降解。生物氧化酶(biological oxidase)和酯酶（esterase）作用机理是微生物通过分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、漆酶、水解酶等，促使煤结构中的化学键断裂从而实现降解。螯合剂（chelating agent）作用机理是微生物产生的草酸铵等生物螯合剂与煤中的重金属阳离子结合破坏了金属桥键。表面活性剂（detergent）的作用是降低煤的表面张力，一般不单独发挥作用。微生物作用于煤的机理是复杂的，不论哪一种微生物作用于哪一种煤，往往是多种机理通过发挥作用。
12.如何判断煤在微生物的作用下发生了降解是实验开展的基础。一般来说可以通过肉眼或借助仪器来进行判断。
13.在固体培养基上进行煤降解时，可通过肉眼观察到降解现象。煤在微生物的作用下是否有黑色液滴（如图1中a-1至a-3）形成是最常用的判定标准，但这要求煤的降解程度高形成的液滴较大，否则不易观察，同时这种观察液滴的方式还会受到培养基表面凝结的水珠的影响造成误判。除了观察液滴，有研究表明煤被降解后产生的产物可以渗入培养基
从而把培养基染黑，因此还可以通过观察培养基是否被染黑（如图1中b-1至b-2）来判断降解现象的存在。
14.在液体培养基中，可用分光光度计测量450nm、513nm、600nm、650 nm等处的吸光度，通过含煤实验组与不含煤的实验组吸光度的对比判断煤样是否发生了降解。a450、a513、a600指示腐殖酸的生成，a650指示黄腐酸的生成。研究表明煤的微生物降解产物是酸可沉淀的，因此亦可取实验组的上清液，将ph调至2以下观察是否有大量沉淀生成来判断是否发生了降解。
15.煤的微生物降解率测定可从底物（煤）、产物两个角度考虑，常见的方法有三种。
16.第一种方法是从底物即煤的角度考虑，测量反应前后煤的质量差，计算得到煤的降解率，这种方法简单直接，因此经常被采用，但当煤粉颗粒细小时，反应后的残煤难以收集会导致结算结果存在较大误差，尤其是当煤粉被真菌菌丝吸附、包裹时（如图2所示）这种误差更大。
17.第二种方法是从产物的角度考虑，如前所述，煤的微生物降解产物是酸可沉淀的，因此可将反应后的发酵液定量收集、加酸沉淀、烘干称重，用沉淀的质量比底物煤的初始质量来衡量降解率，这种方法本质上是用产物得率来间接反应底物的降解率。
18.第三种方法也是从产物的角度考虑，煤的降解液的吸光度与煤的降解率之间存在一定的线性关系，因此可通过测量吸光度间接反应降解率。实际中应用最多的是a450。相对于前两种方法，测量吸光度仅需少量发酵液，因此更适用于实验过程的监测，用于反映实验所处的阶段。
19.上述三种方法中存在的问题是：当煤粉颗粒细小时，反应后的残煤难以收集，导致计算结果存在较大误差。此外失重法和沉淀法均要求煤的降解率达到一定要求，否则失重或沉淀的质量不足以准确定量。因此在煤的生物降解领域，降解液的a450成为主要的监测指标，依赖的主要仪器是分光光度计。由于仪器本身的限制，分光光度法要求测量结果处于0.2~0.8之间，当待测样品的吸光度高于0.8时就需要进行稀释，尤其当吸光度小于0.2时则无法准确定量，因此亟需一种新的定量方法作为补充。
20.关于降解产物，前人们从元素组成、产物结构、分子量、溶解性等方面进行了研究。元素分析表明产物的氮、氧、氢元素明显高于原煤，而碳元素含量低于原煤，说明发生了氧化水解作用。从红外光谱特征来看，产物的结构与原煤相似，产物中酚、醇、醚或酯类化合物有所增加，含甲基的结构可能减少。一般认为煤的产物的分子量较高，分子量大约在30~300kda。产物的溶解性研究表明其是碱溶酸沉淀的。
21.目前利用核磁共振谱、红外光谱、紫外可见光谱等手段证明了煤的生物降解产物与腐植酸具有高度的相似性。目前工业腐殖酸的生产主要以化学提取为主且已广泛应用于农业、畜牧业、工业和医药行业，而煤的生物降解产物的应用研究目前还主要集中在农业方面，如用来提高大豆、白菜、玉米、西红柿等作物的产量。此外，降解产物还可以用作水煤浆的添加剂、可作为具有抗氧化性和抗炎性的医药等。总之，与化学提取的腐殖酸相比，微生物溶解法得到的产品生化活性更高。
22.煤生物降解过程中重金属的变化：重金属对微生物的影响体现在两方面，既可以导致酶结构和功能的破坏，又是酶的组成成分。在适宜的浓度范围内可以作为微量元素被微生物利用，超过一定的浓度则会对微生物产生毒性，抑制其生长代谢。
23.微生物对重金属的影响也体现在两方面。一方面可促进重金属或其化合物由结合态转变为溶解态，如生物淋滤技术修复矿山土壤，生物沥浸技术处理涉重污泥、微生物浸铜等。一方面可促进重金属由溶解态转变为结合态，如自然界中存在的微生物成矿现象、生物稳定法和生物薄膜法修复土壤污染。
24.在煤的生物降解领域，重金属对微生物的影响多体现在将重金属作为微生物生长的微量元素，现有研究表明15 mg/l的fe
2
和0.005 mg/的ni
2
对煤炭生物产甲烷有促进作用。微生物对重金属的影响研究多集中在反应过程中重金属含量在底物与发酵液中的转移。现有研究预示了as、ba、co、ni和pb等微量元素在煤生物气化过程中从煤中转移到了发酵液中，导致发酵液中微量元素的质量浓度升高。煤的微生物降解过程中有zn、sr从煤中析出。微生物在酸性矿山废水的形成过程中起到了重要的作用，煤矸石中的金属离子及硫化物溶出进入水体形成了矿山酸性废水。氧化亚铁硫杆菌（acidithiobaillusferroxridans）促进了煤矸石中3种重金属的释放。
25.现有菌种对煤的降解能力有限且多以纯菌发酵为主，对煤降解液中重金属的研究较少，可能造成的人体健康风险等环境问题未知，这些问题成为制约煤的微生物转化技术工业化的瓶颈。因此，寻找新的菌种资源，探索混菌联合发酵工艺可拓展煤降解微生物资源及发酵工艺，分析煤降解液中重金属，掌握人体健康风险及环境污染等环境潜在的环境影响，可提前采取防治措施降低不利影响。


技术实现要素：

26.本发明为了解决目前菌种对煤的降解能力有限且多以纯菌发酵为主，降解效果低，降解液中重金属检测等问题，提供了一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法及其降解率检测方法和降解液环境安全性评价方法。根据煤的生物降解液中的重金属含量判定煤的降解效果。
27.本发明为解决技术问题所采用的技术方案是：一种真菌细菌联合降解低阶煤的方法，所述真菌为雅致小克银汉霉（cunninghamellaelegans）f11，细菌为芽孢杆菌属（bacillus sp.）b1；真菌细菌联合的具体方法为：f11接种入pda固体培养基，30℃恒温倒置培养5d，菌丝铺满培养基表面后备用；b1接种入lb固体培养基，30℃恒温倒置培养2d，菌落铺满平板后备用；在已灭菌的lb液体培养基中转接入已经培养好的f11和b1，30℃、150rpm下恒温振荡培养4d，然后加入灭菌的硝酸氧化煤，30℃、150rpm下继续培养，待吸光度a450稳定后即可。
28.打孔器接入f11与b1的比例为：3孔f11：1孔b1、2孔f11：2孔b1、1孔f11：3孔b1或50孔f11：1孔b1。
29.所述硝酸氧化煤为：低阶煤破碎筛分至80目-120目，80℃烘干48h；100g破碎筛分的煤样中加入体积比为1：1的硝酸水溶液150ml，室温水中进行反应，同时不断搅拌至黄烟消失后静置反应24h，用纯水清洗煤至上清液ph》6后将煤样在80℃下烘干72h。
30.一种煤的生物降解率的检测方法，利用所述真菌细菌联合降解低阶煤的方法进行煤的生物降解，分光光度计测量降解液在450nm处的吸光度a450判定煤的降解所处阶段；a450值稳定后，将煤的微生物降解液离心处理，取上清液测定其中的重金属cr、as、pb含量，通过重金属含量的高低判定煤的生物降解率。
31.测定重金属含量具体为：待菌液a450值稳定后，将共培养发酵液10000rpm下离心10min，收集上清液，按照《水质65种元素的测定电感耦合等离子体质谱法》（hj 700-2014）测上清液中cr、as、pb的含量；利用降解液吸光度a450的大小与重金属cr、as、pb的含量指标判定降解率的相对大小。
32.所述重金属含量的测定方法为原子荧光法或电感耦合等离子体质谱法icp-ms种的任意一种。
33.一种真菌细菌联合降解低阶煤的降解液环境安全性评价方法，所述降解液为所述真菌细菌联合降解低阶煤的方法所得降解液，降解液中重金属含量测定方法为所述煤的生物降解率的检测方法，将煤降解液中cr、as、pb的含量与吸光度进行相关性分析，线性拟合，利用单因子评价法，结合煤降解液中重金属的实测浓度，计算出重金属的污染指数，进而做出环境安全性评价。
34.根据国际癌症研究机构（iarc）的分类，水体中的有毒有害污染物可分为基因毒物和躯体毒物两大类，基因毒物包括放射性污染物和致癌物，躯体毒物包括非致癌化学物质[李飞星. 枯水期农村地下水污染特征及健康风险评价[d]. 兰州大学, 2017.]。重金属的中的cr、cd和as属于致癌物，pb、hg、se、mn、cu、zn、ba、mo、ni和ag为非致癌物[李飞星. 枯水期农村地下水污染特征及健康风险评价[d]. 兰州大学, 2017.][师环环，潘羽杰，曾敏，等. 雷州半岛地下水重金属来源解析及健康风险评价[j]. 环境科学, 2021, 42(09): 4246-4256.]。
[0035]
考虑水环境引起的人体健康风险时，常从致癌健康风险和非致癌健康风险两个方面考虑。目前，由美国国家科学院(nas)和美国环境保护署(us epa)发展起来的“四步法”模型是最常用的健康风险评价模型之一，被广泛应用于各种环境介质中各类污染物的健康评价研究[李鹏，张波，王玮，等. 基于“四步法”的健康风险评价研究进展[j]. 中国人口
·
资源与环境, 2016, 26(s1): 553-556]。该模型包含危害鉴定（危险源识别）、剂量—效应评估（剂量反应评估）、暴露评估和风险表征四个基本步骤[李鹏，张波，王玮，等. 基于“四步法”的健康风险评价研究进展[j]. 中国人口
·
资源与环境, 2016, 26(s1): 553-556][李凤嫣，蒋天宇，余涛，等. 环境中氟的来源及健康风险评估研究进展[j]. 岩矿测试, 2021, 40(06): 793-807]，暴露剂量的计算是致癌健康风险和非致癌健康风险评价的基础。
[0036]
通过饮水途径的暴露剂量计算公式计算公式获得某重金属的日平均暴露量：；式中：为某重金属的日平均暴露量（mg
·
kg-1
·
d-1
）；ci为某重金属的浓度（mg/l）；ir为饮水摄入量（l/d）；bw为体重(kg)；ef为暴露频率（d/a）；ed为暴露持续时间（a）；at为平均暴露时间（d）；[章艳红，唐玉红，陈俊华，等. 萍水河地表水重金属污染特征及健康风险评价[j]. 有色金属(冶炼部分), 2021, (07): 116-125][ 谢浩，梁永平，李军，等. 龙子祠泉域地下水金属元素分布特征及健康风险评价[j]. 环境科学, 2021, 42(09): 4257-4266]。
[0037]
通过饮水途径的致癌健康风险计算公式获得水体致癌健康风险：；当计算结果大于0.01时，则按高暴露量计算[章艳红，唐玉红，陈俊华，
等. 萍水河地表水重金属污染特征及健康风险评价[j]. 有色金属(冶炼部分), 2021, (07): 116-125][ 谢浩，梁永平，李军，等. 龙子祠泉域地下水金属元素分布特征及健康风险评价[j]. 环境科学, 2021, 42(09): 4257-4266]。
[0038]
通过饮水途径的非致癌健康风险计算公式获得水体非致癌健康风险：；式中：为致癌重金属元素i在饮水途径下产生的个人年均健康风险值（a-1
）；为致癌重金属元素i在饮水途径下产生的个人年均健康风险值（a-1
）；sfi为某化学致癌性金属i的致癌斜率因子（mg
·
kg-1
·
d-1
）；rfdi为某污染物ｉ在某种暴露途径下的参考剂量（mg
·
kg-1
·
d-1
）；l为人类平均寿命；[章艳红，唐玉红，陈俊华，等. 萍水河地表水重金属污染特征及健康风险评价[j]. 有色金属(冶炼部分), 2021, (07): 116-125][ 谢浩，梁永平，李军，等. 龙子祠泉域地下水金属元素分布特征及健康风险评价[j]. 环境科学, 2021, 42(09): 4257-4266]。
[0039]
总健康风险评价模型为；式中：r为总健康风险值（a-1
）；rc和rn分别为致癌物与非致癌物健康风险值（a-1
）。[章艳红，唐玉红，陈俊华，等. 萍水河地表水重金属污染特征及健康风险评价[j]. 有色金属(冶炼部分), 2021, (07): 116-125][ 谢浩，梁永平，李军，等. 龙子祠泉域地下水金属元素分布特征及健康风险评价[j]. 环境科学, 2021, 42(09): 4257-4266]。
[0040]
常用的水污染情况评价方法有单因子评价法、综合污染指数法、模糊综合评判法、主成分分析法、灰色关联系数法等,其中单因子评价方法因其简单易行，在实际中使用最为广泛。单因子评价以关注项目实际浓度除以相应的标准限值得到污染指数，当污染指数i≤1时，表明该因子含量未超标，当i＞1时说明该指标含量超标，计算公式如下：；式中，ci为i指标实测浓度；si为i指标标准限值；ii为污染指数。
[0041]
氧化程度越高的煤越容易被微生物利用。当真菌、细菌及其混合物作用于硝酸氧化煤（1:1.5）时，一个降解周期只有迅速上升，相对稳定两个阶段，真菌、细菌降解产物得率分别为58.17%、60%；当真菌、细菌作用于硝酸氧化煤（1.5:1）时一个降解周期则可分为缓慢上升、迅速上升、相对稳定三个阶段，降解产物得率分别为11%、12.5%，这说明氧化程度越高的煤越容易被微生物利用。
[0042]
降解呈现出碱性物质和螯合剂机理规律。真菌单独作用时，ph值与降解液吸光度值同步升高；细菌单独作用时，降解液的ph处于碱性范围； ph低的相应的其吸光度和产物得率也低，说明碱性物质在煤降解过程中发挥重要作用。重金属含量越高对应煤的降解率越高，说明降解过程中可能存在螯合剂作用机理。
[0043]
真菌细菌以混合的方式联合降解煤时具有相互促进的作用。以吸光度来看，混合菌降解液吸光度最高为64.36，真菌降解的吸光度为55.65，细菌降解的吸光度为59.47，混合菌吸光度比真菌高15.65%，比细菌高8.22%。以产物得率来看，混合菌降解产物得率最高为67.17%，真菌降解产物得率58.17%，细菌降解产物得率60%，混合菌比真菌提高了15.47%，比细菌提高了11.95%。由ph的变化规律可知，混合促进了碱性物质的产生，使得降解效率提高。
[0044]
两株菌混合发酵可提高硝酸氧化煤的降解效果，真菌、细菌、混合菌降解的产物得率分别为58.17%、61%、67.17%。
[0045]
真菌细菌混合后产生的碱性物质更多使得混合菌的降解效果更好。吸光度与酸沉淀产物及降解液中cr、as、pb的含量间存在强相关关系，煤降解过程中产生了螯合物作用机理。重金属mn在降解液中存在释放与利用平衡，降解过程中产生了锰过氧化物酶作用机理。
[0046]
本发明可以根据煤的生物降解液中的重金属含量判定煤的降解效果。解决了传统方法的缺点。例如失重法的缺点在于当煤粉颗粒细小时，反应后的残煤难以收集，导致计算结果存在较大误差。失重法和沉淀法均要求煤的降解率达到一定要求，否则失重或沉淀的质量不足以准确定量。分光光度法要求测量结果处于0.2~0.8之间，当待测样品的吸光度高于0.8时就需要进行稀释，尤其当吸光度小于0.2时则无法准确定量。
附图说明
[0047]
图1为煤降解后的黑色液滴以及培养基被染黑的现象；图中：a-1至a-3为煤降解后的黑色液滴；b-1至b-2为培养基被染黑；图2为煤粉被真菌菌丝包裹；图3为基于18s rdna序列的f11的系统进化树；图4为基于16s rdna序列的b1的系统进化树；图5为lb培养基中真菌、细菌及其混合物生长情况；图6为煤的真菌、细菌及其混合物降解液酸沉淀情况；图7为煤的真菌、细菌及其混合物降解液a450变化图；图8为煤的真菌、细菌及其混合物降解产物量；图9为以实验结束时的吸光度及酸沉淀产物的质量变化曲线；图10为吸光度与酸沉淀产物质量线性拟合曲线；图11为煤的真菌、细菌及其混合物降解液ph变化图；图12为真菌细菌混合物联合降解液中重金属含量；图13为吸光度值与重金属含量拟合图。
具体实施方式
[0048]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0049]
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
[0050]
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本技术中。
[0051]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
[0052]
一、菌种筛选：腐烂的木头及矿区土壤中存在大量的微生物，能较容易从其中分离降解煤相关的微生物类群。因此，本发明采集林场腐烂的木头及矿区土壤，采用生物学方法分离鉴定微生物种类，利用低阶煤做底物，通过真菌和细菌联合发酵的方式，分析比较煤样的降解率、产物特征及发酵液中重金属含量的变化，寻找煤降解相关微生物、探索真菌细菌联合发酵的调控方式，初步掌握重金属引起的环境污染及健康风险。
[0053]
1、降解煤微生物的分离鉴定：在伊侯山林场的腐烂木头及山西晋城矿区土壤用无菌装置取回后，按照微生物学分离的常规操作技术，采用孟加拉红培养基分离其中的真菌，采用lb培养基富集分离细菌，通过苯胺蓝、单宁酸、愈创木酚等显色剂辅助筛选，利用煤样进行菌体煤样的降解实验，直至获得可降解煤的微生物。利用分子生物学方法，对分离的微生物菌株进行鉴定。
[0054]
煤样：硝酸氧化煤：河南义马低阶煤，破碎筛分至80目~120目（0.125mm-0.20mm），80℃烘干48h。现有研究表明：含氧量越高、变质程度越低的煤越容易被微生物降解，因此使用硝酸、双氧水等氧化剂对煤样进行预处理，在500ml烧杯中加入煤样100g、（1 1）硝酸150ml,反应过程中将烧杯放入室温水中避免反应物溢出，同时不断搅拌至黄烟消失后静置反应24h, 往烧杯中加入纯水并搅拌，静置后弃去上清液。重复清洗煤至上清液ph》6后将煤样在80℃下烘干72h备用。
[0055]
pda培养基：市售pdb培养基干粉24g、琼脂粉25g、纯水1l；lb培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉 5g、纯水1l。
[0056]
菌种鉴定：采用上海生工细菌提取试剂盒提取细菌b1的dna，真菌提取试剂盒提取真菌f11的dna，使用16s rdna扩增通用引物27f/1492r对细菌dna进行pcr，使用18s rdna扩增通用引物ns1/ns8对真菌dna进行pcr，并将pcr产物送至北京百迈客生物科技有限公司测序。
[0057]
将测序结果提交至bcbi的genbank数据库进行blast比对，确定与已报道的微生物序列的同源性。下载相似性最高的同源序列，采用mega 6.0中的clustalw进行多序列比对，采用邻接（neighbor-joining，nj）法构建分子进化树，其中建树的检验方法（test of phylogeny）选择自助法（bootstrap method），抽样数（no. of bootstrap replications）为500。
[0058]
菌种鉴定结果：f11的18s rdna 序列构建的系统发育树如图3所示，f11与雅致小克银汉霉（cunninghamellaelegans）处于同一分支，相似度为99.45%，因此鉴定为该菌株为雅致小克银汉霉（cunninghamellaelegans）。
[0059]
根据b1的16s rdna 序列构建的系统发育树如图5所示，b1与芽孢杆菌属（bacillus sp.）处于同一分支，相似度为100%，因此鉴定b1为芽孢杆菌属（bacillus sp.）。
[0060]
二、真菌细菌混合物联合降解1、接种物培养：用接种环从保存的f11、b1斜面上刮取适量菌丝转入含有5 ml无菌水的离心管中，充分震荡离心管使菌液均匀，取200
ꢀµ
l菌液分别滴加于pda培养基、于lb固体培养基，用涂布棒均匀涂布，30℃恒温倒置培养。5d后f11菌丝铺满平板，2d后b1菌落铺满平板，作为联合降解接种的菌源使用。
[0061]
2、真菌细菌混合物联合降解：在250ml三角瓶中加入150ml lb培养基，湿热灭菌后，用打孔器分别接入4孔真菌、3孔真菌 1孔细菌、2孔真菌 2孔细菌、1孔真菌 3孔细菌、4
孔细菌、50孔真菌 1孔细菌，放入恒温振荡器在30℃、150rpm条件下恒温振荡培养4d，加入2g灭菌的硝酸氧化煤（1:1.5），放入恒温振荡器在30℃、150rpm条件下继续培养，每5天取菌液测ph、做全波长扫描。无菌对照组的培养基中不加入煤。每组实验做三个平行样。待a450稳定后，收集测量产物。
[0062]
3、共培养：在无菌条件下，待真菌长出菌丝球、细菌菌液浑浊后将预处理过的无菌煤样向各组加入2g灭菌的煤样（1:1.5ml/g），放入恒温振荡器在30℃、150rpm条件下继续培养，定期取菌液测吸光度a450。无菌对照组的培养基中不加入煤。每组实验做三个平行样。
[0063]
4、产物收集与测量：待a450稳定后，将降解液在10000 rpm下离心10min，收集上清液，按照《水质 65 种元素的测定电感耦合等离子体质谱法》（hj 700-2014）测上清液中cr、cd、as、mn、pb的含量。
[0064]
因使用了真菌降解煤且煤颗粒小，为避免收集残煤造成的误差，采用降解液酸沉淀产物得率与降解液吸光度相结合的方法衡量降解效果，用盐酸将上清液ph值调至2以下沉淀24 h，10000 rpm下离心10min，收集沉淀，在80℃下烘干48 h后称重。
[0065]
5、降解效果判定：对重金属含量进行比较，重金属含量高的实验组，其对应的煤样的降解率越高。
[0066]
三、结果与讨论1、真菌细菌混合物联合降解规律：通过液体煤降解培养基的筛选，从多种培养基中筛选出能同时作为真菌和细菌液体煤降解培养基的lb，为真菌细菌联合降解奠定了基础。
[0067]
如图5所示，接种4天后，纯真菌的实验组（4f）长出了菌丝球，菌丝球大小均匀，基本覆盖瓶底，真菌与细菌混合实验组（50f1b、3f1b、2f2b、1f3b）的培养基变浑浊，从瓶底观察未见菌丝球形成，但可见菌丝生长且呈现出真菌接种越多菌丝越多的趋势。此时加入硝酸氧化的煤粉，定时测量反应液的吸光度及ph，吸光度稳定后取降解液的上清液加酸，沉淀产生情况如图6所示，各实验组均有大量沉淀产生，无菌对照组（lb 硝酸氧化）也有少量沉淀产生。
[0068]
2、吸光度与沉淀的关系：煤的真菌、细菌及其混合物降解液a450变化如图7所示，由图7可知从最终吸光度的数值来看，从大到小依次是2f2b 硝酸氧化煤 lb（64.36）、3f1b 硝酸氧化煤 lb（61.65）、50f1b 硝酸氧化煤 lb（60.92）、1f3b 硝酸氧化煤 lb（60.59）、4b 硝酸氧化煤 lb（59.47）、4f 硝酸氧化煤 lb（55.65）、硝酸氧化煤 lb（1.82）。
[0069]
图8为煤的真菌、细菌及其混合物降解产物量，由图8可知，酸沉淀产物质量从大到小依次是2f2b 硝酸氧化煤 lb（1.38 g）、3f1b 硝酸氧化煤 lb（1.34 g）、50f1b 硝酸氧化煤 lb（1.31 g）、1f3b 硝酸氧化煤 lb（1.25 g）、4b 硝酸氧化煤 lb（1.23 g）、4f 硝酸氧化煤 lb（1.20 g）、硝酸氧化煤 lb（0.03 g）。
[0070]
实验组产物质量的减去对照（硝酸氧化煤 lb）后除以加煤质量（2 g），可得各组酸沉淀产物得率分别为2f2b 硝酸氧化煤 lb（67.17%）、3f1b 硝酸氧化煤 lb（65.17%）、50f1b 硝酸氧化煤 lb（63.67%）、1f3b 硝酸氧化煤 lb（61%）、4b 硝酸氧化煤 lb（60%）、4f 硝酸氧化煤 lb（58.17%）。
[0071]
以实验结束时的吸光度及酸沉淀产物的质量作图，结果如图9所示，吸光度与酸沉淀产物变化曲线一致，做相关性分析得相关系数为0.998，说明两者之间存在强相关性.
将吸光度与酸沉淀产物质量进行线性拟合，如图10所示，拟合度r2=0.997，说明吸光度可以指示煤的降解程度。结合吸光度及产物质量数据可知，真菌、细菌单独作用的效果均不及混合菌，说明真菌细菌以混合的方式联合降解煤时具有相互促进的作用。
[0072]
3、煤的氧化程度对降解的影响：由图7可知，实验启动时真菌实验组（4f lb 硝酸氧化煤）与细菌实验组（4b lb 硝酸氧化煤）降解液的吸光度分别为6.66、17.08，在第4天时吸光度值已基本稳定，最终真菌实验组（4f lb 硝酸氧化煤）与（4b lb 硝酸氧化煤）的最大吸光度分别为55.65、59.47，产物得率分别为58.17%、60%。
[0073]
研究表明，煤的氧化程度越高越容易被微生物利用，硝酸氧化可以提高煤中的含氧量，通过真菌、细菌对两种氧化煤即硝酸氧化煤（1.5:1）和硝酸氧化煤（1:1.5）的降解可知，除了硝酸的浓度之外，硝酸与煤的混合比例也会对煤的氧化程度产生影响。
[0074]
4、ph值对降解的影响：ph变化规律如图11所示，对照组（硝酸氧化煤 lb）的ph从5.33缓慢降低到4.46后稳定，而实验组的ph从第4天至实验结束在7.86~8.72之间的碱性范围内波动，说明真菌、细菌及其混合物在实验过程中产生了碱性物质。纯菌（4b 硝酸氧化煤 lb、4f 硝酸氧化煤 lb）作用下的ph始终略低于混合菌(50f1b 硝酸氧化煤 lb、3f1b 硝酸氧化煤 lb、2f2b 硝酸氧化煤 lb、1f3b 硝酸氧化煤 lb)，说明混合菌产生的碱性物质比纯菌多。
[0075]
结合吸光度图7可知相应的混合菌的降解率高于纯菌，真菌细菌以混合的方式联合降解煤时具有相互促进的作用，说明碱性物质在煤降解过程中发挥了重要作用。
[0076]
实验启动时，真菌实验组（4f 硝酸氧化煤 lb）的ph与其他实验组相差约1个ph单位，而吸光度则约为其他实验组的1/3，也说明了碱性物质对煤降解产生了重要影响。
[0077]
5、重金属含量分析：煤的真菌细菌混合物降解液中的重金属含量如图12所示，cd在降解液中未检出，cr、as、pb 元素在所有实验组（50f1b 硝酸氧化煤 lb、3f1b 硝酸氧化煤 lb、2f2b 硝酸氧化煤 lb、1f3b 硝酸氧化煤 lb、4b 硝酸氧化煤 lb、4f 硝酸氧化煤 lb）降解液中含量均高于无菌对照组（硝酸氧化煤 lb），说明真菌f11、细菌b1及其混合物在降解煤的同时具有促进煤中的cr、as、mn、pb向降解液中迁移的作用。
[0078]
纯菌实验组（4f 硝酸氧化煤 lb、4b 硝酸氧化煤 lb）降解液中的cr、as、mn、pb含量均低于混合菌（50f1b 硝酸氧化煤 lb、3f1b 硝酸氧化煤 lb、2f2b 硝酸氧化煤 lb、1f3b 硝酸氧化煤 lb），说明真菌f11与细菌b1的混合物在重金属从煤向降解液的迁移中具有相互促进的作用。重金属cr、as、mn、pb在无菌对照组（硝酸氧化煤 lb）中均检出，说明即使无微生物的降解作用，也会有一定量的重金属从硝酸氧化煤中迁移到降解液中。这是因为强酸氧化处理过的煤即使无生物或化学试剂的作用也可在水中部分溶解。cr、as、pb元素在降解液中含量高于无菌对照组，说明真菌f11、细菌b1及其混合物在降解煤的同时具有促进煤中的cr、as、pb向发酵液中迁移的作用。
[0079]
将煤降解液中cr、as、pb的含量与吸光度（第16天的吸光度）进行相关性分析可知相关系数分别为0.857、0.821、0.873，说明两者具有强相关性，进行线性拟合后如图13中（a、b、c）所示，拟合度（r2）分别为0.735、0.610、0.763，即煤降解液中的重金属含量越高，相应的煤降解率也越高。这是因为煤分子结构中络合着大量的金属元素，微生物可以通过螯合煤中的金属元素实现煤的降解，煤中的金属元素被去除后煤更容易被微生物利用，从而导致煤的分子量降低。
[0080]
煤分子结构中络合着大量的金属元素，微生物可以通过螯合煤中的金属元素实现煤的降解，现有研究证实了煤中的金属元素被去除后，煤更容易被微生物利用，从而导致煤的分子量降低。研究表明，微生物降解煤的机理主要包括碱性物质作用机理、酶作用机理、螯合剂和表面活性剂作用机理，其中只有螯合剂作用机理是通过生物分泌的草酸铵等螯合去除煤中的重金属离子从而促进煤的降解，结合降解液中重金属与吸光度的相关关系可知，真菌、细菌及其混合物通过螯合剂作用机理促进了煤的降解。
[0081]
与cr、as、pb元素不同的是，mn元素在无菌对照组中含量高于细菌实验组，与吸光度间相关关系弱，线性拟合后如图13(d)所示，拟合度（r2）仅为0.3。对照组中含有锰元素说明煤中含有该元素。一方面由上文分析可知纯菌实验组的煤发生了降解且存在着螯合作用机理，因此煤中的mn元素会转移至降解液中导致mn元素的含量的升高。另一方面，微生物分离过程中发现真菌f11和细菌b1均可使苯胺蓝平板褪色，苯胺蓝可以指示锰过氧化物酶的存在，说明两株菌均可产生锰过氧化物酶。研究表明锰过氧化物酶的反应需要mn的参与，因此降解液中的锰因参与反应而导致含量降低。综上所述，在煤的降解过程中，因螯合作用及锰过氧化酶的作用导致mn元素存在着释放与利用平衡的过程。
[0082]
对无菌对照组与细菌、真菌实验组的mn元素含量数据进行方差分析，由表1可知p》0.05，对照组与实验组之间无显著差别。综上所述，在煤的降解过程中，因螯合作用及锰过氧化酶的作用导致mn元素存在着释放与利用平衡的过程。
[0083]
表1：无菌对照组与纯菌实验组mn元素含量方差分析如表2所示，混合菌实验组的mn元素含量高于无菌对照组且与之存在显著差异，说明真菌f11与细菌b11混合后锰元素的释放大于利用，因此在降解液中的含量升高。
[0084]
表2：无菌对照组与混菌实验组mn元素含量方差分析6、水污染评价：水污染情况单因子评价时，取地表水环境质量标准（gb3838-2002）中三类水及补充项目的标准限值，污染指数计算公式参考文献[李飞星，枯水期农村地下水污染特征及健康风险评价，兰州大学，2017]。当污染指数i≤1时，表明该因子含量未超标，当i＞1时说明该指标含量超标，计算公式如下：；式中，ci为i指标实测浓度；si为i指标标准限值；ii为污染指数。
[0085]
直接饮用和皮肤接触是水体中金属元素进入人体的2种重要途径，经饮水途径的健康风险比其他两种（呼吸途径和皮肤接触途径）高出2~3个数量级，因此本发明主要考虑饮水途径的健康风险，计算根据公式参考文献[谢浩等，龙子祠泉域地下水金属元素分布特征及健康风险评价[j]. 环境科学, 2021, 42(09): 4257-4266]、[章艳红等，萍水河地表
水重金属污染特征及健康风险评价[j]. 有色金属(冶炼部分), 2021, (07): 116-125]，其中化学物质的rfd和sf值参考文献[武俐等. 生物成气中离子和微量元素变化特征及健康风险评价[j]. 煤炭学报, 2021, 46(03): 994-1002]、李飞星，枯水期农村地下水污染特征及健康风险评价，兰州大学，2017]、[周巾枚，蒋忠诚，徐光黎，等. 铁矿周边地下水金属元素分布及健康风险评价[j]. 中国环境科学, 2019, 39(05): 1934-1944]、[李鹏. 煤生物成气过程中有机物及重金属变化特征及其潜在环境风险[d]. 河南理工大学, 2018]。
[0086]
模型参数rfd和sf值具体见表3。平均寿命l取70a，日均饮水量ir取2.2l/d,暴露频率ef取365d/a，暴露持续时间ed对于非致癌物质取35a,对于致癌物质取70a,人均体重bw取60kg,为平均暴露时间at,对于非致癌物质取12775d,对于致癌物质取25550d。
[0087]
表 3模型参数rfd和sf值7、重金属环境污染评价：重金属cr、as、mn、pb在降解液中的具体含量如表4所示，根据降解液中重金属的含量及地表水环境质量标准（gb3838-2002）中三类水及补充项目的标准限值，由单因子评价模型计算得到污染指数，具体数据见表5，as、mn、pb在各组降解液中均未超标，cr在混合菌降解液中超标或污染指数接近1，cr在混合菌1f3b、2f2b、50f1b中超标，在混合菌3f1b中污染指数为0.97.因此进行煤的真菌细菌混合物降解时，需要注意cr可能引起的污染。
[0088]
表4 真菌细菌混合物联合降解液的评价指标及含量表 5 真菌细菌混合物联合降解液的污染指数8、人体健康风险评价：人体健康评价及污染评价：利用美国环境保护署(us epa)推荐的人体健康风险评价模型和单因子评价法，结合煤降解液中重金属的实测浓度，计算出重金属的致癌和非致癌健康风险值、污染指数，进而做出健康风险及污染评价。
[0089]
通过饮水途径的暴露剂量计算公式获得某重金属的日平均暴露量：
；式中：为某重金属的日平均暴露量（mg
·
kg-1
·
d-1
）；ci为某重金属的浓度（mg/l）；ir为饮水摄入量（l/d）；bw为体重(kg)；ef为暴露频率（d/a）；ed为暴露持续时间（a）；at为平均暴露时间（d）；通过饮水途径的致癌健康风险计算公式获得水体致癌健康风险：；当计算结果大于0.01时，则按高暴露量计算：；通过饮水途径的非致癌健康风险计算公式获得水体非致癌健康风险：；式中：为致癌重金属元素i在饮水途径下产生的个人年均健康风险值（a-1
）；为致癌重金属元素i在饮水途径下产生的个人年均健康风险值（a-1
）；sfi为某化学致癌性金属i的致癌斜率因子（mg
·
kg-1
·
d-1
）；rfdi为某污染物ｉ在某种暴露途径下的参考剂量（mg
·
kg-1
·
d-1
）；l为人类平均寿命；总健康风险评价模型为；式中：r为总健康风险值（a-1
）；rc和rn分别为致癌物与非致癌物健康风险值（a-1
）；真菌细菌混合物降解液重金属引起的个人年均风险值见表6，mn、pb等引起的非致癌健康风险值分布在9.85
×
10-12
~5.21
×
10-10
，小于非致癌健康风险阈值1,处于可接受水平。单项重金属pb非致癌健康风险大于mn。
[0090]
表6：真菌细菌混合物降解液重金属引起的个人年均风险值（a-1
）cr造成的致癌健康风险处于10-3
~10-4
之间，as造成的致癌健康风险处于10-6
,cr、as在各组中的致癌健康风险均超过了瑞典环境环保局、荷兰建设与环境部和英国皇家协会推荐的最大可接受风险水平1
×
10-6
，cr的致癌健康风险还高于国际辐射防护委员(icrp)会推荐的最大可接受风险水平5
×
10-5
，也高于美国环境保护署(usepa)推荐的最大可接受风险水平1
×
10-4
。cr造成的致癌健康风险比as高2~3个数量级，其中混合菌降解液中cr的致癌健康风险比as的致癌健康风险高3个数量级，纯菌降解液中cr的致癌健康风险比as高2个数量级。
[0091]
各组的致癌总风险比非致癌总风险高6~7个数量级，说明重金属引起的健康风险主要来源于致癌健康风险，混合菌降解液的致癌健康风险比纯菌降解液致癌健康风险高1个数量级。即使无微生物作用，煤与lb培养基的混合液也会产生致癌健康风险。
[0092]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。