一种用于减少金线莲继代的培养基及金线莲培养方法与流程

1.本发明属于金线莲栽培技术领域，具体涉及一种用于减少金线莲继代的培养基及金线莲培养方法。


背景技术：

2.继代培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，因为营养物和水分枯竭等问题，需要将组织转移到新培养基上进行培养；主要用于植物的快速繁殖；但是由于在进行多次组培后，细胞常常因为在培养过程中，分化程度越高，导致细胞的全能性丧失越严重。
3.有些情况下，为了研究，不仅需要扩大金线莲的规模，而且需要金线莲进行长期的种源保存；但是目前的金线莲的培养方法和培养基容易导致金线莲的生长速度过快，导致很难对金线莲进行长久的保存；虽然专利号为2019102805544的专利提供了一种金线莲种质资源的离体保存方法，虽然该方法对于金线莲的生长速度起到了一定的延缓，但是金线莲的健康状况和延缓时间仍然不是很理想；此外，对比专利中的培养基成分较为复杂且需要自己配置，培养基制作效率较低且较为麻烦。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种用于减少金线莲继代的培养基及金线莲培养方法，旨在解决现有技术中的金线莲生长的延缓方法很难同时兼顾金线莲生长状况健康且生长缓慢的问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
6.第一方面，本发明提供了一种用于减少金线莲继代的培养基，由1/2ms培养基和甘露醇混合而成，所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为20-30g/l。
7.进一步改进的方案：所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为20g/l。
8.进一步改进的方案：所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为30g/l。
9.基于上述方案，当所述甘露醇所占比例为30g/l时，甘露醇的生长最为健康，且生长最为缓慢。
10.进一步改进的方案：所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为25g/l。
11.进一步改进的方案：所述1/2ms培养基按照质量份数包括950质量份的硝酸钾、85质量份的硝酸二氢钾、220质量份的氯化钙、6.2质量份的硼酸、8.6质量份的硫酸锌、0.025质量份的硫酸铜、27.8质量份的硫酸亚铁、2质量份的甘氨酸、0.5质量份的盐酸吡哆醇、37.5质量份的乙二胺四乙酸二钠、825质量份的硝酸铵、185质量份的硫酸镁、0.83质量份的碘化钾、22.3质量份的钼酸钠、0.025质量份的氯化钴、100质量份的肌醇、0.1质量份的盐酸硫胺素和0.5质量份的烟酸；所述1/2ms培养基ph值为5.7
±
0.1。
12.第二方面，本发明提供了一种金线莲培养方法，包括以下步骤：
13.s1、选取无菌金线莲组培苗；
14.s2、分段：从无菌金线莲组培苗的茎部截取上段、中段和下段作为茎段；
15.s3、将茎段作为外植体平铺在第一方面任一方案所述的一种用于减少金线莲继代
的培养基上；
16.s4、在培养温度为20-30℃，光强度为2500～3500lx，光照时间为14h/d的条件下培养。
17.进一步改进的方案：在步骤2中，所述茎段长度为1.3-1.7cm且均带有节间。
18.进一步改进的方案：在步骤s4中，在培养温度为25℃，光强度为3000lx，光照时间为14h/d的条件下培养。
19.本发明的有益效果为：
20.本发明中的用于减少金线莲继代的培养基，由1/2ms培养基和甘露醇混合而成，所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为20-30g/l；通过本发明的培养基培养的金线莲，相对于现有普通培养基的4个月转接一次，延缓至12-14个月转接一次，延缓了继代的时间，提高了保存时间。
21.通过实验证明，相对于现有的可以延缓金线莲生长的方法培养的金线莲表现为黄色，采用本发明培养基培养出的金线莲的叶片颜色表现为绿色；较常规培养基和现有的可以延缓金线莲生长的方法培养的金线莲，采用本发明培养基培养出的金线莲的叶片数量最多。
22.此外，本发明中的培养基的1/2ms培养基可以直接从市场购买，配置方便，培养基制作成本较低。
23.综上所述，采用本发明中的培养基和培养方法，不仅增长了保存时间，而且金线莲的健康状况明显高于现有的培养基；此外，因在种源保存过程中，培养基配置成本低，且继代次数少，节约了种源保存成本。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简要介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关附图。
25.图1是本发明中栽培在不同培养基中整瓶金线莲的生长对比图。
26.图2是本发明中栽培在不同培养基中金线莲的生长对比图。
27.图3是本发明中栽培在不同培养基中单株金线莲的生长对比图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
29.实施例一：
30.本实施例提供了一种用于减少金线莲继代的培养基，由1/2ms培养基和甘露醇混合而成，所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为20-30g/l。
31.其中，所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为20g/l时，是一种较佳的比
例，相对现有培养基同期的金线莲植株，加入20g/l甘露醇较矮，生长时间相对现有的培养基得到了延缓，且加入20g/l甘露醇后的培养的金线莲呈绿色，且叶片数多，生长较为健康。
32.当所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例为30g/l，为最佳的一种比例，相对现有培养基同期的金线莲植株，加入20g/l甘露醇最矮，生长时间相对现有的培养基得到了延缓，且加入20g/l甘露醇后的培养的金线莲呈绿色，且叶片数最多，生长最为健康。
33.此外，所述甘露醇在混合后的培养基中所占的比例还可以为21g/l、22g/l、23g/l、24g/l、25g/l、26g/l、27g/l、28g/l或29g/l等。
34.此外，本发明中的1/2ms培养基采用的为现有的1/2ms培养基，可以由市场购入，也可以自行配置，其中一种1/2ms培养基按照质量份数包括950质量份的硝酸钾、85质量份的硝酸二氢钾、220质量份的氯化钙、6.2质量份的硼酸、8.6质量份的硫酸锌、0.025质量份的硫酸铜、27.8质量份的硫酸亚铁、2质量份的甘氨酸、0.5质量份的盐酸吡哆醇、37.5质量份的乙二胺四乙酸二钠、825质量份的硝酸铵、185质量份的硫酸镁、0.83质量份的碘化钾、22.3质量份的钼酸钠、0.025质量份的氯化钴、100质量份的肌醇、0.1质量份的盐酸硫胺素和0.5质量份的烟酸；所述1/2ms培养基ph值为5.7
±
0.1；具体的，所述各成分在培养基中含量为：950mg/l的硝酸钾、85mg/l的硝酸二氢钾、220mg/l的氯化钙、6.2mg/l的硼酸、8.6mg/l的硫酸锌、0.025mg/l的硫酸铜、27.8mg/l的硫酸亚铁、2mg/l的甘氨酸、0.5mg/l的盐酸吡哆醇、37.5mg/l的乙二胺四乙酸二钠、825mg/l的硝酸铵、185mg/l的硫酸镁、0.83mg/l的碘化钾、22.3mg/l的钼酸钠、0.025mg/l的氯化钴、100mg/l的肌醇、0.1mg/l的盐酸硫胺素和0.5mg/l的烟酸。
35.实施例二：
36.本实施例提供了一种金线莲培养方法，包括以下步骤：
37.s1、选取无菌金线莲组培苗；采用无菌金线莲，可以节省消毒环节
38.s2、分段：从无菌金线莲组培苗的茎部截取上段、中段和下段作为茎段；其中，上段要包含茎尖，下段为匍匐茎段；切段在无菌环境下进行。
39.s3、将茎段作为外植体平铺在第一方面任一方案所述的一种用于减少金线莲继代的培养基上；
40.s4、在培养温度为20-30℃，光强度为2500～35001x，光照时间为14h/d的条件下培养。
41.在步骤2中，所述茎段长度为1.3-1.7cm且均带有节间；具体的，所述茎段长度选取在1.5cm左右。
42.在步骤s4中，在培养温度为25℃，光强度为3000lx，光照时间为14h/d的条件下培养。
43.下面结合试验对本发明做进一步说明：
44.1.1试验设计
45.试验设置了在1/2ms培养基的基础上，添加不同浓度的蔗糖10g/l、20g/l或30g/l，添加不同浓度的甘露醇10g/l、20g/l或30g/l，且以1/2ms培养基为对照组(ck)，此外，还设置专利号为2019102805544的对比专利中金线莲种质资源的离体保存方法作为对比组，共17个试验组，具体如表1；每个试验组设置10瓶；2021年12月7日接种。
46.表1培养基配比试验方案
47.试验编号培养基配比t1(ck)1/2ms培养基t21/2ms培养基 蔗糖10g/lt31/2ms培养基 蔗糖20g/lt41/2ms培养基 蔗糖30g/lt51/2ms培养基 甘露醇10g/lt61/2ms培养基 甘露醇10g/l 蔗糖10g/lt71/2ms培养基 甘露醇10g/l 蔗糖20g/lt81/2ms培养基 甘露醇10g/l 蔗糖30g/lt91/2ms培养基 甘露醇20g/lt101/2ms培养基 甘露醇20g/l 蔗糖10g/lt111/2ms培养基 甘露醇20g/l 蔗糖20g/lt121/2ms培养基 甘露醇20g/l 蔗糖30g/lt131/2ms培养基 甘露醇s0g/lt141/2ms培养基 甘露醇30g/l 蔗糖10g/lt151/2ms培养基 甘露醇30g/l 蔗糖20g/lt161/2ms培养基 甘露醇30g/l 蔗糖30g/lt17参照专利号为2019102805544的对比专利
48.1.2培养方法
49.s1、选取无菌金线莲组培苗；
50.s2、分段：从无菌金线莲组培苗的茎部截取上段、中段和下段作为茎段；所述茎段长度选取在1.5cm左右；
51.s3、将茎段作为外植体平铺在各试验组培养基上；
52.s4、在培养温度为25℃，光强度为2500～3500lx，光照时间为14h/d的条件下培养。
53.1.3试验结果与分析
54.2022年6月6日记录金线莲无菌苗对照材料和限制保存材料的生长和存活情况：存活率、叶片颜色、平均株高、叶片数等指标；实验结果如表2所示；t2处理株高最大，t13叶片数最多；t13处理株高最小，t16叶片数最少。
55.表2不同培养基配比对金线莲组培苗生长状况的影响
56.处理编号接种株数存活株数叶片颜色株高叶片数t1(ck)3131绿4.05
±
0.714.45
±
0.51t23333绿5.89
±
1.263.90
±
0.60t33030黄5.35
±
1.024.60
±
0.56t42830黄4.57
±
0.714.30
±
0.53t52828绿4.25
±
0.894.25
±
0.44t62828黄3.88
±
0.704.14
±
0.52t72929黄4.36
±
0.894.14
±
0.69t83131黄4.48
±
1.004.06
±
0.85t92929绿3.61
±
0.674.21
±
0.56
t103333黄3.95
±
0.744.24
±
0.50t113030偏绿4.54
±
0.854.07
±
0.52t123333黄4.01
±
0.853.88
±
0.70t132929绿3.31
±
0.735.00
±
0.80t143131偏绿3.75
±
0.654.32
±
0.65t153232偏黄3.84
±
0.883.84
±
0.77t162929黄4.12
±
1.213.79
±
0.77t17(对比专利)3131黄4.38
±
1.114.97
±
1.08
57.通过表2可以看出，在t13处理下，金线莲株高最小，限制生长效果好；此外，t13组处理下，金线莲叶片为绿色，叶片数最多，说明植株虽然小，但是比较健康，如果生产需要，可以较好的恢复；适宜用作限制金线莲生长的培养基，减少继代，节约种源保存成本。
58.图1为采用不同培养基，金线莲无菌苗在瓶中生长情况对比图；从左至右依次为金华市农科院所采用的现有正常培养基，1/2ms培养基(t1)、1/2ms培养基 甘露醇10g/l(t5)，1/2ms培养基 甘露醇20g/l(t9)，1/2ms培养基 甘露醇20g/l(t13)，对比专利(t17)。
59.图2为栽培在不同培养基中金线莲的生长对比图；从右上角开始按照逆时针，依次为金华市农科院所采用的现有正常培养基，1/2ms培养基(t1)、1/2ms培养基 甘露醇10g/l(t5)，1/2ms培养基 甘露醇20g/l(t9)，1/2ms培养基 甘露醇20g/l(t13)，对比专利(t17)。
60.图3为栽培在不同培养基中单株金线莲的生长对比图；为栽培在不同培养基中金线莲的生长对比图；从左至右依次为金华市农科院所采用的现有正常培养基，1/2ms培养基(t1)、1/2ms培养基 甘露醇10g/l(t5)，1/2ms培养基 甘露醇20g/l(t9)，1/2ms培养基 甘露醇20g/l(t13)，对比专利(t17)。
61.参阅图1至图3，与对照组t1(ck)相比，在t13处理下，通过株高可以看出金线莲生长速度减缓明显，叶片数较多，说明同期本发明中t13组金线莲植株叶片数多，说明t13的培养基不仅可以延缓生长且可以使得金线莲更加健康。
62.参阅图1至图3，与t17(对比专利)相比，在t13处理下，通过株高可以看出金线莲生长速度减缓明显，叶片数稍多，叶片更绿；说明同期本发明中t13组金线莲植株叶片颜色更绿且叶片数多，说明t13的培养基相对对比专利不仅可以延缓生长且可以使得金线莲更加健康，移栽存活率更高。
63.此外，与t8(加有蔗糖)相比，在t13处理下，通过株高可以看出金线莲生长速度减缓明显，叶片数较多，叶片更绿；说明同期本发明中t13组金线莲植株叶片颜色更绿且叶片数多，说明t13的培养基相对添加蔗糖组t8不仅可以延缓生长且可以使得金线莲更加健康，移栽存活率更高。
64.1.3结论
65.在t13处理下，金线莲株高最小，限制生长效果好；此外，t13组处理下，金线莲叶片呈绿色，叶片数最多，说明植株虽然小，但是比较健康，如果生产需要，可以较好的恢复；适宜用作限制金线莲生长的培养基，减少继代，节约种源保存成本。
66.本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。