一种含植物外泌体治疗关节炎的组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药保健品领域。具体地，本发明涉及一种含植物来源外泌体的治疗关节炎的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.骨关节炎又叫做退行性关节炎，发病原因与关节组织中软骨细胞数量减少、细胞凋亡增加和细胞外基质代谢紊乱有关，以关节软骨原发性或是继发性退行性病变以及骨质增生为特征。由于软骨内无血管和神经，软骨细胞数少且增殖能力有限，较大的关节软骨缺损往往难以自愈。关节炎主要侵害膝关节软骨、骨和滑膜组织。病发期间患者会出现关节疼痛、肿胀、变形，严重时可以出现膝关节畸形。流行病学数据显示，国内的骨关节炎发病率约为10％，大约有1.5亿的患病人群，其中约50％为膝骨关节炎患者。随着世界范围内人口老龄化，骨关节炎的发病率逐年增高。
3.目前临床上治疗骨关节炎的方法，主要分为非手术治疗和手术治疗两类。非手术治疗以口服非甾体类抗炎药、膝关节腔内注射药物和康复锻炼为主，大多数治疗骨关节炎的药物只能缓解关节疼痛，关节损伤尚得不到根本改善。手术治疗以膝关节腔持续冲洗与清理术、全膝关节置换术、膝关节单踝置换术等为主。应用最广泛的是微骨折术。但是微骨折术对较大的缺损修复效果有限，远期效果不佳。
4.间充质干细胞(mscs)是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，mscs已成为细胞替代治疗中的主要选择细胞。被应用于多种疾病的治疗。但是直接使用单一的间充质干细胞，关节腔注射治疗骨关节炎，发现单一细胞容易流失，局部微环境也影响细胞发挥作用。
5.外泌体是由细胞产生的囊泡结构，具有细胞间信息流和物质运输等重要功能。外泌体粒径介于30nm到150nm之间，具有与细胞膜类似的脂质结构，容易透过身体的各种屏障，且磷脂双分子层结构，使外泌体具有低免疫原性，能够于生物体内进行长循环。以上特点使外泌体成为被广泛关注的天然治疗载体。人体中几乎所有细胞都能分泌外泌体，在多种生物体液中包括血液、乳汁、 唾液以及植物体内都存在外泌体。外泌体携带母体细胞mrna、mirna、蛋白质、磷脂等物质，可以与受体融合，影响受体细胞的功能，外泌体功能取决于其来源的细胞类型，具有抑制炎症、免疫调节、血管生成、参与组织修复的功能。在组织再生、创伤医学等方面具有良好的应用前景。与干细胞相比，外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，利用外泌体的分离方法从可食用植物中提取得到类外泌体结构，其形貌、组成和功能与外泌体有一定的相似性。相关实验证明，植物来源类外泌体进入哺乳动物体内后，参与相关信号通路并可完成跨界调控，发挥类似原植物的治疗保健功能。成为“无细胞的细胞治疗”工具。但目前植物来源外泌体技术尚不成熟，探索外泌体提取、保存、使用新技术以及深层药理机制，仍是紧迫艰巨的重大课题。


技术实现要素：

6.本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种用于治疗骨关节炎的植物来源外泌体组合物及其制备方法，可有效稳定的治疗骨关节炎。
7.本发明的目的通过以下技术方案来实现：提供一种含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物，该组合物是由植物细胞来源的外泌体，功能活性成分和辅料制成的口服制剂；在优选的实施方式中，所述的植物来源外泌体是黄精外泌体，土茯苓外泌体；在优选的实施方式中，所述黄精外泌体为黄精外泌体冻干粉，所述的土茯苓外泌体为土茯苓外泌体冻干粉；在优选的实施方式中，所述的功能活性成分选自牛骨胶原蛋白肽、透明质酸钠、壳寡糖、西兰花种子提取物、s-腺苷蛋氨酸、维生素c，乳酸钙；所述的辅料包括但不限于玉米淀粉、异麦芽酮糖醇、乳糖、硬脂酸镁、薄膜包衣剂、麦芽糊精中的一种或多种；所述的原料、功能活性成分、辅料符合相关国家标准、行业标准或企业标准；所提供的含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物，按各组分的重量份：黄精外泌体5-20份、土茯苓外泌体5-20份、牛骨胶原蛋白肽25-80份、透明质酸钠1-3份、壳寡糖65-180份、西兰花种子提取物88-190份、s-腺苷蛋氨酸25-75份、维生素c3-10份、玉米淀粉216-51份、异麦芽酮糖醇227-51份、乳酸钙30-70份。
8.优选的，含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物，按各组分的重量份：黄精外泌体8-12份、土茯苓外泌体8-12份、牛骨胶原蛋白肽45-55份、透明质酸钠1-3份、壳寡糖120-140份、西兰花种子提取物160-180份、s-腺苷蛋氨酸45-55份、维生素c 4-6份、玉米淀粉120-150份、异麦芽酮糖醇150-160份、乳酸钙35-45份；所提供的含植物来源外泌体的组合物用途，是在制备骨科疾病的产品中应用；具体的，是在制备骨关节炎，风湿、类风湿关节炎的产品中应用；所提供的含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物是口服剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂。
9.所提供的含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物的制备方法包含以下步骤：s1.按配方分别称量黄精外泌体、土茯苓外泌体、功效活性成分和辅料，加入混合机中混合30min，得到混合物；s2.向混合物中加入75％乙醇制软材，上制粒机制粒，得到湿颗粒；s3.将湿颗粒置60℃烘箱中干燥，使水分≤5%，得干燥颗粒，然后10-20目整粒；s4.整粒后物料添加或不添加硬脂酸镁，总混25-35min；s5.压片、颗粒包装。
10.本发明提供植物外泌体冻干粉的制备方法，包含以下步骤：s1.取一定量的新鲜植物，去除根须、杂质，用生活饮用水冲洗干净，再用纯化水洗三次，最后用超纯水洗三次，每次冲洗时间3-5min；s2.将洗净的新鲜植物切成块，分别置榨汁机混合粉碎，连续榨三次后，过滤，取汁液，得植物原汁；s3.将植物原汁分别于4℃ 差速离心，第一次离心力1000g，离心10min，得上清液
a；然后将上清液a以3000g，离心20min，得上清液b；然后将上清液b以10000g离心40min，去除杂质，获得上清液c；最后将上清液c于150000g下超高速离心120min，取沉淀，用pbs（磷酸盐缓冲液）洗涤三次，即各得植物外泌体提取液(上清液a-c为不同步骤收集的上清液）；s4.将步骤s3得到的植物外泌体提取液，分别与甘露醇复配，形成均一溶液，并将溶液注入模具中，预冻0.5-3h，然后转入冻干机中，在0.01-10mbar，-60℃-4℃的条件下冷冻干燥5-10h，即分别得到植物外泌体冻干粉；在优选的实施方式中，所述的植物外泌体冻干粉为黄精外泌体冻干粉，土茯苓外泌体冻干粉。
11.所述的植物外泌体冻干粉检测，通过纳米颗粒跟踪分析仪（particle metrix gmbh），测定植物外泌体粒的粒径分布及密度，根据峰的分布初步判断其纯度，峰数量越少纯度越高；通过每ml外泌体的数量，判断外泌体粒的得率，数量越大得率越大。测得植物外泌体冻干粉粒径分别为135.2-137.7nm，纯度为85.1-90.3%，每ml外泌体数量分别为5.1-5.3e 6。
12.相对于现有技术，本发明的有益效果在于：1、为关节炎治疗提供稳定来源的外泌体，所述外泌体的治疗效果更稳定。本植物外泌体的囊泡，其粒径约40-150nm，与文献报道基本一致，纯度85.1-90.3%。可携带多种生物活性分子，传递细胞信号，参与组织修复，产品经实验，外泌体发挥了优异作用；2、本发明植物外泌体能调控炎症反应，抑制或降低炎性因子的表达，从而达到很好的抗炎效果；3、本发明外泌体与特定功效原料的组合使用，可显著改善和缓解骨关节炎相关症状，如增强的握力，恢复其运动功能；增强关节区的骨密度，进而增强骨骼结构的机械能力，改善骨关节炎的症状；减轻关节区软骨损伤；有效促进软骨细胞的生长及分化，缓解软组织的破坏和损伤。因此，本发明可以有效地改善或治疗骨关节炎，具有明显的改善和治疗骨关节炎作用；4、从补益肾功能入手提高骨病的治疗效果，中医理论认为肾主骨生髓。黄精是传统的补肾药物，黄精根茎含有多种营养成分，包括糖分、脂肪、蛋白质、淀粉、胡萝卜素、维生素等，可用于脾胃虚弱、体倦乏力、精血不足、内热消渴等。黄精外泌体，土茯苓外泌含有来源细胞基因、蛋白核磷脂等成分，通过强肾益髓固本，达到治疗关节炎目的，具有广泛的应用前景；
具体实施方式
13.结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员，在没有做出创造性劳动前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.实施例一：一种含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物，按各组分的重量份：黄精外泌体5-20份、土茯苓外泌体5-20份、牛骨胶原蛋白肽25-80份、透明质酸钠1-3份、壳寡糖65-180份、西兰花种子提取物88-190份、s-腺苷蛋氨酸25-75份、维生素c3-10
份、玉米淀粉216-51份、异麦芽酮糖醇227-51份、乳酸钙30-70份。
15.组合物的制备方法：s1.将黄精外泌体、土茯苓外泌体、功效活性成分和辅料加入混合机中混合30min，得到原料混合物；s2.向原料混合物中加入75％乙醇制软材，制粒机制粒，得到湿颗粒；s3.将湿颗粒置60℃烘箱中干燥，使水分≤5%，得干燥颗粒，然后10-20目整粒；s4.在整粒外加或不添加硬脂酸镁，总混25-35min；s5.压片、颗粒包装。
16.实施例二：黄精外泌体冻干粉的制备方法，包含以下步骤：s1.取新鲜黄精，去除根须、杂质，用生活饮用水冲洗干净，再用纯化水洗三次，最后用超纯水洗三次，每次冲洗时间3-5min；s2.将洗净的黄精切成块，榨汁机混合粉碎，连续榨三次后，过滤，取汁液， 得黄精原汁；s3.将黄精原汁于4℃差速离心，第一次离心力1000g，离心10min，得上清液a；然后将上清液a以3000g，离心20min，得上清液b；然后将上清液b以10000g离心40min，去除杂质，获得上清液c，最后将上清液c于150000g下超高速离心120min，取沉淀，用pbs洗涤三次，即得黄精外泌体提取液；s4.将步骤s3得到的黄精外泌体提取液，与甘露醇复配，形成均一溶液，并将溶液注入模具中，预冻0.5-3h，然后转入冻干机中，在0.01-10mbar，-60℃-4℃的条件下冷冻干燥5-10h，即得到黄精外泌体冻干粉。
17.实施例三：土茯苓外泌体冻干粉的制备方法包含以下步骤：s1.取新鲜土茯苓，去除根须、杂质，用生活饮用水冲洗干净，再用纯化水洗三次，最后用超纯水洗三次，每次冲洗时间3-5min；s2.将洗净的土茯苓切成块，榨汁机混合粉碎，连续榨三次后，过滤，取汁液，得土茯苓原汁；s3、将土茯苓原汁于4℃ 差速离心，第一次离心力1000g，离心10min，得上清液a；然后将上清液a以3000g，离心20min，得上清液b；然后将上清液b以10000g离心40min，去除杂质，获得上清液c，最后将上清液c于150000g下超高速离心120min，取沉淀，用pbs洗涤三次，即得土茯苓外泌体提取液；s4.将步骤s3得到的土茯苓外泌体提取液，与甘露醇复配，形成均一溶液，并将溶液注入模具中，预冻0.5-3h，然后转入冻干机中，在0.01-10mbar，-60℃-4℃的条件下冷冻干燥5-10h，即得到土茯苓外泌体冻干粉。
18.实施例四：含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物，片剂制备方法：配方组成：黄精外泌体10g、土茯苓外泌体10g、牛骨胶原蛋白肽50g、透明质酸钠2g、壳寡糖130g、西兰花种子提取物175g、s-腺苷蛋氨酸50g、维生素c5g、玉米淀粉138g、异麦芽酮糖醇
140g、乳酸钙40g；制备方法s1.按实施例二、三所述制备方法：制备黄精外泌体冻干粉、土茯苓外泌体冻干粉；s2.将黄精外泌体、土茯苓外泌体、功效活性成分和辅料加入混合机中混合30min，得到原料混合物；s3.向原料混合物中加入75％乙醇制软材，制粒机制粒，得到湿颗粒；s4.将湿颗粒置60℃烘箱中干燥，使水分≤5%，得干燥颗粒，然后10-20目整粒；s5.在整粒外添加硬脂酸镁，总混25-35min；s6.压片、检验、包装，入库。
19.实施例五：含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物，颗粒剂的制备：配方组成：黄精外泌体5g、土茯苓外泌体5g、牛骨胶原蛋白肽25g、透明质酸钠1g、壳寡糖65g、西兰花种子提取物88g、s-腺苷蛋氨酸25g、维生素c3g、玉米淀粉216g、异麦芽酮糖醇227g、乳酸钙30g；制备方法s1.实施例二、三所述制备方法：制备黄精外泌体冻干粉、土茯苓外泌体冻干粉；s2.将黄精外泌体、土茯苓外泌体、功效活性成分和辅料称量，加入混合机中混合30min，得到原料混合物；s3.向原料混合物中加入75％乙醇制软材，制粒机制粒，得到湿颗粒；s4.将湿颗粒置60℃烘箱中干燥，使水分≤5%，得干燥颗粒，然后10-20目整粒；s5.颗粒灌装、检验、包装，入库。
20.实施例六：含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物，颗粒剂制备方法配方组成：黄精外泌体20g、土茯苓外泌体20g、牛骨胶原蛋白肽80g、透明质酸钠3g、壳寡糖180g、西兰花种子提取物190g、s-腺苷蛋氨酸75g、维生素10g、玉米淀粉51g、异麦芽酮糖醇51g、乳酸钙70g；制备方法：制备方法与实施例五相同。
21.实验例一：含植物来源外泌体治疗关节炎的组合物疗效观察为验证本发明药方对患者的疗效，收集220名病例进行治疗，实验结果如下：纳入标准：1、根据2007年中华医学会骨科学分会修订的标准，确诊为骨关节炎患者；2、30～75岁，男女不限；3、膝关节疼痛明显，伴静息痛，重度关节炎患者影响关节功能；4、经药物及非药物治疗，效果不佳；5、无心、肝、肾等脏器功能不全；6、自愿并能够在术后一年内回来进行随访；类型及分组：分为3个类型，轻度关节炎，100人、中度关节炎60人、重度关节炎60
人；用药方法：统一使用实施例四生产的片剂，每天4-6片；评判标准：有效：症状体征较治疗前减轻、缓解；显效：症状体征完全消失；无效：症状体征治疗前后无变化；实验结果：具体实验效果如表1：表1 220人关节炎治疗跟踪随访实验结果由表1可知，对轻度关节炎患者治疗周期为1-6周，有效率达100％，治愈率达99％；对于中度关节炎患者治疗周期为6-15周，有效率达95％，治愈率达88％；对于重度关节炎患者治疗周期为15-35周，有效率达92％，治愈率达83％。跟踪随访中没有发现不良反应。
22.实验例二：含植物来源外泌体组合物治疗关节炎的病例1、卞某某，男，65岁，长期受膝关节炎及疼痛困扰，使用本品后3天后明显感觉疼痛感减轻，坚持使用60天，已经很少感觉疼痛感，使用90天后已经完全感觉不到疼痛感；2、佟某某，女，49岁，因长期工作原因患有颈椎病，使用本品30天后疼痛感明显减轻，使用75天感觉身体恢复到了健康状态；3、马某某，男，28岁，车间搬运设备软组织搓伤，皮肤红肿疼痛，使用本品7天后已经完全恢复。
23.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下，可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。