一种天然化合物及其组合物在清除衰老细胞方面的应用

1.本文涉及营养保健医疗技术，尤指4,4
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二甲氧基查尔酮(简称dmc)及其组合物用于清除衰老细胞和发挥延缓衰老的作用。


背景技术：

2.衰老是多种慢性疾病的首要危险因素，极大影响到人类健康与社会发展。随着全球科技和局势不断发展，人口增长缓慢、老龄化问题严重，老龄化和细胞衰老的关系一直是人们关注的热点。近年来，大量研究表明，衰老细胞堆积是驱动老龄化和老年性疾病发生、发展的重要机制，衰老细胞成为防治老年病的一个新靶点，研发具有衰老细胞清除作用的药物也成为热点[1]。
[0003]
细胞衰老现象最早在1961年报道，美国生物学家leonard hayflick在体外培养正常人的成纤维细胞时发现，即使给予细胞最适宜的生长条件，细胞分裂至一定代数也会发生生长停滞，这种细胞增殖能力的极限被称为hayflick极限[2]。机制研究发现，这种现象是因为细胞随着复制次数越多，端粒缩短且端粒酶活性下降。此外，常见的体外刺激、化疗和放疗以及诱导细胞发生重编程同样也可以诱导细胞发生衰老。根据细胞衰老的诱发因素进行分类，衰老可以细分为：1.端粒诱导的细胞衰老；2.氧化应激诱导的细胞衰老；3.癌基因诱导的衰老；4.治疗诱导的细胞衰老；5.重编程诱导的细胞衰老等。衰老细胞的基本特征是细胞永久性生长停滞(即细胞周期阻滞)、细胞形态改变、端粒缩短、抗凋亡作用、衰老相关分子的变化(分子标志物)以及具有衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,sasp)。(1)细胞永久性生长停滞：细胞周期阻滞现象是在体外鉴定细胞衰老最基本也是最不可或缺的指标之一。(2)细胞形态改变：衰老细胞通常会变得扁平，整个细胞及其细胞核体积均会变大，细胞在衰老后的形态学变化只能作为判断细胞衰老的辅助性证据。(3)端粒缩短：检测端粒的缩短现象是细胞衰老的特征之一，但该现象只能作为辅助判断。(4)抗凋亡作用：细胞应激时，如果p53水平较低，激活下游凋亡通路效应蛋白的能力较弱，细胞会出现衰老而不是凋亡。(5)衰老相关分子的变化：在衰老过程中会有一些特异性的分子标志物表达发生变化，例如衰老相关β-半乳糖苷酶表达水平或活性增加，与细胞周期相关的分子如p14、p16、p21会增加。(6)sasp：细胞衰老时会分泌一系列细胞因子并改变衰老细胞自身或周边微环境，例如分泌胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子β、白介素、i型纤溶酶原激活物抑制剂(pai-1)。
[0004]
靶向清除衰老细胞的药物或药物组合被称为senolytics，目前senolytics药物在临床试验中取得了良好的进展，达沙替尼(dasatinib) 槲皮素(quecertin)组合(d q)已经进入ii期临床试验阶段。2019年，澳大利亚研究人员筛选出4,4
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二甲基查尔酮(4,4
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dimethyoxychalcone，dmc)具有延长酵母、线虫、果蝇等多种物种寿命的功能[3]。我们实验室通过热蛋白质组学(tpp)技术对dmc进行了多靶标鉴定，并对其抗肿瘤细胞增殖的作用进行了解析[4][5]。


技术实现要素：

[0005]
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
[0006]
目前，4,4
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二甲基查尔酮(4,4
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dimethyoxychalcone，dmc)是否通过清除衰老细胞的方式延长物种寿命还没有人探究，并且dmc与当前最热门的d q进行组合所形成的组合物是否具有senolytics潜力也未知。
[0007]
虽然senolytics可以杀死衰老细胞，但同时也会杀死少量健康细胞。存在该问题的主要原因可能是药物的剂量问题，或者是药物本身的毒性。我们的实验显示单独的达沙替尼(d)、单独的槲皮素(q)以及d q对正常细胞均有较大的杀伤作用，而单独的dmc处理能在达到与d、q或d q相同衰老细胞作用效果的同时，对正常细胞杀伤力较小，从而显示出更低的毒性。
[0008]
因此，为了解决以上问题，本技术提供了一种用于清除衰老细胞的药物组合物，可以达到与d、q或d q相同清除衰老细胞作用效果的同时，对正常细胞杀伤力较小，从而显示出更低的毒性。
[0009]
本技术的实施方式中，提供了4,4
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二甲氧基查尔酮或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备用于清除衰老细胞或延缓衰老或下调衰老相关分泌表型的药物中的用途。
[0010]
本技术的实施方式中，提供了4,4
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二甲氧基查尔酮或其药学上可接受的盐、水合物或前药与达沙替尼或槲皮素的组合在制备用于清除衰老细胞或延缓衰老或下调衰老相关分泌表型的药物中的用途。
[0011]
本技术的一些实施方式中，4,4
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二甲氧基查尔酮或其药学上可接受的盐、水合物或前药与达沙替尼的摩尔比例范围为(500-50):3，优选地500:3，优选地250:3，优选地100:3，优选地50:3。
[0012]
本技术的一些实施方式中，4,4
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二甲氧基查尔酮或其药学上可接受的盐、水合物或前药与槲皮素的摩尔比例范围为(1-3):(1-4)，优选地1:1，优选地1:2，优选地2:3，优选地3:4。
[0013]
本技术的实施方式中，提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括4,4
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二甲氧基查尔酮或其药学上可接受的盐、水合物或前药与达沙替尼或槲皮素以及任选的药学上可接的辅料。
[0014]
本技术的一些实施方式中，4,4
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二甲氧基查尔酮或其药学上可接受的盐、水合物或前药与达沙替尼的摩尔比例范围为(500-50):3，优选地500:3，优选地250:3，优选地100:3，优选地50:3。
[0015]
本技术的一些实施方式中，4,4
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二甲氧基查尔酮或其药学上可接受的盐、水合物或前药与槲皮素的摩尔比例范围为(1-3):(1-4)，优选地1:1，优选地1:2，优选地2:3，优选地3:4。
[0016]
本技术的实施方式中，上述药物组合物用于清除衰老细胞或延缓衰老或下调衰老相关分泌表型的用途。
[0017]
与相关技术相比，本技术包括以下优势。
[0018]
dmc比q对正常细胞的毒性更低，且对衰老细胞的清除能力更强；d dmc组合物对正常细胞的毒性显著低于d q组合物；dmc与q的组合又比单纯dmc更好，因此降低了可能存在
的抗癌药物的危害；并且dmc及其与d或q的组合对衰老细胞清除能力比d q组合显著更强。并且dmc还可以降低衰老lo2细胞的sasp水平。
[0019]
本技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本技术而了解。本技术的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
[0020]
附图用来提供对本技术技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本技术的技术方案，并不构成对本技术技术方案的限制。
[0021]
图1为dmc的分子结构。
[0022]
图2为etoposide诱导的衰老lo2细胞β-半乳糖苷酶染色情况。
[0023]
图3为etoposide诱导的衰老lo2细胞sasp基因表达情况。
[0024]
图4为cck8实验检测dmc及其组合物对衰老细胞的清除能力。
[0025]
图5为β-半乳糖苷酶染色实验检测dmc及其组合物对衰老细胞的清除能力。
[0026]
图6为dmc抑制衰老lo2细胞的sasp表型。
[0027]
图7为dmc及其与q的组合物促进衰老小鼠毛色变得浓密黑亮。
[0028]
图8为dmc及其与q的组合物降低小鼠肝脏组织sasp表型。
[0029]
图9为dmc及其组合物清除小鼠尾部衰老成纤维细胞。
具体实施方式
[0030]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031]
目前，4,4
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二甲基查尔酮(4,4
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dimethyoxychalcone，dmc)是否通过清除衰老细胞的方式延长物种寿命还没有人探究，并且dmc与当前最热门的d q进行组合所形成的组合物是否具有senolytics潜力也未知。
[0032]
虽然senolytics可以杀死衰老细胞，但同时也会杀死少量健康细胞。存在该问题的主要原因可能是药物的剂量问题，或者是药物本身的毒性。我们的实验显示单独的达沙替尼(d)、单独的槲皮素(q)以及d q对正常细胞均有较大的杀伤作用，而单独的dmc处理能在达到与d、q或d q相同衰老细胞作用效果的同时，对正常细胞杀伤力较小，从而显示出更低的毒性。
[0033]
4,4
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二甲基查尔酮(4,4
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dimethyoxychalcone，dmc)是近几年被筛选出来具有延长多种物种寿命的黄酮类化合物[3]，分子式为c
17h16
o3，结构如图1所示，两个苯环通过三个碳形成c
6-c
3-c6的结构，三碳之间存在一个双键和一个羰基。我们出乎意料地发现了dmc具有清除衰老细胞的能力，有望与其他senolytics开发出效果更好的组合物用于清除衰老细胞。
[0034]
接着，我们用10μm etoposide(依托泊苷，分子式为c
29h32o13
，可诱导细胞衰老)处理lo2细胞(人正常肝细胞系)24小时从而成功构建了衰老细胞模型(经文献调研，未见用
etoposide诱导lo2细胞的衰老细胞模型)，称为senescent cells(简称sen cells)，对应地，未诱导的正常lo2细胞为对照组细胞。检测正常细胞和sen细胞的形态差异和β-半乳糖苷酶染色情况，以及二者的sasp基因表达水平，从而判断衰老细胞模型是否构建成功。
[0035]
达沙替尼简写为d，槲皮素简写为q，我们用不同浓度dmc(5μm、10μm、25μm、50μm)，不同浓度dmc(5μm、10μm、25μm、50μm) 300nm d组合物，不同浓度q(5μm、10μm、25μm、50μm) 300nm d组合物，不同浓度(10μm、25μm、50μm)dmc q的组合物处理正常细胞和sen细胞，对比dmc，d q，dmc q等不同组合物对衰老细胞的清除作用，通过cck-8、β-半乳糖苷酶染色实验、sasp基因qpcr检测等实验探究dmc及其组合物的衰老细胞清除能力、sasp表型抑制能力。
[0036]
将溶剂dmso、dmc(50mg/kg)、dmc(25mg/kg) q(25mg/kg)通过腹腔注射的方式对衰老小鼠(20months，c57bl6)进行2个月的处理(每隔4-5天处理一次)，检测dmc或dmc q组合物对衰老小鼠毛发和运动能力的影响。利用小鼠肝脏切片免疫组化实验、qpcr实验检测dmc、dmc q能否降低衰老小鼠的sasp表型。
[0037]
将6个月的c57bl6小鼠尾部原代成纤维细胞分离出来进行培养，培养至第8代，验证dmc及其组合物对小鼠衰老成纤维细胞的衰老标志物的影响及能否清除小鼠衰老成纤维细胞。
[0038]
与现有的衰老细胞清除剂相比，本发明具有以下优势：
[0039]
dmc和q均是黄酮类化合物，但是发现了dmc比q对正常细胞的毒性更低，且对衰老细胞的清除能力更强；其次，发现了d 10μm dmc、d 25μmdmc组合物效果与d 10μm q、d 25μm q的衰老细胞清除能力相当，但d dmc组合物对正常细胞的毒性显著低于d q组合物；再者，发现了dmc与q的组合物又比单独的dmc更好，说明两种黄酮类化合物组合也具有很不错的衰老细胞清除能力，这样就无需抗癌药物d的添加，降低了可能存在的抗癌药物的危害。
[0040]
此外，dmc可以清除衰老lo2细胞和延缓小鼠的衰老，降低小鼠肝脏sasp表型，并且dmc及其与d或q的组合物也具有衰老细胞清除作用，且其中几种组合物的衰老细胞清除能力比d q组合更强。
[0041]
下面结合具体的实施例对本专利做进一步详细的说明，但本发明不限于以下实施例。
[0042]
本技术所用试剂如下：
[0043]
4,4
’‑
二甲氧基查尔酮：(alfa aesar,usa,cat#.l10585)
[0044]
达沙替尼：(targetmol,usa,cat#.t1448)
[0045]
槲皮素：(targetmol,usa,cat#.t2174)
[0046]
etoposide：(beyotime,china,cat#.sc0173)
[0047]
小鼠：(北京维通利华)c57bl6品种
[0048]
免疫组化试剂盒：(武汉塞维尔，cat#.gb11117，cat#.gb11113)
[0049]
实施例1：
[0050]
dmc及其药物组合物具有清除etoposide诱导的衰老lo2细胞的能力。
[0051]
将etoposide，dmc，dasatinib和quercetin由dmso溶解配制为各自适当的工作液。
[0052]
依托泊苷(etoposide)作为抗肿瘤药，可以通过抑制肿瘤细胞内dna及蛋白质合成发挥抑癌作用。有研究显示，大剂量etoposide可以诱导肿瘤细胞凋亡，而小剂量etoposide则能诱导肿瘤细胞衰老。首次用etoposide构建了衰老lo2细胞模型，具体方法是10μm依托
泊苷(etoposide)处理人正常肝细胞系lo2细胞24h，etoposide处理后的细胞经β-半乳糖苷酶染色后大部分呈蓝色即进入衰老状态，即说明dna损伤诱导的衰老细胞模型构建成功。qpcr检测后发现相比于正常细胞，经etoposide诱导的衰老细胞il-1α、il-1β、il-6、il-8、p21和p16等sasp显著升高(etoposide诱导的衰老lo2细胞β-半乳糖苷酶染色情况示于图2中；etoposide诱导的衰老lo2细胞sasp基因表达情况示于图3中)。接着用dmc及其药物组合物处理衰老lo2细胞48h，经β-半乳糖苷酶染色检测衰老标志物和qpcr检测sasp表型发现，dmc(5μm、10μm、25μm、50μm)可以清除衰老lo2细胞，并且对正常细胞影响较小，且单独的dmc处理比单独的q处理效果更佳(图4的c，图4的d)；此外，我们也将dmc与d以及dmc与q进行组合，观察药物组合物对衰老细胞的清除作用，我们发现300nm d dmc(5μm、10μm、25μm、50μm)的组合物与300nm d q(5μm、10μm、25μm、50μm)衰老细胞清除能力相当，但在同等浓度组合下dmc q对正常细胞的杀伤作用更小，说明d dmc的组合物比d q的组合物更佳(图4的a)；此外，我们也将dmc与q进行组合，发现dmc q的组合物也具有衰老细胞清除能力，无论二者是10μm、25μm还是50μm，其中10μm dmc 10μm q的组合物对正常细胞无影响(图4的b)，说明黄酮类化合物之间的组合物也具有称为senolytics的潜力。此外，我们还通过qpcr检测了il-1α、il-1β、tnf-α和cxcl10等sasp的mrna水平，发现dmc还可以降低衰老lo2细胞的sasp水平(图6)。以上结果说明了dmc及其组合物可以清除衰老细胞，并且可以降低衰老细胞的sasp水平。
[0053]
实施例2：
[0054]
dmc及其药物组合物清除小鼠衰老成纤维细胞。
[0055]
将6个月的c57bl6小鼠尾部原代成纤维细胞分离出来进行培养，培养至第8代，作为复制型衰老细胞模型。dmso处理组作为对照组，用d q、dmc及其组合物处理衰老细胞，进行β-半乳糖苷酶染色实验，图9结果显示，dmc(1μm、5μm、10μm、25μm、50μm)、d dmc(10μm、25μm、50μm)、50μm q dmc(25μm、50μm)处理48h均能清除小鼠衰老成纤维细胞，并呈现浓度依赖性，浓度越高清除的效果越好；由图9可知，300nm d 10μm dmc与300nm d 50μm q的作用相当，300nm d 25μm dmc及300nm d 50μm dmc的作用优于300nm d 50μm q的作用，并且300nm d 50μm dmc的作用显著优于300nm d 50μm q的作用；50μm q 25μmdmc及50μm q 50μm dmc也具有清除衰老细胞的效果。以上结果说明了dmc及其组合物可以有效地清除衰老细胞。
[0056]
实施例3：
[0057]
dmc及其药物组合物延缓小鼠衰老和降低肝脏组织sasp表型。
[0058]
用dmso、dmc(50mg/kg)、dmc(25mg/kg) q(25mg/kg)通过腹腔注射的方式对20个月大的雄性衰老小鼠(c57bl6品种)进行2个月的处理(每隔4-5天处理一次)，以dmso处理组作为对照组，观察衰老小鼠毛色和运动能力发现dmc处理组、dmc q处理组均能使衰老小鼠毛色浓密黑亮、运动能力增强(图7)；将三组小鼠(每组4-6只小鼠)的肝脏组织进行免疫组化实验，检测发现相比于对照组，dmc及dmc q处理组的衰老小鼠肝脏il-6、il-1β等sasp基因表达水平更低(图8的a)。同时我们提取了小鼠肝脏组织的rna，经qpcr检测il-1α、il-1β、cxcl10和mmp12等sasp的mrna水平，发现相比于对照组，dmc及dmc q处理组sasp的mrna水平更低(图8的b)。以上结果提示了dmc及其组合物具有延缓小鼠衰老和降低sasp表型的作用。
[0059]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0060]
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