一种中药单体联合药物组合物及其在抗新生隐球菌中的应用

1.本发明涉及抗菌药物，尤其涉及一种中药单体联合药物组合物及其在抗新生隐球菌中的应用。


背景技术：

2.真菌是真核生物，与哺乳动物细胞存在相似的生物学特征，因而常规抗真菌治疗效果有限且副作用较大。目前抗真菌药物效率低、可利用率低、对宿主的不良反应多，加上真菌耐药性日趋严重，使得抗真菌药物治疗面临巨大的挑战。因此，迫切需要发现新的思路和研究新的抗真菌药物。近年国内外对中药成分与抗真菌药物协同抗真菌作用的研究已取得很大进展，但对新生隐球菌具有抗菌效果的中药成分的药物较少。


技术实现要素：

3.针对新生隐球菌具有抗菌作用的药物较少的问题，本发明提供一种中药单体联合药物组合物，该中药单体联合药物组合物由中药单体和西药抗菌成分组成。
4.在本发明中，中药单体为紫草素，药用植物作为我国传统中药材的重要来源，长期以来一直被现代临床天然药物研发者重点关注。作为重要中药材之一,紫草早在我国著名古书典籍《五十二病方》《神农本草经》和《本草纲目》等中就有明确的记载，常用于治疗急、慢性肝炎和肝硬化等。紫草素(shikonin,sk)是从紫草中提取的萘醍类化合物，已有的研究结果显示，紫草素具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗菌和抗炎等作用。目前关于紫草素的抗肿瘤作用研究较多，研究结果显示紫草素类化合物所发挥的抗肿瘤作用，是通过影响肿瘤细胞的代谢、增殖、分化、信号传递和基因表达等来阻碍肿瘤细胞的生长。但有关紫草素对新生隐球菌的抑制作用目前尚未见相关报道。
5.进一步，中药单体还可以添加生物碱类，如黄连碱或黄柏碱，或者黄酮类，如黄芩苷。
6.在本发明中，西药抗菌成分为氟康唑(flc)，氟康唑是唑类抗真菌药物的一种，是治疗隐球菌病最常用的抗真菌药物类别，其作用机制是抑制催化羊毛甾醇14α-去甲基生成麦角甾醇的细胞色素p450，14-甲基化的甾醇的积蓄引起细胞渗透性紊乱而导致细胞死亡。氟康唑具有较低的毒性，并能充分渗透到各种组织中，包括中枢神经系统。然而，伴随着氟康唑广泛应用于真菌感染，使得耐药率问题显著增多，不利于疾病治疗。但是，单一氟康唑对新生隐球菌的抗菌作用有限，在和中药成分复配的基础上，西药抗菌成分还可以添加两性霉素b和/或5-氟胞嘧啶，从而形成复合中药成分和复合西药成分的联合药物组合物。
7.进一步，本发明中药单体联合药物组合物由以下重量份的组分组成：黄连碱2-64份、黄柏碱8-512份、黄芩苷8-512份、紫草素2-20份、氟康唑2-32份、两性霉素b 0-2份、5-氟胞嘧啶0-32份。
8.本发明中药单体联合药物组合物选取生物碱类、黄酮类、萜类的抗真菌中药成分，使其与现有抗真菌药物组合用药探究对新生隐球菌的杀伤效应，筛选出对新生隐球菌具有
抗真菌活性的中药单体，对比该中药单体与现有抗真菌药物药效，并与现有抗真菌药物组合用药探究其是否对毒副作用较大的抗真菌药物具有减毒增效作用，发挥协同作用。
附图说明
9.图1为实施例2药物组合物对新生隐球菌的体外药敏实验结果照片；
10.图2为实施例3药物组合物对新生隐球菌的体外药敏实验结果照片；
11.图3为紫草素对新生隐球菌的时间-杀伤曲线；
12.图4为氟康唑对新生隐球菌的时间-杀伤曲线；
13.图5为实施例1-4药物组合物对新生隐球菌的时间-杀伤曲线。
具体实施方式
14.以下结合实例对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
15.实施例1
16.一种可抗新生隐球菌的紫草素联合氟康唑的药物组合物，紫草素的重量占比为50％，氟康唑为50％。
17.实施例2
18.一种可抗新生隐球菌的紫草素联合氟康唑的药物组合物，由以下重量份的组分构成：黄连碱64份、黄柏碱512份、黄芩苷512份、紫草素20份、氟康唑32份。
19.实施例3
20.一种可抗新生隐球菌的紫草素联合氟康唑的药物组合物，由以下重量份的组分构成：黄连碱30份、黄柏碱260份、黄芩苷260份、紫草素6份、氟康唑17份、两性霉素b1份、5-氟胞嘧啶16份。
21.实施例4
22.一种可抗新生隐球菌的紫草素联合氟康唑的药物组合物，由以下重量份的组分构成：紫草素20份、氟康唑32份、两性霉素b 2份、5-氟胞嘧啶32份。
23.一、新生隐球菌菌液的配置
24.1、将新生隐球菌h99接种于ypd培养基中，30℃恒温箱培养48h；2、在摇菌管中加入3mlypd液体培养基，取少量h99菌体与培养基混匀，置于摇床中过夜培养(220rpm,30℃)；3、取1ml过夜培养的菌液于1.5ml ep管中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入1ml灭菌水，涡旋混匀，3000rpm离心5min，弃去上清液；4、重复第3步操作；5、根据菌体量加入250-350μlynb液体培养基混匀；6、取10μl菌液加990μlynb液体培养基测od值，并将od值稀释到0.0003(公式：c1v1＝c2v2)，得初始菌液菌落为2
×
103～3
×
103cfu/ml。
25.二、体外抗真菌药敏实验
26.药敏实验药物浓度：采用dmso将实施例1-4配方的药物溶解，采用肉汤稀释法对抗真菌药物的mic(最小抑菌浓度)进行测定，测定标准为：使用菌落平板计数法，计算与对照组相比为80％真菌生长受到抑制的最低药物浓度。
27.在摇菌管中加入3ml菌液，并加入对应浓度的药物体积于摇床培养48h(220rpm,30℃)，取培养48h后菌液，根据菌液浑浊程度用无菌水进行稀释(稀释倍数：0-105)；取稀释后
的菌液200μl，用玻璃珠在ypd固体培养基涂布均匀，晾干放置30℃恒温箱培养48h观察菌落数。重复三次，实施例1-4的mic50(菌落计数结果与无药组相比真菌生长减少50％的药物浓度)、mic80(菌落计数结果与无药组相比真菌生长减少80％的药物浓度)和mic，统计如表1所示。
28.表1.实施例1-4的mic50、mic80和mic统计
[0029] mic50(μg/ml)mic80(μg/ml)mic(μg/ml)实施例10.800.931.14实施例20.710.861.05实施例30.520.750.87实施例40.640.830.96紫草素1.121.261.48氟康唑3.34.24.9
[0030]
从表1数据可以看出，相比于紫草素或者氟康唑体外抗真菌药敏效果，本发明实施例1-4联合药物组合物对新生隐球菌体外抗真菌药敏效果更明显。
[0031]
图1和图2分别为实施例2和实施例3对新生隐球菌的体外药敏实验结果照片，从照片中的菌落可以看出，紫草素联合氟康唑对新生隐球菌具有较好的抑制作用，但实施例3的抑制作用更好。
[0032]
三、时间-杀伤试验
[0033]
紫草素、氟康唑以及实施例1-4药物浓度为自身mic的倍数，采用dmso溶解。取od＝0.0003的真菌稀释液100μl分别与900μl紫草素、氟康唑以及实施例1-4的药物溶液共孵育，依次在0、2、4、8、12、24、36、48、60、72h时取200μl涂布ypd平板，30℃培养48h，菌落计数。
[0034]
图3-图5分别为紫草素、氟康唑、实施例1-实施例4药物组合物(均为1
×
mic)对新生隐球菌的时间-杀伤曲线，从各曲线可以看出，紫草素在24h对新生隐球菌的杀菌/抑菌活性效果最高，当药物浓度≤1
×
mic时，紫草素对新生隐球菌表现为抑菌作用，当药物浓度为2
×
mic时，在0-12h表现为杀菌活性，当药物浓度为3
×
mic时，在0-24h表现为杀菌活性，当药物浓度为≥4
×
mic时，在0-36h表现为杀菌活性，当药物浓度≥2
×
mic时，紫草素对新生隐球菌的作用由杀菌作用转变为抑菌作用，其原因是与紫草素药效降低有关。氟康唑对真菌作用表现为抑菌活性，在48h对新生隐球菌的抑菌活性效果最高，在24h时，药物浓度≤1
×
mic时几乎不表现对新生隐球菌的抑菌作用，在48h时，氟康唑对新生隐球菌的抑菌作用表现为随着氟康唑药物浓度的升高对新生隐球菌的抑制作用越强，氟康唑抑菌作用与作用时间和药物浓度密切相关，并且都随着两者的延长或升高其抑菌作用越强。实施例3和4相比于2
×
mic的紫草素，对新生隐球菌表现出更为长效的杀菌作用(2
×
mic的紫草素为12h，实施例3和4均为36h)；48h以后，实施例1-4相比于1
×
mic的氟康唑，对新生隐球菌表现出更为长效的抑菌作用。所以实施例1-4药物组合物对新生隐球菌具有长效杀菌和超长效抑菌的作用。
[0035]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。