一种降低咸鸭蛋黑黄率的加工方法

1.本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种基于改变鸭蛋载菌组成以实现降低咸鸭蛋黑黄率的加工工艺。


背景技术：

2.鸭蛋是一种营养丰富的食物，含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质、维生素等，中医学认为鸭蛋滋阴补肾，能够提高机体免疫力。咸鸭蛋是鸭蛋经食盐腌制加工而成的再制蛋，在实际的生产过程中会有一定概率的黑黄蛋(即生咸蛋剥壳后蛋黄发黑发臭的蛋)出现，影响咸蛋品质。
3.一般认为被污染的蛋壳表面的细菌会透过蛋壳气孔、壳膜结构迁移进入蛋内而造成鸭蛋内容物的污染。而且有研究表明，由于蛋体表面的微生物数目增加，导致蛋体表面的微生物渗入污染鸭蛋的内容物，特别是肠杆菌科的污染。细菌进入蛋壳，不但会导致蛋壳内部的结构形式发生变化，还会破坏蛋壳中的主要营养物质，导致蛋壳蛋白变稀，系带液化断裂，蛋黄膜失去弹性断裂；脏蛋的保质期也会缩短，变质后的蛋内会产生大量的硫化氢等刺鼻气味。因此脏鸭蛋载菌给鸭蛋加工及食品安全带来极大隐患。
4.食品中的减菌方式很多，通常依据减菌对象特点来选择，如紫外线照射、臭氧杀菌和柠檬酸淋洗处理草鱼片来减菌可有效降低鱼片菌落总数、tvb-n值、tba值和ph值；采用栅栏技术、紫外线照射、微波杀菌和高压灭菌处理滩羊肉制品也可实现减菌目的。另外近年来酸性电解水、臭氧水因其无残留的特点，被广泛应用于水产、猪肉等食品的减菌研究中。目前，国内外研究鸡蛋高效清洁的报道很多，如clo2、微酸性氧化电位水、十二烷基二甲基甜菜碱、十二烷基苯磺酸钠、新洁尔灭、紫外线等方式对鸡蛋进行清洗消毒。国内外针对鸭蛋清洁消毒的研究较少，而且蛋鸭与蛋鸡的养殖环境差异较大，蛋鸭喜水的习性，若是夏季高温多雨季节收储不及时甚至会造成“水泡蛋”而使鸭蛋沾染泥污、粪污而载菌多，脏污程度相较鸡蛋更甚，故鸭蛋带菌情况和减菌不能完全参考鸡蛋的研究。针对鸭蛋清洁的少数报道中，有采用油茶籽粕去菌剂、17％盐水和0.2％对羟基苯甲酸甲酯等，研究了鸭蛋减菌后感官指标、色度指标、总菌落数和失重率的变化。还有些针对种鸭蛋减菌的研究，采用的是含氯清洁剂、甲醛、消毒药水，研究了减菌后孵化率等指标的变化。但无论是鸡蛋还是鸭蛋，都未深入分析清洁会对蛋的菌落结构造成何种影响。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的问题，本发明发现黑黄蛋的出现概率不仅与鸭蛋载菌量相关，更重要的是与鸭蛋载菌组成紧密相关，基于此本发明提供一种降低咸鸭蛋黑黄率的加工方法，通过针对性的降低导致黑黄蛋出现的菌种丰度，简单、高效的实现咸鸭蛋的高质量加工。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
7.本发明通过比较不同洁净程度鸭蛋及黑黄咸蛋的载菌量以及载菌种类和丰度比
对分析，发现黑黄咸蛋壳内及内容物的载菌量大幅增加，且黑黄咸蛋的优势微生物与重度脏污蛋的优势微生物高度类似，这些微生物通过氨基酸转运和代谢、无机离子转运和代谢等通路参与黑色物质生成，证实了原料鸭蛋载菌是致黑主因之一，该类微生物对咸蛋黄的黑化起驱动作用，且致黑菌丰度与盐渍蛋黄的黑化率正相关。
8.基于上述发现，本发明提供了一种降低咸鸭蛋黑黄率的加工方法，具体为：通过减菌处理改变鸭蛋载菌组成，其中鸭蛋载菌组成包括鸭蛋载菌量和鸭蛋特定微生物种类的丰度，所述特定微生物为变形杆菌门微生物，更具体的，所述特定微生物为嗜冷杆菌和不动杆菌。
9.进一步地，本发明提供的降低咸鸭蛋黑黄率的加工方法具体包括以下步骤：
10.s1、待鸭蛋生产收集后，立即采用熏蒸剂进行熏蒸处理；
11.s2、经步骤s1熏蒸处理后的鸭蛋运至加工厂处理后，先置于熏蒸设备后进行二次熏蒸处理，然后临储以待腌制；
12.s3、取步骤s2所得鸭蛋并用清洗剂刷洗，烘干后进行腌制。
13.更进一步地，在上述技术方案中，熏蒸剂为臭氧，此时熏蒸处理的参数为：熏蒸浓度为1～3g/m3，时间为10～90min。
14.更进一步地，在上述技术方案中，临储的参数为：温度为4～20℃，时间≤7d。
15.更进一步地，在上述技术方案中，步骤s3所述的清洗剂为臭氧水、二氧化氯溶液、次氯酸钠溶液或微酸性电解水。
16.更进一步地，在上述技术方案中，所述腌制的方式为盐泥包裹腌制或盐水浸泡腌制。
17.现对于现有技术，本发明的有益效果为：
18.1)本发明揭示了鸭蛋载菌种类、丰度与咸蛋黑黄率的关系，进而通过针对性的去除或降低鸭蛋中导致黑黄蛋出现的微生物并保留部分有益微生物，实现了咸蛋黑黄率的显著降低，有效提高了咸蛋质量。
19.2)基于鸭蛋中的致黑微生物，本发明仅通过臭氧熏蒸配合清洗剂浸泡清洗，即可显著降低咸蛋黑黄率，处理工艺简单且成本低，避免了因过于追求蛋壳表面洁净而大量使用除菌剂和清洁剂，从而对蛋品质造成影响(如氯残留、蛋壳变脆破损等)并引起蛋内营养物质变质；
20.3)本发明使用臭氧做熏蒸剂，安全性有保证，2001年被fda(食品药品监督管理局)列入可直接与食品接触的添加剂，对蛋内质影响小；采用熏蒸方式处理鸭蛋，使得臭氧可以在密闭空间均匀弥散，减菌作用全面而彻底，省时省力易操作；
21.4)本发明在鸭蛋从鸭舍收集后立即进行臭氧熏蒸，使鸭蛋初始菌落总数较低，且熏蒸会在一段时间内有效抑制鸭蛋壳内壳外的微生物增殖，避免了鸭蛋在放置过程中蛋壳上的微生物侵入蛋壳内以及通过污染清洗液而感染其他干净蛋，进而降低后续清洁工艺处理时间和成本，实现高效清洁。
附图说明
22.图1为脏污鸭蛋(de)、无可视脏污的干净鸭蛋(ce)减菌前后加工成咸蛋的黑黄率统计图；
23.图2为未经减菌处理的脏污鸭蛋(de，图b)、无可视脏污的干净鸭蛋(ce,图a)壳外、壳内及内容物载菌量对比图；
24.图3为鸭蛋经臭氧第一次熏蒸后壳外(左图)和壳内(右图)菌落总数变化图；
25.图4为未经减菌处理的不同样品组共有或独有otu venn图；
26.图5为未经减菌处理的ce组、de组、bse组壳外微生物属水平相对丰度比较；
27.图6为未经减菌处理的bse的微生物代谢通路情况分析图；
28.图7为未经减菌处理的ce的微生物代谢通路情况分析图；
29.图8为未经减菌处理的de的微生物代谢通路情况分析图；
30.图9为未经减菌处理的各组代谢通路物种组成情况；
31.图10为经减菌处理的不同样品组共有或独有otu venn图；
32.图11为经减菌处理的ce(tce)的微生物代谢通路情况分析图；
33.图12为经减菌处理的de(tde)的微生物代谢通路情况分析图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
35.下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
36.以下实施例所用鸭蛋来自于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所金水家禽养殖基地、相同日龄农湖2号蛋鸭。
37.实施例1
38.按照国家“兽药残留抽样检测技术操作要点”的抽样方法，随机选取蛋壳表面有明显脏污的鸭蛋(记为de)，进行以下加工步骤：
39.(1)一次熏蒸：收集新鲜鸭蛋，立即就地装箱码放在密闭空间，利用臭氧发生器制臭氧后雾状熏蒸，熏蒸参数为1g/m3、60min，设3个重复且每组100枚鸭蛋。
40.(2)二次熏蒸：将经一次熏蒸后的鸭蛋运输至加工厂后进行二次熏蒸，所用熏蒸剂及熏蒸参数同一次熏蒸。
41.(3)临储：鸭蛋经二次熏蒸后分别在4℃临储，临储7d后测定壳外、壳内菌落总数。
42.(4)清洗：采用有效氯(acc)质量浓度为120mg/l的微酸性电解水清洗临储后的鸭蛋。
43.(5)咸蛋腌制：将清洗后的鸭蛋使用20％的食盐水，35℃下腌制30d后得到咸蛋。
44.实施例2～6
45.与实施例1不同的是，实施例2～6的熏蒸参数分别如下表所示：
46.实施例2实施例3实施例4实施例5实施例62g/m3、60min3g/m3、60min3g/m3、10min3g/m3、30min3g/m3、90min
47.实施例7～9
48.与实施例2不同的是，实施例7～9在步骤(3)的临储温度具体如下表所示：
49.实施例7实施例8实施例910℃20℃35℃
50.实施例10～13
51.与实施例2不同的是，实施例10～13在步骤(4)中所用清洗剂具体如下表所示：
52.实施例10实施例11实施例12实施例1350mg/l二氧化氯10～15mg/l臭氧水0.1wt％次氯酸钠25wt％的氯化钠溶液
53.对比例1
54.按照国家“兽药残留抽样检测技术操作要点”的抽样方法，随机选取鸭蛋壳表面无可视脏污的干净蛋(记为ce)，再按照与实施例2相同的方法进行加工。
55.对比例2
56.与实施例1不同的是，不进行步骤(1)～(4)，直接按照步骤(5)进行咸蛋腌制。
57.对比例3
58.与对比例2不同的是，按照国家“兽药残留抽样检测技术操作要点”的抽样方法，随机选取鸭蛋壳表面无可视脏污的干净蛋(记为ce)，直接按照步骤(5)进行咸蛋腌制。
59.对各实施例和对比例所制备咸蛋的黑黄率进行统计，其中黑黄率的统计方法为：生咸蛋剥壳后置于单品测定台，整个蛋黄发黑发臭，即记为有黑黄，黑黄个数占全部蛋黄个数的比例记为黑黄率。统计结果如图1所示：无可视脏污的干净蛋(即ce组，对比例3)及其减菌处理后tce组(即对比例1)加工的咸蛋均无黑黄蛋出现；脏污蛋(即de组，对比例2)加工后的黑黄蛋率占13.5％-15.5％，脏污蛋经减菌处理后“黑黄”率大幅降低至4％(所有实施例的均值)，但不能完全杜绝黑黄蛋的发生，可见原料鸭蛋表面脏污与黑黄蛋的出现直接相关。
60.进一步采集各实施例和对比例的各个加工过程的壳外菌液样本、壳内菌液样本和内容物菌液样本进行对比，分析菌落总数和菌落多样性。其中样本的制备方法具体为：
61.壳外菌液样本的制备：将鸭蛋整蛋用无菌生理盐水，常温条件下置于超声波清洗器中清洗，收集洗蛋水混合液即得壳外菌液样本。
62.壳内菌液样本的制备：在无菌环境下剥开蛋壳，分离蛋壳与壳膜，用无菌生理盐水浸泡壳膜并蘸取擦拭蛋壳内表面，收集该混合液即得壳内菌液样本。
63.内容物菌液样本：无菌条件下收集蛋白和蛋黄，混合均质得到内容物菌液样本。
64.基于上述样本，具体做了如下分析：
65.1、菌落总数的测定
66.参照《gb/t 4789.19-2003食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验》的操作进行，微生物限量标准参照《gb 2749-2015食品安全国家标准蛋与蛋制品》。
67.(1)未经减菌处理的鸭蛋菌落结果如图2所示：de(脏污蛋)壳外菌落总数显著高于ce组(无可视脏污的干净蛋)，菌落总数相差100倍，壳内菌落总数差别不大且载菌数较少，de、ce组内容物均未检出；然而随着时间的增加，de、ce组的壳内、壳外菌落数均会增加，且在7d时二者的内容物均可检出细菌。
68.黑黄蛋的壳外菌落数少于ce组和de组，但壳内及内容物菌落总数大幅增加104倍，黑黄蛋明显腐败变质。
69.(2)实施例1～6中经过一次熏蒸处理后的减菌结果如下表所示：
70.[0071][0072]
注：表中同一列上标的字母a-b和a-b分别表示组内数据存在显著性差异。
[0073]
在上表中，以不熏蒸时的菌落总数为对照进行方差分析。从上表可知，除菌率呈现明显的剂量效应：单一变量条件下，蛋壳内外菌落总数随熏蒸浓度增大而降低、随熏蒸时间延长而降低，同时具有剂量饱和现象，臭氧2g/m3浓度熏蒸60min后菌落减少不显著。从上表可知，熏蒸鲜鸭蛋对蛋壳表面菌落总数抑制效果好，对蛋壳外菌落总数去除作用大于蛋内。
[0074]
(3)将经一次熏蒸后的鸭蛋临储，观察抑菌作用的残留，具体如图3所示：常温放置4d后壳外菌落增殖不显著，蛋内菌落增长慢；放置7d后壳外、壳内菌落增殖显著增加，与未熏蒸组无显著性差异；可见，鸭蛋产后立即熏蒸能在原料蛋贮藏4d内起到抑菌作用。
[0075]
(4)第2次熏蒸的减菌作用
[0076]
鸭蛋运达至加工厂后，不能马上进行加工，需要临储，采取二次熏蒸清除运输过程感染的微生物，其中使用臭氧做熏蒸剂并于2g/m3/40min条件下处理时，除菌效果如下表所示：
[0077][0078]
注：表中同一列上标的字母a-f和a-d分别表示组内数据存在显著性差异(p＜0.05)。
[0079]
在上表中，以不熏蒸时的菌落总数为对照进行方差分析。从上表可知，鸭蛋经一次熏蒸后，对蛋壳外菌落总数去除作用大于蛋内，二次熏蒸可以去除一次熏蒸时无法杀灭的微生物。二次熏蒸后的鸭蛋放置常温4d蛋内外菌落总数升高现象不明显，壳外菌落比不熏蒸或一次熏蒸组分别少10000倍和10倍，壳内菌落总数分别少100倍和10倍；放置7d后，二次熏蒸比不熏蒸和一次熏蒸蛋内菌落总数少10倍，壳外菌落数分别少1000倍和100倍。二次熏蒸可抑制蛋在贮藏7d内蛋外菌落的增殖和向蛋壳内侵染，其中贮藏4d内的抑制作用显著，7d抑制作用开始衰减。
[0080]
(5)不同临储温度下的菌落量变化
[0081]
对比实施例8、13～14中4℃、10℃、20℃和35℃这4个不同的贮藏温度对熏蒸后鸭蛋菌落总数如下表所示：
[0082][0083]
注：同一列中不同的上标字母a-d和a-b分别表示存在显著性差异(p＜0.05)。
[0084]
(6)不同清洗剂处理后的菌落总数对比
[0085]
不同清洗剂处理后的菌落总数结果显示：清洗后蛋外菌落总数变化显著，且存放7d后菌落总数显著低于未清洗组，说明清洗能够有效清除壳内、壳外微生物并抑制其生长；微酸电解水和次氯酸钠瞬时灭菌效果最好，但微酸电解水清洗的蛋品经放置后抑菌性逐渐减弱，二氧化氯、臭氧清洗7d后可持续抑菌。
[0086]
2、减菌后鸭蛋氯残留的测定
[0087]
参照gb 14934消毒餐(饮)具的卫生标准检测去壳后蛋白表面残留氯，结果表明以上各组清洗剂清洗后残留氯均《0.03mg/100cm2的标准，合格。
[0088]
3、减菌前后的壳外菌落多样性的分析
[0089]
采用细菌基因组dna提取试剂盒提取各样本的dna，对提取好的dna样品进行0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分子大小判断，利用紫外分光光度计对dna进行定量。过滤总序列中不合格的dna模板，对合格的文库根据illumina miseq测序区域(v3 v4)，采用合成带有barcode的特异引物进行细菌16s rdna pcr扩增，所得pcr扩增产物经illumina miseq测序，并基于序列信息进行分析。
[0090]
(1)未经减菌处理的ce、de的菌落组成分析
[0091]
以黑黄咸蛋(bse)为对照，ce(干净蛋)组获得101215条有效序列信息，de(脏污蛋)组获得51044条优化序列信息，bse组获得118059条优化序列信息，其中ce和de组样品的检出有效序列条数相差2倍，说明两个样品间具有显著差异。
[0092]
①
根据barcode序列区分各个样本reads，去除嵌合序列后得到有效数据用于微生物α多样性指数分析，结果如下表所示：
[0093][0094][0095]
覆盖率即各组分样品中序列被测出的概率，均达到99％以上，有此可见，本试验测序深度足够、该组数据可有效表示样本中微生物多样性的真实情况，可信度高。
[0096]
表中的chao指数、shannon指数和faith_pd指数均可用来评估不同洁净程度鸭蛋的物种丰富度，chao等指数越大，表明样本丰度指数越高，shannon指数越大,表明样本多样性越高，chao等指数差异越大，说明细菌物种差异越显著。从上表可以看出脏污蛋的chao指数大于干净蛋，shannon指数和faith_pd指数ce组大于de组，物种均匀度ce组大于de组。可
以初步看出脏污蛋的微生物丰度高于干净蛋，而干净蛋的微生物多样性更丰富、均匀度更高，两个样品shannon指数相差2倍，组间差异有统计学意义。黑黄蛋壳外微生物丰度，多样性、均匀度均小于干净蛋，推测咸蛋腌制时高盐高渗的环境抑制了黑黄蛋壳表面微生物的生长。
[0097]
②
进一步以venn图形式表现多个样本中共有和独有的细菌操作分类单元(otu，operationaltaxonomic units)数目，分析门和属水平上物种多样性及其对应丰度，将聚类后属水平上的数据以热图形式表示，物种分块聚集后的群落组成的相似性和差异性，颜色梯度代表差异大小。
[0098]
结果如图4所示：ce组与de组重叠的otu仅占各自otu数的一小部分，共有otu分别占12.32％和9.35％，bse组与de组共有out有3个，与ce组共有out有64个，故在不同的分类水平上，不同洁净程度的鸭蛋及黑黄咸蛋内生细菌水平均存在数量上的差异。
[0099]
③
微生物种类分布的比较
[0100]
首先在门水平上对样品进行注释分析，具体为：ce优势菌占比较高的为变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)和放线菌门(actinobacteria)，分别为34.35％、27.25％和17.28％、拟杆菌门(bacteroidetes)占比较少为8.29％；而de优势菌占比较高的是变形菌门(proteobacteria)为89.01％，厚壁菌门(firmicutes)和放线菌门(actinobacteria)分别占6.16％和3.98％。bse组优势菌占比较高的是变形菌门(proteobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)和厚壁菌门(firmicutes)，分别为76.5％，8.0％，6.76％，5.43％；相对于干净蛋，脏污蛋和黑黄蛋壳外变形菌门的丰度大幅增加，为核心优势菌门。
[0101]
进一步地，在属水平上具体如图5所示(仅显示相对丰度前10的菌属，其他菌属归类为other)：ce优势菌属为涅斯特捷科氏菌属(nesterenkonia)占9.08％、弯曲杆菌属(campylobacter)占7.91％、链球菌属(streptococcus)占3.41％、寡养单胞菌属(stenot rophomonas)占2.92％、赖氨酸芽孢杆菌属(lysinibacillus)占2.65％和乳杆菌属(lactobacillus)占2.27％；de组优势菌属为嗜冷杆菌(psychrobacter)占86.01％(该菌属在ce组中丰度占比小于1％)，不动杆菌属(acinetobacter)占2.20％(该菌为一种常见腐败菌)；bse组优势菌属罗尔斯通氏菌属和沙雷菌属。
[0102]
由此可见，干净鸭蛋菌群多种多样，并且只有一小部分是致病菌，而脏污鸭蛋的腐败菌占很大优势，而能抑制鸭蛋腐败变质的菌群丰度很小，甚至未检出。故脏污蛋比干净蛋更容易腐败变质。
[0103]
④
利用bugbase软件预测细菌组表型，并按革兰氏阴阳、氧气消耗、生物膜、潜在致病力等对鉴定到的壳外微生物进行表型分析：
[0104]
具体为：新鲜鸭蛋微生物以厌氧为主，厌氧菌略多于需氧菌，黑黄蛋的微生物以需氧为主，厌氧菌在“黑黄”样品中丰度大幅降低、而需氧菌丰度大幅升高；新鲜鸭蛋微生物以革兰氏阳性菌为主；鲜鸭蛋具致病性的微生物主要为变形杆菌门且相对丰度较低，而黑黄蛋致病性微生物变形菌门的丰度大幅增加；干净蛋的变形杆菌门的氧化胁迫耐受力较低，且相对丰度显著低于“黑黄”蛋，说明鲜鸭蛋上承载的变形杆菌门对黑黄蛋形成有重要驱动作用，需在加工前采用具有一定氧化性的熏蒸清洗剂去除。
[0105]
⑤
基于已测细菌的测序数据，利用picrust对样本中微生物的基因进行功能预测。
[0106]
图6、图7、图8分别展示了黑黄咸鸭蛋、干净蛋、脏污蛋微生物涉及的功能通路，主要包括细胞过程和信号传导、信息储存和处理和新陈代谢，包含25个代谢通路。
[0107]
从图7、图8中可以看出de组在碳水化合物运输和代谢通路上远大于ce组的相对丰度，由此可看出，脏污蛋的碳水化合物的分解能力强于干净蛋，发现微生物在脂质运输和代谢以及次级代谢物生物合成、转运和分解代谢通路上的微生物相对丰度de组＞ce组。对比发现脏污蛋微生物致脂质氧化分解成次级代谢物的能力强，推测脏污蛋微生物在脂质代谢通路的活跃度要明显高于干净蛋，脂质氧化形成次级代谢物的能力也强于干净蛋，而脏污鸭蛋在经历氧化劣变等一系列物化反应后其脂质氧化趋于平缓。而在氨基酸转运和代谢和无机离子转运和代谢通路上微生物丰度ce＞de，干净蛋的微生物在氨基酸及无机离子转运代谢通路上均活跃，推测微生物对干净蛋的氨基酸与无机离子的转运与代谢影响较大。辅酶运输和代谢通路上微生物丰度也呈现de＞ce的规律，也说明了de中辅酶参与的生化反应更为活跃。bse组微生物在氨基酸转运和代谢通路上相对丰度最高，说明bse组微生物致氨基酸转运和代谢最为活跃；bse组在次级代谢物生物合成、转运和分解代谢通路上微生物丰度高于ce和de组，推测微生物对黑黄蛋的脂质氧化分解成次级代谢物的影响较大。
[0108]
虽然不同洁净程度鸭蛋样本预测的主要功能基因类别基本无差异，但丰度具有差异。脏污蛋的碳水化合物以及脂质代谢通路相对丰度要高于干净蛋，而干净蛋氨基酸与无机离子的转运与代谢通路表现出较高的丰度。碳水化合物是微生物生长繁殖的基本营养物质，这与脏污蛋微生物丰度高于干净蛋的结果相符。由此推测，不同洁净程度的鸭蛋壳外细菌发挥各自的功能基因影响鸭蛋壳外微生物的合成代谢途径，从而形成了严重脏污蛋容易腐败变质的现象。
[0109]
各组代谢通路物种组成情况如图9所示，具体为：de组主要微生物为psychrobacter(嗜冷菌属)、acinetobacter(不动杆菌属)等，ce组的主要微生物为lysinibacillus(赖氨酸芽孢杆菌属)、stenotrophomonas(寡氧单胞菌属)、streptococcus(链球菌属)、unclassified_rhizobiaceae(未分类的慢生根瘤菌属)等，bse组主要微生物为ralstonia(罗尔斯通菌属)、unclassified_rhizobiaceae(未分类的慢生根瘤菌属)、bradyrhizobium(大豆根瘤菌属)、pelomonas(污泥单胞菌属)等。
[0110]
de组中嗜冷菌属占绝对优势，而ce组中嗜冷菌属的相对丰度很低，由此推测，脏污蛋和干净鸭蛋在基因功能上的差异主要是由嗜冷菌属引起的。嗜冷杆菌是一种革兰氏阴性菌，嗜冷，感染人较为少见。现有研究表明，嗜冷杆菌产的酯酶est10具有很强的耐盐性，酯酶est12对一些有机溶剂和去污剂也具有较好的活性和稳定性。可见，严重脏污蛋中嗜冷杆菌属丰度较高，极难清洗去除，且在高浓度盐水或盐泥盐渍加工咸蛋，其所属酯酶est10依然有致劣能力。
[0111]
另外，现有研究表明寡养单胞菌属具有抑制水体黑臭的作用。ce组导致腐败变质的嗜冷菌属和不动杆菌属丰度很低，而寡养单胞菌属的丰度高，这也是洁净程度高的鸭蛋不易形成黑黄的原因。
[0112]
综上，通过比较了不同洁净程度的鸭蛋及黑黄蛋表面细菌的组成和结构，并预测了样品的基因功能及各代谢通路物种组成情况，可知黑黄蛋的出现与鸭蛋壳外菌群类型和丰度密切相关。
[0113]
(2)减菌处理后的ce、de壳外菌落组成分析，参照未经减菌处理时的分析说明，对
实施例中经清洗处理后的鸭蛋的壳外样本液进行分析：
[0114]
①
微生物α多样性指数分析，结果如下表所示：
[0115][0116]
从上表可知，tce(对比例1)组对比ce，以及tde(全部实施例的洗蛋液混合)组对比de，蛋壳表面微生物的物种数和物种丰富度都显著下降，说明经减菌处理后，微生物总数和微生物种类都大幅减少。其中ce减菌后(tce组)的shannon指数由7.01降低到5.72，simpson指数由0.98降低到0.96，物种均匀度由0.81降低到0.74，说明ce组鸭蛋减菌后，蛋壳表面微生物的丰度和均匀度均大幅下降。值得注意的是，脏污鸭蛋de减菌后菌落物种数、chao1指数(物种丰富度)减少而物种均匀度、shannon指数和simpson指数均升高，说明本发明的减菌处理可总体上减少脏污鸭蛋所载的微生物的数量，而所载不同微生物对减菌处理的敏感度却有差异，使有的微生物因敏感度高而根除，有的微生物对减菌处理敏感度较低、数量减少但仍占一定丰度，成为优势菌，使微生物的丰富度总体下降而均匀度(整齐度)上升。
[0117]
②
从图10所示的venn图可以看出：减菌处理后ce组与tce组共有的otu数为77个，各自独有的otu数为345个和128个，共有otu占ce的18.25％，占tce的37.56％；de组与tde组共有的otu数为84个，各自独有的otu数分别为472个和287个，共有otu占de的15.11％，占tde的22.64％。
[0118]
值得注意的是，ce较tce独有的otu占ce的81.75％，de较tde独有otu占de的84.89％，这说明ce、de中的绝大部分菌落可经过减菌处理而根除。但是，ce组中有18.25％的微生物经减菌后丰度可降低，但不能根除；de中15.11％的微生物不能根除，而在减菌后蛋壳上仍占22.64％。
[0119]
③
在属水平上进行聚类分析统计，具体如下表所示：
[0120][0121]
从上表可知，不同样品所含菌属组成具有很大相似度，但相对丰度值有较大差异；减菌处理可显著降低鸭蛋表面菌落总数和丰度，使原本优势菌属发生改变。
[0122]
tde组相对de组变形菌门(proteobacteria)相对丰度有所下降，可见变形菌门对本发明的减菌处理方式敏感度较高，其丰度降低幅度比厚壁菌门和拟杆菌门的降低幅度更大。
[0123]
在de组中占为绝对优势菌属的嗜冷杆菌(psychrobacter)，经减菌处理后在tde组中占比仅为2.60％，由此可见清洗可以显著减少嗜冷杆菌属在鸭蛋壳表面的数量和丰度，从而降低由嗜冷杆菌属引起的腐败现象。不动杆菌对减菌处理的敏感度不及变形杆菌，故其对蛋清劣化的色度、疏水性、凝胶性均有不良影响的罗尔斯通氏菌属未被完全清除，丰度为2.32％，这与脏污鸭蛋减菌处理后腌制咸蛋仍有“黑黄”蛋出现的现象一致。
[0124]
值得注意的是，原本de组中丰度不到1％的假单胞菌属(pseudomonas)则在tde组中成为优势菌属，丰度占比为12.19％。假单胞菌属具有拮抗变形杆菌致黑的作用，脏污鸭蛋减菌后载有一定量假单胞菌属，猜测其对加工咸蛋“黑黄率”降低可能有一定积极作用。
[0125]
④
基于已测细菌的测序数据，利用picrust对样本中微生物的基因进行功能预测，具体如图11和图12所示，结合图6～9可知：
[0126]
1)ce组微生物在氨基酸转运和代谢通路上相对丰度高于de组，而ce组与tce组在该通路上相对丰度基本一致，de组与tde组同样如此，说明干净蛋微生物致氨基酸转运和代谢相对活跃，减菌处理对该通路的影响并不明显；
[0127]
2)在脂质运输和代谢通路上，微生物相对丰度de＞＞tde＝tce＞ce，次级代谢物生物合成、转运和分解代谢通路上微生物相对丰度de＞tde＝ce＞tce，对比发现脏污蛋微
生物致脂质氧化分解成次级代谢物的能力强，推测脏污蛋微生物在脂质代谢通路的活跃度要明显高于干净蛋，脂质氧化形成次级代谢物的能力也强于干净蛋，而脏污鸭蛋在减菌处理后其脂质氧化活跃程度与未经处理的干净蛋没有明显差异；
[0128]
3)在氨基酸转运和代谢通路上的微生物丰度：ce＝tce＞de＝tde，但无机离子转运和代谢通路上的微生物丰度4组差异并不明显。
[0129]
4)辅酶运输和代谢通路上微生物丰度也呈现de＞ce＝tce＝tde的规律，也说明了de中辅酶参与的生化反应更为活跃。
[0130]
减菌处理后各组代谢通路物种组成情况具体为：tce组的主要微生物为ralstonia(罗尔斯通氏菌属)、unclassified_chitinophagaceae(未分类噬几丁质菌科)、methylobacterium(甲基杆菌属)、unclassified_rhizobiaceae(未分类的慢生根瘤菌属)等，tde组的主要微生物为pseudomonas(假单胞菌属)、acinetobacter(不动杆菌属)、vibrio(弧菌属)等。
[0131]
综上所述，本发明提供的减菌方式能够针对性的降低致脏污鸭蛋产生黑黄的细菌，进而实现黑黄率的显著改善，本发明的加工方式安全性高，且避免了过度清洁带来的蛋品质下降及成本高昂等问题，对生产具有重要指导意义。
[0132]
本发明并不仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的示例。