一种生物样本中铂类前药的定量测定方法

1.本发明涉及一种生物样本中铂类前药的定量测定方法，具体涉及一种生物样本中聚合物偶联铂类前药的定量测定方法。


背景技术：

2.20世纪60年代铂类药物开发上市，包括顺铂、卡铂、奥沙利铂等，铂类药物抗癌机制独特，抗癌谱广，已经成为目前临床上最广使用的化疗药物之一。尽管疗效显著，铂类药物靶向性差，易引起严重的胃肠道反应、神经和骨髓毒性，有强烈的剂量限制性毒性，严重限制其临床使用效果和给药剂量。近年来,基于纳米技术的药物递送策略和聚合物偶联技术为奥沙利铂化疗提供了新的解决途径。如中国科学院上海药物所申报的cn106074379b，奥沙利铂经过氧化后，铂由高生物活性二价态变成低生物活性的四价态，经聚乙二醇偶联后能够自组装成胶束，可以改善药物体内代谢行为，降低了铂类药物的全身、骨髓和免疫毒性，抗肿瘤活性提升。
3.药物的体内代谢行为对于新药的研发有重要的指导意义，但现有测定方法对铂类药物的体内代谢研究有一定的局限性。铂类药物经聚合物修饰后，药物的分子量呈现正态分布的形式，常规的hplc-ms/ms挑战大，缺乏对铂类药物活性成分的有效跟踪。传统的铂类药物常采用icp/ms测定生物样本中总铂的方式研究体内药代动力学行为，但聚合物修饰的铂类前药测总铂的方法不能有效区分二价铂和四价铂在体内药动行为，限制了聚合物修饰铂类前药的临床转化。高效液相色谱法是检测铂类药物常用的检测方法，但是采用hplc-uv方法检测铂类前药，检测限在1μg/ml的范围，不适合检测生物样本中铂类前药的含量。


技术实现要素：

4.本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种生物样本中铂类前药的定量测定方法，操作简单、结果可靠、特异性号、灵敏度高、分析时间短、线性关系良好。所述方法采用hplc-icp/ms联用技术，其中hplc可使不同价态的铂类代谢物得到很好的分离，icp/ms方法可对不同价态铂类药物含量进行测定。
5.在联用方法中，液相色谱流动相选择甲醇，相比乙腈及其他有机溶剂，甲醇在测定铂类代谢物时色谱峰理论塔板数更高，具有更优的色谱行为。在水相中添加乙酸可以使色谱峰峰宽更窄，适合检测。
6.具体技术方案如下：
7.一种生物样本中铂类前药的定量测定方法，采用高效液相色谱(hplc)与电感耦合等离子体质谱(icp/ms)联用技术，测定步骤包括：
8.a.将获得的生物样本进行提取；
9.b.建立药物测定标准曲线；
10.c.使用hplc-icp/ms测定待测样品，通过步骤b所得标准曲线计算出待测样本中铂类前药的药物浓度。
11.进一步，生物样本包括血浆、血清、细胞、组织匀浆液、尿液和粪便。
12.进一步，步骤a生物样本处理方法包括甲醇蛋白沉淀法、乙腈蛋白沉淀法、柱纯化法。
13.再进一步，步骤a生物样本处理方法采用甲醇蛋白沉淀法，在生物样本中加入5-10倍量的甲醇，涡旋混匀后，高速离心提取上清液，置于氮吹仪中挥干，加入甲醇复溶后用于铂类药物含量测定。
14.再进一步，所述的处理方法具体步骤为：取一定量生物样本加入10倍量甲醇，涡旋混匀，置于离心机中12000rpm离心10min，取上清液，置于氮吹仪中挥干，加入200μl甲醇，涡旋10min，即得。
15.进一步，步骤b的操作程序为：
16.1)制备稀释不同浓度的二价铂标准溶液；
17.2)于ep管中加入二价铂标准溶液，空白血浆样本，涡旋混匀后，加入甲醇涡旋混合，离心取上清液，于氮吹仪下挥干甲醇，加入甲醇浓缩复溶，离心后取上清液注入hplc-icp/ms中分析；
18.3)取不同浓度铂标准液重复2)操作，记录色谱图，二价铂浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，利用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线方程，即为标准曲线。
19.进一步，采用高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术，
20.其中，高效液相色谱仪采用如下色谱条件：
21.流动相：有机相-水相
22.色谱柱：反向c18柱，优选xbridge柱(waters，250mm*4.6mm，5μm，)
23.柱温：20℃-40℃，优选30℃
24.流速：1ml/min
25.进样量：10μl-100μl，优选20μl
26.所述流动相中有机相采用甲醇，水相为含乙酸的水溶液体系，乙酸的百分含量为1％-0.05％，优选0.1％，即高效液相色谱的流动相采用甲醇a-含酸的水溶液b体系进行等度洗脱。
27.所述有机相-水相体积比为a:b＝70:30-95:5，优选75:25-95:5，进一步优选90:10。
28.其中，icp/ms测定条件为：氩气为电离气，氦气为载气，雾化器流速为1l/min，冷却器流速为10-14l/min，辅助气0.8l/min，采样深度为3-8mm，等离子体功率为1200-1800w，根据铂原子分子量进行测定。
29.再进一步，icp/ms测定条件为：采用动能歧视模式(ked模式)，氩气为电离气，氦气为载气，雾化器流速为1l/min，冷却器流速为14l/min，辅助气0.8l/min，采样深度为5mm，等离子体功率为1500w，泵速为40rpm，根据铂原子分子量进行测定。
30.hplc可将不同价态的铂类药物进行分离，icp/ms能够高灵敏的测定铂含量，hplc-icp/ms联用可以应用于生物样本中不同价态铂类药物的分离与检测。
31.进一步，所述的铂类前药包括聚乙二醇修饰的奥沙利铂、顺铂、卡铂、洛铂，优选聚乙二醇修饰的奥沙利铂。
附图说明
32.图1为本技术中hplc-icp/ms的定量限(5ng/ml)色谱图；
33.图2为本技术中peg-oxa总铂与四价铂体内药时曲线。
具体实施方式
34.以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
35.材料和设备：聚乙二醇化奥沙利铂(peg-oxa)，烟台药物研究所根据提供cn109988297b合成工艺提供，纯度＞98.5％。色谱甲醇、乙酸等试剂购买自国药集团，高效液相为agilent 1200型号，电感耦合等离子体质谱(icp/ms)为agilent 7500型号。
36.实施例1标准曲线的建立
37.系列标准溶液的配制：
38.精密称取25mg peg-oxa标准品，置于25ml容量瓶中，加入甲醇溶解并摇匀，稀释至刻度，配成1mg/ml的标准储备液。取储备液适量分别用甲醇稀释至10，20，200，1000，2000ng/ml，摇匀备用。
39.体内标曲的制备：
40.取10μl空白血浆，分别加入等量上述配制系列标准溶液，涡旋30s，配成相当于体内浓度为5，10，100，500，1000ng/ml的系列标准溶液。加入甲醇1ml，涡旋混匀，置于离心机中12000rpm离心10min，取上清液后，置于氮吹仪下挥干甲醇，加入100μl甲醇涡旋复溶。
41.高效液相色谱条件：
42.流动相甲醇：0.1％乙酸水溶液＝90：10
43.柱温：30℃
44.流速：1ml/min
45.进样量：20μl
46.色谱柱：xbridge c18(waters,250mm*4.6mm，5μm)
47.高效液相色谱系统，包括二元输液泵，自动进样器，柱温箱。
48.icp/ms条件：
49.采用ked模式，氩气为电离气，氦气为载气，雾化器流速为1l/min，冷却器流速为14l/min，辅助气0.8l/min，采样深度为5mm，等离子体功率为1500w，泵速为40rpm，根据铂元素分子量进行测定。
50.以上述条件对标准品进行检测，浓度5ng/ml的样品信噪比大于10，满足定量要求，详见图1。标准曲线：y＝0.047x 0.117r2＝0.998。
51.实施例2应用hplc-icp/ms检测生物样本peg-oxa的pt含量
52.将注射用peg-oxa复溶后，按照5mg/kg的剂量大鼠尾静脉给药后，分别于下述时间点于大鼠眼眶静脉丛取血：0，0.05，0.083，0.5，1，2，4，8，12，24h，应用实施例1的生物样本处理方法，制备待测样品，依次进入到hplc-icp/ms系统中，根据铂元素分子量进行定量测定，所测结果代入到实施例1中的标准曲线，测定出样品浓度，并绘制药时曲线，结果如图2中所示。
53.实施例3应用icp/ms检测生物样本peg-oxa的总pt含量
54.在实施例2的基础上，取同组的血浆样品100μl，加5ml硝酸40度消解过夜。待冷却后加纯化水定容至50ml，取样按照以下icp/ms条件对铂元素进行定量，测定生物样本peg-oxa的总pt含量。
55.icp/ms条件：采用ked模式，氩气为电离气，氦气为载气，雾化器流速为1l/min，冷却器流速为14l/min，辅助气0.8l/min，采样深度为5mm，等离子体功率为1500w，泵速为40rpm，根据铂元素分子量进行测定。
56.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。