以冰灯玉露叶为外植体诱导不定芽再生的组培快繁方法

1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以冰灯玉露叶为外植体诱导不定芽再生的组培快繁方法。


背景技术：

2.冰灯玉露(haworthia cooperivar)为百合科瓦苇属(也称十二卷属)多肉植物，其全株呈翠绿色，株型较大，单株直径7～10cm，叶片饱满且肥厚，晶莹剔透，有线状的脉纹，叶缘有毛刺，但顶端没有毛，几乎不出侧芽，是玉露杂交后的极品品种，形似冰灯得名，被称为有生命的雕刻品。目前冰灯玉露的繁殖一般采用种子和分株，但其种子小、发芽难度大，且存在繁殖系数及成活率低、生长速度慢、不出侧芽分株困难等问题，因此传统的繁殖技术难以满足人们日益增长的消费需求。而且随着新品种不断育成并投入市场，传统品种难以满足消费者审美的提升，采用传统的杂交育种改良冰灯玉露传统品种存在周期耗时长等问题，难以跟上市场发展节奏，因此采用植物组织培养技术可提高繁殖效率，缩短育种周期，降低生产成本。因此，建立冰灯玉露高效组培快繁体系是亟待解决的问题。
3.离体快繁属于植物组织培养技术领域，通过离体繁殖获到的组培苗不仅能达到快繁的目的，而且能继承母株优良性状，其品质能得到保障，同时可以高效节约空间，繁殖不受地区、季节限制，并且成本低，规模大。离体快繁技术可缩短育种周期，为后续的分子育种也有广泛应用前景。
4.文献“冰灯玉露体细胞胚诱导及其形态学和解剖学分析”(《分子植物育种》，公开日期2021年)主要使用的激素为iaa(吲哚乙酸)等进行分子植物育种，但是iaa分子植物育种不能采用高压蒸汽灭菌，易失活，需要采用过滤灭菌，操作繁琐，并且先诱导出现愈伤组织，再分化不定芽，然后再诱导不定根等步骤，周期长、效率低。
5.中国申请号201910818730.5公开了一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法，使用花序轴为外植体，使用花序轴为外植体存在材料来源受花期限制的问题，而且也是通过先诱导愈伤组织，再分化不定芽，然后生根等步骤。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种以冰灯玉露叶为外植体诱导不定芽再生的组培快繁方法，使用激素6-ba(6-苄基腺嘌呤)、naa(萘乙酸)和2，4-d(2，4-二氯苯氧乙酸)直接诱导不定芽再生，可采用高压蒸汽灭菌，具有操作简便、成本低、速度快、效率高等优势。
7.为达到上述目的，本发明使用的技术解决方案是：
8.以冰灯玉露叶为外植体诱导不定芽再生的组培快繁方法，包括：
9.选择冰灯玉露肉质叶作为外植体，冰灯玉露肉质叶消毒后切块，将消毒后的外植体接种于不定芽诱导培养基进行诱导培养，诱导出不定芽；
10.获得的不定芽作为外植体，经切割分离后继续接种到不定芽继代培养基上，进行不定芽继代增殖培养；生长状态良好的继代不定芽接种于不定根诱导培养基中进行不定根
的诱导；不定芽诱导培养基、不定芽继代培养基采用萘乙酸naa、6-苄基腺嘌呤6-ba及2，4-二氯苯氧乙酸2,4-d配合使用；
11.使生根的继代不定芽苗与环境充分接触，将获得的继代不定芽苗移栽入装有基质的营养钵中进行炼苗驯化。
12.进一步，采用冰灯玉露的肉质叶代替传统的花序轴作为外植体，保证了外植体来源。
13.进一步，挑选冰灯玉露肉质叶为外植体，自来水冲洗30min后，75％乙醇浸泡45s，灭菌水冲洗3次，再用0.1％hgcl2浸泡，灭菌水冲洗8-10次，晾干，获得消毒外植体；将外植体放入无菌培养皿中，用解剖刀将其横切成外径1.0-1.5cm的叶块，用镊子将叶块转到不定芽诱导培养基上，每瓶接种3块；于25℃下暗培养24h后，再放入光照培养箱培养时间10-15天，每天光照时间16h、光照强度2800-3000lx。
14.进一步，不定芽继代增殖的条件为：培养温度为25℃，光照时间16h/d，光照强度2800-3000lx，培养15-20天。
15.进一步，生根培养条件为：于25℃下暗培养24h后，再放入光照培养箱培养时间10-15天，每天光照时间16h、光照强度2800-3000lx。
16.进一步，炼苗驯化过程包括：将组培瓶打开2-3天进行炼苗后，清洗干净继代不定芽苗根部残留的培养基，再将获得的继代不定芽苗移栽入装有基质的营养钵中，覆盖保湿5-7d后，进行正常管理。
17.进一步，不定芽诱导培养基、不定芽继代培养基，配方为：ms培养基 3％蔗糖 1.8mg/l 6-ba 1mg/l naa 0.5mg/l 2,4d 0.8％琼脂。
18.进一步，不定根诱导培养基的配方为：ms培养基 0.8％琼脂 3％蔗糖。
19.本发明技术效果包括：
20.1、以冰灯玉露肉质叶为外植体，通过不定芽再生的途径快速获得大量组培苗，克服了现有技术的如下缺点：(1)以花序轴为外植体的取材时期固定、外植体来源有限；(2)天然激素价格昂贵、消毒步骤繁琐；(3)通过先诱导愈伤组织再分化的间接途径再生植株的周期长。
21.本发明方法外植体来源丰富、培养基消毒方法简单、成本低，采用不定芽诱导再生植株分化率高、增殖系数大，周期短、品质好。本发明能实现多肉植物冰灯玉露快繁，培养出成活率高的优良不定芽苗，满足企业需求，提高经济效益，应用前景广阔，并为后续的分子育种提供基础。
22.2、本发明解决了外植体来源受限、激素昂贵及不稳定、间接途径再生繁殖周期长等现有技术存在的问题，使用naa、2，4-d代替iaa诱导不定芽再生，可以实现操作简便、低成本、快繁殖、生产率高的目标。
23.本发明以冰灯玉露叶为外植体，外植体来源丰富，使用更廉价的激素6-ba(6-苄基腺嘌呤)、naa(萘乙酸)和2，4-d(2，4-二氯苯氧乙酸)诱导不定芽再生，可采用高压蒸汽灭菌，操作简单，而且直接诱导不定芽再生，具有成本低、速度快、效率高等优势。
附图说明
24.图1是本发明中诱导出现不定芽的芽点图；
25.图2是本发明中诱导不定芽出现的不定芽图；
26.图3是本发明中继代增殖培养后出现的丛生芽图；
27.图4是本发明中诱导成功不定根图。
具体实施方式
28.以下描述充分地示出本发明的具体实施方案，以使本领域的技术人员能够实践和再现。
29.以冰灯玉露叶为外植体诱导不定芽再生的组培快繁方法，包括如下步骤：
30.步骤1：选择冰灯玉露肉质叶作为外植体，冰灯玉露肉质叶消毒后切块，将消毒后的外植体接种于不定芽诱导培养基进行诱导培养，诱导出不定芽；
31.采用冰灯玉露的肉质叶代替传统的花序轴作为外植体，保证了外植体来源，并且不定芽诱导速率远远高于已有报道。
32.挑选长势较好的冰灯玉露肉质叶为外植体，自来水冲洗30min后，75％乙醇浸泡45s，灭菌水冲洗3次，再用0.1％hgcl2浸泡，灭菌水冲洗8-10次，晾干，获得消毒外植体，将其放入无菌培养皿中，用解剖刀将其横切成小块儿(大小约为1.0-1.5cm左右)。用镊子将叶块转到不定芽诱导培养基上，每瓶接种3块；于25℃下暗培养24h后，再放入光照培养箱培养时间10-15天，每天光照时间16h、光照强度2800-3000lx。
33.步骤2：获得的不定芽作为外植体，经切割分离后继续接种到不定芽继代培养基上，进行不定芽继代增殖培养；
34.不定芽继代增殖：培养温度为25℃，光照时间16h/d，光照强度2800-3000lx，培养15-20天。可重复多次以达到大量增殖的目的。
35.本发明中，不定芽诱导培养基、不定芽继代培养基采用3种价格低廉，耐高温高压灭菌的激素naa、6-ba及2,4-d配合使用，提高了不定芽诱导的速度和效率。
36.不定芽诱导培养基、不定芽继代培养基，配方为：ms培养基 3％蔗糖 1.8mg/l 6-ba 1mg/l naa 0.5mg/l 2,4d 0.8％琼脂。
37.步骤3：生长状态良好的继代不定芽接种于不定根诱导培养基中进行不定根的诱导；
38.生根培养条件：于25℃下暗培养24h后，再放入光照培养箱培养时间10-15天，每天光照时间16h、光照强度2800-3000lx。
39.不定根诱导培养基的配方为：ms培养基 0.8％琼脂 3％蔗糖。
40.步骤4：打开封口膜使生根的继代不定芽苗与环境充分接触，将获得的继代不定芽苗移栽入装有基质的营养钵中进行炼苗驯化。
41.炼苗驯化：将步骤4的组培瓶打开2-3天进行炼苗后，清洗干净继代不定芽苗根部残留的培养基，再将获得的继代不定芽苗移栽入装有基质的营养钵中，覆盖保湿5-7d后，进行正常管理。
42.实施例1：
43.以冰灯玉露叶为外植体诱导不定芽再生的组培快繁方法，包括如下步骤：
44.1、先给环境消毒，擦拭无菌超净工作台，实验结束后重复环境消毒，用卫生纸进行最后的擦拭。防止留下污痕，对操作台造成伤害。
45.2、取材时间最好选在在晴天下午，可以减少外植体带菌。取冰灯玉露肉质叶，用自来水冲洗30min。放入无菌的三角瓶中封口。
46.3、用75％的酒精棉球擦净超净工作台台面，将提前配好并灭菌的不定芽诱导培养基(ms 1.8mg/l 6-ba 1mg/l naa 0.5mg/l 2,4d 0.8％琼脂)放入超净工作台，开启紫外灯杀菌20-30min后，开启无菌风送风5-10min后可工作。操作过程中时刻执行无菌操作，降低污染风险。
47.4、接种前先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在75％的酒精溶液中。外植体经75％酒精消毒后，无菌水冲洗3遍(第一次冲洗时速度要快一些，降低灭菌剂对材料的伤害)，再用0.1％hgcl2溶液浸泡6-9min，无菌水冲洗8-10次。
48.5、将其放入无菌培养皿中，用解剖刀将肉质叶横切成1cm-1.5cm左右的小块儿。外植体切块不易过大或过小，太大易污染，太小不易启动。用镊子将叶块转到不定芽诱导培养基上，每瓶接种3块。在酒精灯火焰边覆盖好封口膜后线绳紧密封口，接种后经一段时间的暗培养(24小时)再转至光照条件下，对抑制褐变有一定效果。培养温度25℃，光照时间16h/d，培养时间20-25天，光照强度2800-3000lx。培养10-15天即可诱导出不定芽。
49.如图1所示，是本发明中诱导出现不定芽的芽点图；如图2所示，是本发明中诱导不定芽出现的不定芽图。
50.6、初代培养1个月后将外植体转接至新的不定芽诱导培养基上进行继代增殖培养，培养条件同上。继代增殖培养可多次进行。
51.如图3所示，是本发明中继代增殖培养后出现的丛生芽图。
52.7、不定根的诱导：将继代培养获得的材料一部分作为母株用于扩繁，另一部分接种于不定根诱导培养基中进行不定根诱导再生。将诱导出不定芽的材料接种到不定根诱导培养基(ms 3％蔗糖 0.8％琼脂)上，封口膜封口后进行培养，条件同上，培养10-15天。
53.如图4所示，是本发明中诱导成功不定根图。
54.8、炼苗驯化：打开封口膜使获得的生根不定芽苗与环境充分接触2-3天后，将根部的培养基充分清洗干净，移栽入装有基质的营养钵中，覆盖保湿5-7d，之后进行正常管理。
55.本发明所用的术语是说明和示例性、而非限制性的术语。由于本发明能够以多种形式具体实施而不脱离技术方案的精神或实质，所以应当理解，上述实施例不限于任何前述的细节，而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释，因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和改型都应为随附权利要求所涵盖。