蛋白质FBXO7在制备子宫内膜癌诊断标志物中的应用

蛋白质fbxo7在制备子宫内膜癌诊断标志物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种蛋白质fbxo7在制备子宫内膜癌诊断标志物中的应用。


背景技术：

2.子宫内膜癌，又称子宫体癌，是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。子宫内膜癌治疗的总体预后较好，但中晚期和复发转移的子宫内膜癌的预后极差，患者的平均生存期不到1年，因此早期精确的诊断便显得尤为重要。
3.现有的子宫内膜癌的诊断主要依赖于诊断性刮宫进行组织病理学诊断，操作存在盲目性且有创伤，还容易遗漏微小的病灶，无法满足早期精准诊断的要求。此外，子宫内膜癌异质性显著，传统组织病理学评价可重复性较低，各肿瘤类型之间组织学特点常存在重叠，因此已经无法满足子宫内膜癌临床诊断与治疗的需要。而随着精准医疗的发展，根据患者特异生物分子（基因、蛋白等）特征实施的靶向治疗逐步成为研究热点，精准医疗也成为子宫内膜癌治疗的具有指导意义和广阔应用前景的新疗法。同时疾病的分类不再以传统病理为标准，而更加注重特异生物分子上的区别。
4.fbxo7是一种e3泛素连接酶，由522个氨基酸组成，蛋白大小约为62 kda。其研究显示主要功能为维持细胞内线粒体的稳态和蛋白质的泛素化降解。目前国内外还没有公开任何关于在子宫内膜癌中将fbxo7蛋白作为诊治标志物的相关研究报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供了一种与子宫内膜癌的患病率呈负相关的蛋白质fbxo7在制备子宫内膜癌诊断标志物中的应用。
6.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种蛋白质fbxo7在制备子宫内膜癌诊断标志物和/或治疗药物中的应用。
7.进一步，所述的蛋白质fbxo7突变体在制备子宫内膜癌诊断试剂中的应用。
8.进一步，所述的蛋白质fbxo7在制备子宫内膜癌精准靶向治疗药物中的应用。
9.一种线粒体分裂抑制剂mdivi-1在制备fbxo7蛋白低表达和/或突变的子宫内膜癌中的应用。
10.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了蛋白质fbxo7在制备子宫内膜癌诊断标志物和/或治疗药物中的应用。对免疫组织化学染色图片进行分析，通过2位病理科专业人员打分评价fbxo7蛋白在子宫内膜癌患者样本和正常样本中的表达，蛋白质fbxo7在子宫内膜癌中表达明显下调，可用于辅助诊断子宫内膜癌。用细胞功能实验来显示fbxo7蛋白差异表达和突变对子宫内膜癌发生的影响，并通过靶向fbxo7蛋白相关下游信号分子通路来对子宫内膜癌进行治疗。相对诊断性刮宫进行组织病理学诊断，本技术有利于子宫内膜癌的早期诊断并能针对此设计靶向治疗的手段。
附图说明
11.图1为免疫组化验证fbxo7蛋白在人子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中的表达情况。(a) 102例组织样本，包含子宫内膜癌组织97例与正常子宫内膜5例；选取fbxo7蛋白免疫组织化学染色的代表性图像（正常子宫内膜组织1例；子宫内膜癌组织2例；比例尺：20μm）；(b) 子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织免疫组化学染色结果评分（positive; low positive; negative）和统计堆积柱状图（*p《0.05）；图2为克隆形成实验验证fbxo7蛋白敲除对an3 ca细胞增殖能力的影响。(a) western blotting实验验证fbxo7蛋白敲除以及回补野生型fbxo7蛋白和子宫内膜癌来源的fbxo7突变体蛋白的an3 ca细胞稳定株的构建；(b) 克隆形成实验：敲除fbxo7蛋白的an3 ca细胞稳定株的增殖能力显著上升；而回补野生型fbxo7蛋白能逆转敲除fbxo7蛋白导致的细胞恶性表型，而回补子宫内膜癌来源的fbxo7突变体蛋白无法逆转；(c)克隆形成实验量化统计图（n.s:无统计学差异;*p《0.05）；图3为fbxo7蛋白对inf2蛋白的泛素化降解。(a) 野生型fbxo7蛋白能够对inf2蛋白进行降解; (b) 野生型fbxo7蛋白能够对inf2蛋白进行泛素化修饰; (c) 野生型fbxo7蛋白能够对inf2蛋白进行降解，而子宫内膜癌来源的fbxo7突变体则失去降解inf2蛋白的功能；图4为应用mdivi-1处理an3 ca野生型细胞株和敲除fbxo7蛋白的an3 ca细胞株。(a) western blotting检测mdivi-1处理后an3 ca细胞株蛋白表达变化，发现mdivi-1并不影响inf2、fbxo7和drp1的蛋白水平；(b) 克隆形成实验：mdivi-1显著抑制敲除fbxo7蛋白的an3 ca细胞稳定株的增殖能力；(c) 克隆形成实验量化统计图（*p《0.05）。
具体实施方式
12.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
13.一、实验方法1、子宫内膜癌组织样本免疫组织化学染色子宫内膜癌组织芯片购买于陕西爱维拉生物科技有限公司，包含97例子宫内膜癌组织样本和5例子宫内膜正常组织样本。
14.纳入标准：1.样本病理诊断明确，确诊为子宫内膜癌；2.患者未接受术前放、化疗治疗；3.患者既往无其他系统的恶性肿瘤。
15.本发明涉及的所有人体组织标本，均经过医学伦理的审核，只限实验室研究。(1) 抗原修复：将50
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的柠檬酸钠抗原修复液用去离子水稀释到1
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并摇晃均匀，将1
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柠檬酸钠抗原修复液倒进高压锅中，合上锅盖，待锅内液体沸腾，将装有切片的玻片架置于高压锅中，使柠檬酸钠抗原修复液完全浸没切片，旋紧锅盖，待高压锅气阀开始均匀冒气后开始计时，8 min后关闭电磁炉电源，结束加热。将高压锅置于流动自来水下降温，打开锅盖，使石蜡切片冷却至室温。(2) 洗涤：首先使用去离子水充分洗涤切片5 min，接着用pbs磷酸盐缓冲液洗涤切片3 min，重复洗涤3次。
(3) 封闭内源性过氧化物酶：将10%过氧化氢水溶液用去离子水稀释至3%浓度，每次现配现用，将石蜡切片放于湿盒内，在载玻片上组织所在位置滴加适量3%过氧化氢水溶液，合上湿盒的盖子，37℃封闭10 min。(4) 洗涤：用pbs磷酸盐缓冲液洗涤切片3 min
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3次，甩掉载玻片上的液体；(5) 血清封闭：洗涤后的切片摆放于湿盒内，每张切片上滴加适量10%驴血清封闭液，室温下封闭15 min后，甩掉切片上的封闭液；(6) 一抗孵育：擦净组织周围的封闭液，用免疫组织化学染色专用疏水笔围绕组织画圈，将切片置于湿盒内，滴加适当浓度的fbxo7抗体稀释液(抗体品牌：proteintech；货号：10696-1-ap；稀释比：1:100)，使抗体稀释液浸没组织，置于4℃冰箱避光过夜；(7) 洗涤：用pbs磷酸盐缓冲液洗涤切片3 min
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3次；(8) 二抗孵育：擦干组织周围的液体，在组织上滴加适当浓度的hrp标记驴抗兔二抗，使抗体完全覆盖组织，37℃湿盒避光孵育1 h；(9) 洗涤：用pbs磷酸盐缓冲液洗涤切片3 min
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3次； (10) dab显色：将dab显色液滴加到载玻片上组织所在位置，将载玻片置于倒置显微镜上观察组织染色情况，待染色强度达到最佳时甩掉显色液，使用去离子水洗涤3 min
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3次。(11) 苏木素复染：在载玻片上组织所在位置滴加适量改良lillie-mayer苏木素染液，染色2 min，甩掉染色液，将装有载玻片的玻片架置于流动自来水下洗涤10 min以返蓝。(12) 脱水：将装有切片的玻片架依次浸泡于75%乙醇溶液5 min
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1次；95%乙醇溶液中浸泡5 min
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1次；无水乙醇溶液中浸泡5 min
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3次； (13) 透明：将切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min
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2次； (14) 封片：在载玻片上组织所在位置滴加适量中性树胶，用镊子夹取一张盖玻片轻轻覆盖在载玻片上，置于通风橱中晾干成片； (15) 评分：将切片置于倒置显微镜上，依次在低倍镜、高倍镜下观察组织形态、细胞核染色、目的蛋白质染色情况等，2位专业病理科专业人员在不知情实验分组的情况下对图片进行打分。
16.2. fbxo7蛋白敲除以及回补野生型fbxo7蛋白和子宫内膜癌来源的fbxo7突变体蛋白的an3 ca细胞稳定株筛选和鉴定(1) 将cd513b-cas9-sgfbxo7质粒转染an3 ca细胞，48小时后将细胞消化成均匀的细胞悬液，计数细胞。取1块六孔板，将细胞悬液按每孔1000个细胞种植到六孔板； (2) 将六孔板放入恒温培养箱中培养10天，待肉眼可见细胞集落形成时，将单个细胞集落用胰酶消化后转移至24孔板中，置于恒温培养箱中继续培养，每孔单克隆细胞作为一组； (3) 待细胞均匀铺满24孔板后，按上述方法将每组细胞转移至12孔板，待细胞均匀铺满孔板后同法转移至6孔板，待细胞密度至80%，将六孔板中每组细胞按1传3进行传代至新的6孔板，置于恒温培养箱中继续培养；(4) 待细胞密度达80%时，每组细胞取一孔细胞进行western blotting鉴定；(5) 在fbxo7蛋白敲除的子宫内膜癌细胞株中瞬时转染回补野生型fbxo7蛋白和
子宫内膜癌来源的fbxo7突变体蛋白，用western blotting鉴定。
17.3、克隆形成实验(1) 取生长良好的an3 ca野生型细胞株，fbxo7蛋白敲除an3 ca细胞稳定株，将贴壁细胞消化成均匀细胞悬液，进行细胞计数；(2) 取数个6孔细胞板，每孔加入2
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103个细胞，每个处理组设置3个复孔，置于恒温培养箱，每3天换液一次，共培养10
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15天；(3) 当六孔板内肉眼可见细胞集落时，弃去孔内培养基，用pbs缓冲液润洗2次，每孔加入适量4%多聚甲醛固定细胞，放置30 min； (4) 弃去固定液，用pbs缓冲液润洗2次，向每孔加入800
ꢀµ
l 0.1%结晶紫染料，放于摇床上染色10 min，回收染料，用pbs缓冲液润洗3次，置于37℃烘箱过夜，待晾干后拍照并统计数据。
18.4、fbxo7蛋白对inf2蛋白的泛素化降解(1) 在hek293t细胞中瞬时转染flag-inf2重组蛋白质粒，在此基础上瞬时转染梯度递增的myc-fbxo7重组蛋白质粒，最后用western blotting检测到外源fbxo7蛋白水平与外源inf2蛋白水平呈现明显负相关；(2) 在hek293t细胞中瞬时转染flag-inf2、myc-fbxo7和ha-ub质粒，在收集细胞裂解液前8小时，使用mg132抑制inf2的泛素-蛋白酶体途径降解，而后使用富含 flag 抗体的商品化 m2 珠子免疫共沉淀inf2，最后western blotting 使用ha抗体检测到inf2被fbxo7泛素化修饰； (3) 在hek293t细胞中瞬时转染flag-inf2重组蛋白质粒，在此基础上瞬时转染梯度递增的myc-fbxo7野生型和子宫内膜癌来源突变体重组蛋白质粒，最后用western blotting检测到子宫内膜癌来源的fbxo7突变体无法降解inf2。
19.5、mdivi-1药物治疗取生长良好的an3 ca野生型细胞株，fbxo7蛋白敲除an3 ca细胞稳定株，行克隆形成实验。mdivi-1溶解于dmem高糖完全培养基中，最终浓度为1μm。待克隆形成铺板的细胞贴壁，将培养基更换为含有单纯dmso（mdivi-1的初始溶剂，排除溶剂毒性干扰）的dmem高糖完全培养基和含有mdivi-1的dmem高糖完全培养基，每3天换液一次，共培养10
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15天。观察mdivi-1对敲除fbxo7蛋白的子宫内膜癌细胞稳定株增殖能力的影响。
20.二、实验结果分析本发明确保实验数据的完整、准确、无误。免疫组织化学图片经由2位专业病理科专业人员在不知情实验分组的情况下对图片进行打分，打分的结果经由graphpad prism软件进行作图并分析，所有数据统计检验均取双侧概率，按照α=0.05的检验水准进行统计检验，若p《0.05，即认为两组间的差异有统计学意义，反之则认为差异无统计学意义。克隆形成实验结果经由image j软件进行分析，分析结果经由graphpad prism软件进行作图并分析，所有数据统计检验均取双侧概率，按照α=0.05的检验水准进行统计检验，若p《0.05，即认为两组间的差异有统计学意义，反之则认为差异无统计学意义。
21.我们发现在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中，fbxo7蛋白在子宫内膜癌组织中的表达显著低于正常子宫内膜组织，fbxo7蛋白在正常子宫内膜组织中的弱阳性率为80% (4/5)，阳性率为20%(1/5)；在子宫内膜癌组织中，阴性率为62.8% (61/97)，弱阳性率
为37.2% (36/97)（图1 a, b；*p《0.05）。
22.克隆形成实验显示，与野生型an3 ca细胞相比，敲除fbxo7蛋白的细胞克隆集落的数量明显增加。这些结果提示均提示检测fbxo7蛋白质的相对表达对子宫内膜癌的诊断具有较高价值（图2a, b, c；*p《0.05）。
23.同时我们发现野生型fbxo7蛋白对inf2蛋白进行泛素化降解，而子宫内膜癌来源的fbxo7蛋白则无法降解inf2蛋白(图3a, b, c)，inf2蛋白在线粒体分裂起始阶段招募drp1，随后引发线粒体分裂，因此我们猜测fbxo7可能通过抑制线粒体分裂来抑制子宫内膜癌的发生，而子宫内膜癌患者体内异常降低或者突变的fbxo7蛋白可能导致细胞内线粒体分裂的亢进。
24.为此本发明应用线粒体分裂抑制剂mdivi-1治疗fbxo7蛋白低表达或者突变的子宫内膜癌，发现mdivi-1显著抑制了敲除fbxo7蛋白的an3 ca细胞稳定株的增殖能力（图4 a, b, c; *p《0.05），提示mdivi-1在精准靶向治疗fbxo7蛋白低表达或者突变的子宫内膜癌的可行性。
25.该发明通过检测fbxo7蛋白在子宫内膜癌中的差异表达，和敲除fbxo7蛋白的an3 ca细胞株的克隆形成实验，证明fbxo7蛋白作为子宫内膜癌诊断标志物的可行性。并通过发现fbxo7的下游信号分子通路，将fbxo7蛋白应用于子宫内膜癌的精准靶向治疗。
26.上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。