牛支原体SBP-2单克隆抗体制备及其应用

牛支原体sbp-2单克隆抗体制备及其应用
技术领域
1.本技术涉及病原体检测领域，尤其涉及一种牛支原体sbp-2单克隆抗体制备及其应用。


背景技术：

2.牛支原体是世界范围内引起牛呼吸道疾病、中耳炎、关节炎、乳腺炎等多种疾病的病原体，它对奶牛和肉牛的健康、福利和生产力具有重要影响。
3.对于牛支原体的常用检测方法，比如pcr、荧光定量pcr、rpa、建立间接elisa等检测方法，大多需要依赖实验室的条件才能进行，对仪器设备要求较高，专业性较强，其局限性导致使用场景受限且效率不高。
4.为了解决常用牛支原体检测方法使用场景受限的问题，需要一种新的检测方法，具有快速、高效、便捷等优点，适合临床检测牛支原体使用。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种牛支原体sbp-2胶体金检测试纸，具有快速、高效、便捷等优点，适合临床检测牛支原体使用，解决了常用牛支原体检测方法使用场景受限的问题。
6.本技术保护的一种牛支原体sbp-2胶体金检测试纸，包括样品垫、金标垫、nc膜、吸水垫和pvc胶板，其中，样品垫、金标垫、nc膜、吸水垫依次搭接，固定在pvc胶板上，所述金标垫表面均匀设置金标抗体，所述金标抗体中包括sbp-2蛋白单克隆抗体，所述nc膜靠近样品垫的一端设置一条t线，远离样品垫的另一端设置一条c线。
7.可选的，所述金标抗体的结合ph为8.0。
8.可选的，所述金标抗体中sbp-2蛋白单克隆抗体的标记浓度为40μg/ml，在抗体含量为40μg/ml时，波长525nm处出现最高波峰，标记的抗体含量较少时，发现胶体金出现不同程度的聚集情况。
9.可选的，所述t线是t液在nc膜上画的一条线，所述t液包括pb缓冲液和纯化sbp-2蛋白单克隆抗体，如果存在病原体，肉眼可以观察到t线出现红色条带。
10.可选的，所述c线是c液在nc膜上画的一条线，所述c液包括pb缓冲液和纯化蛋白a，蛋白a能够与各种抗原都结合，设置c线作为质检线。
11.可选的，所述nc膜的孔径为0.1μm，膜的孔径对蛋白的吸附不同，孔径越小所吸附的蛋白越多。
12.本技术保护了一种单克隆抗体的制备方法，制备上述牛支原体sbp-2胶体金检测试纸中的sbp-2蛋白单克隆抗体，包括：
13.以原核表达纯化后的sbp-2蛋白为免疫原，对雌性小鼠进行多次免疫，得到阳性小鼠，所述sbp-2蛋白来源于一种大肠杆菌，所述大肠杆菌保藏号为cgmccno:23133；
14.取阳性小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；
15.所述的杂交瘤细胞进行二次筛选和第二次克隆后，得到稳定分泌异性抗体的杂交
瘤细胞，所述二次筛选分别是elisa检测方法初筛和western blot复检；
16.腹腔注射所述稳定分泌异性抗体的杂交瘤细胞，采集腹水，得到所述sbp-2蛋白单克隆抗体。
17.可选的，所述sbp-2蛋白单克隆抗体是igg1亚类。
18.可选的，所述对雌性小鼠进行多次免疫，得到阳性小鼠的步骤中，还包括：
19.取200μg抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，在小鼠的颈部、腹部、脚掌等皮下部位进行多点注射进行首次免疫，得到首次免疫小鼠；
20.在首次免疫后2周，取100μg抗原与等体积的弗氏不完全佐剂完全乳化后，在所述首次免疫小鼠的颈部、腹部、脚掌等皮下部位进行多点注射进行二次免疫，得到二次免疫小鼠；
21.在二次免疫后2周，取100μg抗原与等体积的弗氏不完全佐剂完全乳化后，在所述二次免疫小鼠的颈部、腹部、脚掌等皮下部位进行多点注射进行三次免疫，得到三次免疫小鼠；
22.在三次免疫后1周，剪所述三次免疫小鼠的尾尖采血50μl左右，37℃恒温培养箱中静置1h后，4℃过夜，3000r/min离心30min分离血清，取适量血清用elisa方法检测小鼠抗体效价，得到抗体效价高的小鼠；
23.取不加任何佐剂的400μg抗原腹腔注射所述抗体效价高的小鼠，得到阳性小鼠。
24.免疫使用4～5周龄的balb/c雌性小鼠，选择与小鼠骨髓瘤细胞同种系的balb/c 小鼠，可以排除不同种系的干扰因素，雄性小鼠体内激素水平较稳定，产生的抗体比雌性小鼠高，与雄性小鼠相比，雌性小鼠性格较温顺，通常不会打斗，不同窝的雌性小鼠容易群养，抓持方便，且抗体在体内保持的时间比雄性小鼠保持的时间长，因此制备单克隆抗体选择雌性小鼠。4～5周龄的小鼠较活泼，脾脏内杂质少，免疫结束后小鼠的脾脏纤维化程度不高，由于单克隆抗体制备过程中，免疫周期长，因此选择周龄更小的鼠可降低分离脾细胞时脾脏纤维化的程度，细胞融合成功率高。
25.可选的，所述将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞步骤中，还包括：
26.取洗涤后的小鼠骨髓瘤细胞与所述脾细胞按1:10～1:5的比例混合，用不完全培养液洗涤1次后，1200rpm离心8min，弃上清，用不完全培养培养基重悬细胞，1000rpm 离心10min，弃上清，得到混合细胞。
27.在37℃的水浴中，1min内向所述混合细胞中加入预热的1ml 50％peg溶液，边加边缓慢搅拌，持续搅动90s，然后在5min内加入8ml提前预热好的不完全培养液，以每分钟内分别加入1ml、1ml、1.5ml、1.5ml和3ml的速度沿离心管壁缓慢加入，静置10min，补加不完全培养液至40ml，800rpm离心6min，弃上清，沿管壁加入少量完全培养液混匀，再加入完全培养基混匀，得到融合细胞；在加入融合剂的过程中，需要缓慢的加入，边加边搅拌，搅拌的速度不可太快，防止细胞在融合因外力而分离。
28.将所述融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96空中，每孔200μl，37℃、5％co2的细胞培养箱内培养，得到杂交瘤细胞。
29.本技术保护了一种检测试纸的使用方法，使用上述的胶体金检测试纸，包括：
30.将检测样品滴在样品垫上，得到所述试纸nc膜上显示的检测结果；
31.如果所述检测结果显示t线出现红色条带，c线也出现红色条带，则说明检测样品中有牛支原体抗原；
32.如果所述检测结果显示c线出现红色条带，则说明检测样品中没有牛支原体抗原。
附图说明
33.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1胶体金试纸条模型；
35.图2胶体金的吸光值；
36.图3不同ph值标记抗体的吸光值结果；
37.图4不同浓度抗体标记的吸光值结果；
38.图5胶体金敏感性结果；
39.图6单克隆细胞集落图片(40
×
)；
40.图7小鼠骨髓瘤细胞与杂交瘤细胞图(40
×
)。
具体实施方式
41.下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本技术相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本技术的一些方面相一致的系统和方法的示例。
42.实施例1：牛支原体sbp-2胶体金检测试纸
43.1.1材料
44.1.1.1菌株及临床样本来源
45.菌株：m.bovis pg45(atcc 25523)，为宁夏大学农学院兽医实验室保存。大肠杆菌 (atcc 21320)、金黄色葡萄球菌(atcc 4012)、无乳链球菌(atcc 51487)、肺炎链球菌(atcc 6303)、肺炎克雷伯菌(atcc 9590)、溶血曼海姆菌(atcc 33396)、枯草芽孢杆菌(atcc 39090)以及临床样本，均由宁夏农林科学院动物科学研究所保存，sbp
‑ꢀ
2蛋白相应的基因核苷酸序列参照专利《一种牛支原体蛋白sbp-2及其应用》(申请号： 202111109156.x)中公开的核苷酸序列。
46.临床样本：67份牛鼻拭子，为宁夏农林科学院动物科学研究所保存。
47.1.1.2主要试剂及仪器
48.表1主要试剂、试剂盒及其生产厂家
[0049][0050]
1.1.3主要试剂的配制
[0051]
(1)10％氯金酸溶液：取1g氯金酸粉末，溶于8ml超纯水中，最终定容至10ml，置于4℃冰箱避光保存。
[0052]
(2)10％柠檬酸三钠溶液：称取1.139g柠檬酸三钠固体，加入5ml超纯水，最终定容至10ml，现配现用。
[0053]
(3)重悬液：称取20g蔗糖和10g bsa，加入10ml tritionx-100，1mol/l tris-hcl 80ml，用超纯水定容至100ml，4℃保存。
[0054]
(4)封闭液：称取10g脱脂羊奶粉加入50ml超纯水中，最终定容至100ml，置于 4℃冰箱储存。
[0055]
(5)处理垫溶液：取160μl 2％蔗糖溶液和400μl 1mol/l tris-hcl(ph 7.4)混匀，加入超纯水定容至120ml。
[0056]
(6)0.1mol/l k2co3：称取0.276g k2co3固体，加入10ml蒸馏水充分溶解，定容至20ml，置于4℃冰箱保存。
[0057]
(7)10％bsa溶液：称取10g bsa加入50ml超纯水中，最终定容至100ml，置于 4℃冰箱保存。
[0058]
(8)2％蔗糖溶液：称取2g蔗糖，加入90ml超纯水中溶解，定容至100ml，置于 4℃冰箱保存。
[0059]
1.2方法
[0060]
1.2.1胶体金的制备
[0061]
用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。锥形瓶内加入100ml超纯水，缓慢加入280μl10％氯金酸溶液后开始加热，沸腾后计时2min后，快速的加入320μl 10％柠檬酸三钠溶液，加热搅拌至溶液变为葡萄酒红色后，继续加热一分钟后停止加热，搅拌至室温，取适量制备好的胶体金溶液紫外分光光度计扫描，最终吸光值用excel软件和graphpadprism 7软件进行数据收集与处理，选择λ510～530nm左右有最高吸收波峰的胶体金溶液，用于后续试验。
[0062]
1.2.2金标抗体的制备与优化
[0063]
1.2.2.1金标抗体结合的最适ph
[0064]
取1.0ml胶体金溶液，以0.1mol/l k2co3溶液调节ph，静置10min后1500r/min 离心30min，取上清进行紫外分光光度计扫描，吸光值用excel软件和graphpad prism7软件进行数据收集与处理，吸光度值最高的胶体金混合溶液作为金标抗体最佳结合ph 值。
[0065]
1.2.2.2最小抗体标记量
[0066]
将胶体金调节至最适ph，0.1mol/l pb(ph 7.4)缓冲液将sbp-2单克隆抗体配制成不同的浓度，使抗体终浓度依次为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml 共5个梯度，各取100μl加入到1.0ml胶体金溶液中，室温下静置10min后用紫外分光光度计扫描，结果用excel软件和graphpad prism 7软件进行数据收集与处理，以此判断最小抗体标记量。
[0067]
1.2.3胶体金免疫层析试纸条的构建
[0068]
1.2.3.1试纸条模型的构建
[0069]
免疫层析试纸条主要是由样品垫、金标垫、nc膜和吸水垫组成，各组分的宽度和长度由pvc胶板来决定。胶体金试纸条模型如图1所示。
[0070]
1.2.3.2试纸条nc膜的制备
[0071]
t液、c液的配制：用pb缓冲液将纯化sbp-2单克隆抗体和蛋白a稀释到相应浓度，分别作为t液和c液。
[0072]
1.2.3.3试纸条金标垫的制备
[0073]
先将金标垫完全浸没于处理液体中15min，然后置于37℃恒温箱中干燥3h备用。将金标抗体溶液均匀喷涂于已处理好的金标垫上，置于至37～40℃鼓风干燥箱中3h，待其完全干燥后切条备用。
[0074]
1.2.3.4样品垫和吸水垫的制备
[0075]
选择玻璃纤维素膜作为样品垫，用样品垫处理液处理过后，37℃干燥后备用。吸水垫采用吸水性能较好的吸水滤纸材料，裁剪成合适尺寸干燥后备用。
[0076]
1.2.4胶体金免疫层析试纸条性能鉴定
[0077]
1.2.4.1试纸条灵敏性测定
[0078]
用pbs溶液(ph 7.4)将牛支原体标准菌株的菌液按10倍稀释配制成1
×
108～1
×ꢀ
103cfu/ml浓度的溶液，共6个梯度，然后用所制备的试纸条进行测定，每个浓度重复 3次，肉眼观察试纸条t线出现的最低浓度为试纸条所能达到的最低检测限。
[0079]
1.2.4.2试纸条特异性鉴定
[0080]
分别配制1
×
106cfu/ml的大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯、无乳链球菌、溶血曼海姆氏菌、枯草芽孢杆菌、牛支原体，并用试纸条进行测定，重复3 次，观察结果，判断其特异性。
[0081]
1.2.4.3稳定性试验
[0082]
将制备好的同一批次与不同批次间的试纸条同时放置于50℃干燥箱内，在1、3、5、 7、9周时分别用1
×
108cfu/ml、1
×
106cfu/ml、1
×
105cfu/ml的牛支原体溶液进行检测，将检测条带与0周的条带作比较。
[0083]
1.2.5临床样本的检测
[0084]
用试纸条和pcr的方法同时检测67份临床样品，以此来评价试纸条的临床应用效果。
[0085]
1.3结果
[0086]
1.3.1胶体金制备结果
[0087]
制备的胶体金溶液眼观颜色如葡萄酒一般，胶体金的吸光值如图2所示，在λ 510～550nm左右有最大吸收峰，波峰较窄，说明胶体金颗粒均匀，大小在20～40nm之间。
[0088]
1.3.2金标抗体的制备与优化结果
[0089]
1.3.2.1金标抗体的最适ph结果
[0090]
不同ph值标记抗体后的吸光值结果如图3所述，金标抗体在ph 7.5与ph 8.0时，吸光值最高，因此选择ph 8.0为胶体金最佳结合ph。
[0091]
1.3.2.2金标抗体最小抗体标记量结果
[0092]
不同浓度抗体标记后的吸光值就结果如图4所示，在抗体含量为40μg/ml时，λ525 nm处出现最高波峰，标记的抗体含量较少时，发现胶体金出现不同程度的聚集情况。
[0093]
1.3.3胶体金免疫层析试纸条性能检测结果
[0094]
1.3.3.1灵敏性试验结果
[0095]
不同浓度的牛支原体检测结果如图5所示，通过肉眼观察判断t线出现红色条带，试纸条所能达到的最低检测限为1
×
105cfu/ml。
[0096]
1.3.3.2特异性试验结果
[0097]
试纸条对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯、溶血曼海姆氏菌、枯草芽孢杆菌均为检测出阴性，仅有牛支原体检测出阳性，三次结果一致，该试纸条的特异性结果较好。
[0098]
1.3.3.3稳定性试验结果
[0099]
稳定性试验结果中，在1、3、5、7、9周时最低检测限都均为1
×
105cfu/ml，但是 9周颜色较0周颜色浅，说明胶体金的稳定性较好，同一批次与不同批次间的结果一致，说明试纸条的批内和批间的稳定性较好。
[0100]
1.3.4临床样本的检测结果
[0101]
用同一批次的试纸条检测67份临床样本，检测结果如表2所示。最终有46份与pcr 结果一致，符合率为97.01％，其中阳性符合率为96.23％，阴性符合率为100％。
[0102]
表2临床样本检测结果
[0103][0104]
实施例2：牛支原体sbp-2蛋白单克隆抗体制备
[0105]
2.1材料
[0106]
2.1.1动物、细胞系及抗原来源
[0107]
动物：4～5周龄spf级balb/c雌性小鼠，购自宁夏医科大学实验动物中心；
[0108]
细胞系：小鼠骨髓瘤细胞(sp 2/0)，购自湖南丰晖生物科技有限公司；
[0109]
抗原来源：一种大肠杆菌，所述大肠杆菌包含如权利要求3所述的重组质粒，所述大肠杆菌保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，保藏日期为2021年8月9日，保藏号为 cgmcc no:23133。
[0110]
2.1.2主要试剂及仪器
[0111]
表3主要试剂、试剂盒及其生产厂家
[0112][0113]
2.1.3主要试剂的配制
[0114]
(1)完全培养基：取5ml胎牛血清和500μl青链霉素混合液，补加prmi 1640培养基至50ml。
[0115]
(2)不完全培养基：不含有胎牛血清的prmi 1640培养基。
[0116]
(3)hat培养基：吸取1ml 50
×
hat培养基补充物，5ml胎牛血清和500μl青链霉素混合液补加prmi 1640培养基至50ml。
[0117]
(4)ht培养基：吸取1ml 50
×
ht培养基补充物，5ml胎牛血清和500μl青链霉素混合液补加prmi 1640培养基至50ml。
[0118]
2.2方法
[0119]
2.2.1动物免疫
[0120]
取10只spf级的4～5周龄雌性balb/c小鼠，按照表4中的小鼠免疫程序进行抗原免疫。首次免疫取200μg抗原与等体积的弗氏完全佐剂(freund’s complete adjuvant, fca)充分乳化后，颈部、腹部、脚掌等皮下部位进行多点注射。首次免疫后2周进行第二次免疫，取100μg抗原与等体积的弗氏不完全佐剂(freund’s incomplete adjuvant,fia) 完全乳化后，在小鼠的颈部、腹部、脚掌等皮下部位进行多点注射；第二次免疫后2周第三次免疫，免疫方式同第二次免疫。三次免疫后一周，剪尾尖采血50μl左右，37℃恒温培养箱中静置1h后，4℃过夜，3 000r/min离心30min分离血清，取适量血清用 elisa方法检测小鼠抗体效价。选择抗体效价高的小鼠进行第四次加强免疫，取不加任何佐剂的400μg抗原腹腔注射。
[0121]
表4小鼠免疫程序
[0122][0123]
2.2.2小鼠骨髓瘤细胞的复苏、培养及传代
[0124]
在细胞融合的前30～35d，从液氮罐中快速取出冻存的骨髓瘤细胞，放入37℃水浴
锅中不断晃动，溶解后用将细胞全部转移到完全培养基中，1 000rpm离心5min，弃去上清液，将细胞沉淀用完全培养基重悬，并转移到t25细胞培养瓶中，37℃、5％co2细胞培养箱中培养。细胞正常生长状态下，一般2d换一次培养基，待细胞生长至80～95％时，可进行传代。
[0125]
为了保证细胞融合成功率，在细胞融合前，sp 2/0至少要传代30d，细胞形态透亮，周围比较光滑，细胞达到最佳生长状态才能进行细胞融合。融合之前，用不完全培养基悬浮需要进行细胞融合的sp 2/0，取出少量进行计数。
[0126]
2.2.3饲养层细胞的制备
[0127]
融合之前，将饲养细胞均匀铺在96孔板的每个孔中，具体操作如下：
[0128]
(1)取一只6～10周龄的健康balb/c小鼠，摘眼球采血，收集血液用于阴性对照；处死后将小鼠浸泡于75％乙醇中15min；
[0129]
(2)在超净工作台内将小鼠仰面固定，使用无菌手术剪剪开腹部皮肤，暴露腹膜；
[0130]
(3)用10ml无菌注射器吸取4～5ml不完全培养液注入腹腔；
[0131]
(4)轻揉腹部，可左右轻轻晃动小鼠腹部，用注射器吸出腹腔内液体；
[0132]
(5)放入离心管，1 200rpm离心6min；
[0133]
(6)用完全培养基混悬，调整细胞数1
×
105个/ml，加入96孔板中，每孔100μl；
[0134]
(7)将培养板放入37℃、5％co2及饱和湿度的细胞培养箱内培养。
[0135]
2.2.4脾细胞的制备
[0136]
取阳性小鼠眼球采血，收集血液作为阳性对照。将小鼠处死后浸泡于75％乙醇中15 min；
[0137]
(1)将小鼠转移至超净工作台中，用固定板固定小鼠，用高压灭菌后的剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹部；
[0138]
(2)更换一套新的手术器械，用剪刀剪开腹膜；
[0139]
(3)找到小鼠的脾脏并摘除，用剪刀将脾脏周围多余的组织剪除，用不完全培养液清洗脾脏3遍以上，弃掉废液；
[0140]
(4)用剪刀将脾脏剪成小块，放入高压灭菌后的组织研磨器中进行研磨；用20ml不完全培养液悬浮脾细胞，将细胞悬液滴加在200目尼龙筛网上过滤；
[0141]
(5)将过滤后的细胞悬液转移至50ml离心管中，1 000rpm离心10min；
[0142]
(6)小心的弃去上清，用不完全培养液将脾细胞重复洗涤并离心，细胞沉淀用少量不完全培养基重悬，取少量脾细胞计数。
[0143]
2.2.5细胞融合
[0144]
(1)取生长状态良好的sp 2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次；
[0145]
(2)将sp 2/0与脾细胞按1：10～1：5的比例混合在一起，在50ml离心管内用不完全培养液洗涤1次，1200rpm离心8min；
[0146]
(3)尽可能的吸净液体，用不完全培养基再次重悬细胞，1000rpm离心10min；
[0147]
(4)吸净液体，尽量只剩细胞沉淀，轻轻弹击离心管底部，使细胞沉淀略加松动；
[0148]
(5)37℃水浴下融合，1min内缓慢加入预热的1ml 50％peg溶液，边加边缓慢搅拌，持续搅动90s，然后在5min内加入8ml提前预热好的不完全培养液，以每分钟内分别加入1ml，1ml，1.5ml，1.5ml，3ml的速度沿离心管壁缓慢加入，避免剧烈晃动；
[0149]
(6)静置10min，补加不完全培养液至40ml，800rpm离心6min；
[0150]
(7)小心的吸掉上清，沿管壁缓慢加入少量完全培养液缓缓混匀，然后再加入适量完全培养基混匀，所有过程切记不能用力吹打；
[0151]
(8)将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔中，每孔200μl，37℃、5％co2 的细胞培养箱内培养。
[0152]
2.2.6融合细胞的观察及换液
[0153]
融合后应该每天观察细胞生长情况，做好标记和记录。一般选择hat选择培养液维持培养两周后，改用ht培养液维持培养两周，再改用一般培养液或者一直维持ht培养。
[0154]
2.2.7阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆
[0155]
检测杂交瘤细胞首先用elisa检测方法初筛，再用western blot复检，筛选最少重复两次均为阳性方可。
[0156]
一般在杂交瘤细胞布满细胞孔10％左右时，可以开始检测sbp-2抗体，将阳性杂交瘤细胞立即全部转入24孔板培养，细胞状态良好即可进行克隆化。
[0157]
克隆化操作过程如下：
[0158]
(1)按照2.2.3中的方法制备饲养层细胞，用ht培养基接种到96孔板，每孔100 μl；
[0159]
(2)阳性杂交瘤细胞计数，调整细胞数在5～10个/ml，每孔100μl；
[0160]
(3)培养4～5天后，补加完全培养液至每孔200μl；
[0161]
(4)培养一周后，细胞长满细胞孔底的三分之一时进行抗体检测；
[0162]
(5)再筛选阳性杂交瘤细胞孔转入24孔板进行第二次克隆；直到获得的所有亚克隆检测全部为阳性，说明得到了分泌sbp-2抗体的单克隆细胞。
[0163]
2.2.8杂交瘤细胞的冻存与复苏
[0164]
冻存细胞需提前预冷快速细胞冻存液，按照操作说明书的方法冻存杂交瘤细胞，每只冻存管中冻存的细胞数目应在1
×
106个以上，冻存于-80℃冰箱中。冻存的杂交瘤细胞需要定期复苏，检查杂交瘤细胞的活性和分泌抗体的稳定性。
[0165]
需要复苏冻存的杂交瘤细胞时，将冻存管从冰箱中取出，在38～40℃水浴中迅速融化，然后将细胞移至含有预热的完全培养液中，1 000rpm离心5min，弃去上清，加入新的完全培养液培养。
[0166]
2.2.9单克隆抗体腹水的制备
[0167]
取6～8周龄的balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml高压灭菌的液体石蜡。待腹部胀大后注射1
×
106个杂交瘤细胞(0.2ml/只)，小鼠腹部明显胀大即可吸取腹水，可多次采集腹水。将腹水12 000rpm离心5min，取上清保存于-20℃。
[0168]
2.2.10单克隆抗体的纯化
[0169]
按照亲和抗体纯化试剂盒的操作方法进行抗体纯化，收集的抗体用间接elisa检测方法检测抗体效价。
[0170]
2.2.11单克隆抗体的鉴定
[0171]
2.2.11.1杂交瘤细胞的亚型鉴定
[0172]
采用小鼠单抗ig类/亚类/亚型鉴定用elisa试剂盒对杂交瘤细胞进行亚型鉴定。
[0173]
2.2.11.2单克隆抗体的特异性鉴定
[0174]
本研究采用免疫印迹法(western blot)鉴定抗体的特异性。
[0175]
2.3结果
[0176]
2.3.1动物免疫血清抗体效价检测结果
[0177]
小鼠免疫三次后7d，用elisa的方法检测血清抗体效价，结果如下表5所示，最终选择效价最高的两只小鼠，即2号和5号小鼠，进行第四次加强免疫。
[0178]
表5免疫小鼠血清抗体效价elisa检测结果
[0179][0180]
2.3.2阳性杂交瘤细胞的观察结果
[0181]
细胞融合后，融合成功的细胞在倒置显微镜下会看到细胞团簇，单克隆细胞集落图如图6所示。融合前后杂交瘤细胞的变化如图7所示，细胞融合前后均为圆形，贴壁或悬浮生长，但融合后的杂交瘤细胞较sp 2/0细胞直径较大。
[0182]
2.3.3杂交瘤细胞的鉴定结果
[0183]
二次亚克隆后共有156孔为单克隆孔，待单克隆的杂交瘤细胞铺满孔底的三分之一或细胞培养液变黄时，吸取细胞培养液上清，按照elisa方法进行检测，结果如图6所示。
[0184]
表6三次亚克隆后细胞上清od450值
[0185][0186]
2.3.4单克隆抗体的鉴定结果
[0187]
2.3.4.1杂交瘤细胞的亚型鉴定
[0188]
经亚克隆的筛选，最终得到了1株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，吸取杂交瘤细胞的培养上清液，用小鼠单抗ig类/亚类/亚型鉴定用elisa试剂盒进行亚型鉴定，按照说明书的操作步骤进行，最终鉴定为igg1亚类。
[0189]
2.3.4.2单克隆抗体的western-blot结果
[0190]
单克隆抗体western blot结果显示，筛选出的单克隆抗体与牛支原体sbp-2蛋白有特异性反应条带。elisa方法测得小鼠腹水的抗体效价为128000。
[0191]
本技术提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本技术总的构思下的几个示例，并不构成本技术保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本技术方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本技术的保护范围。