一种具有成像指引杀菌功能的新型自组装长余辉探针及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种具有成像指引杀菌功能的新型自组装长余辉探针及其制备方法和应用，属于先进功能材料和生物医药技术领域。


背景技术：

2.由细菌感染引起的疾病一直被认为是对人类健康的严重威胁，虽然抗生素的出现很大程度上降低了细菌感染导致的死亡率，但是抗生素的大量使用甚至滥用导致耐药细菌的产生，耐药细菌的产生又催使更多抗生素的使用，从而产生一个恶性循环。而新型抗生素的研究速度远赶不上耐药细菌产生的速度，因此研究和开发不会使细菌产生耐药性的新型抗菌剂尤为重要。
3.纳米技术的快速发展为抗菌治疗提供了有效的方案。与传统抗生素相比，纳米材料因其独特的理化性质不容易引起细菌耐药性，抗菌纳米材料可被视为抗生素的替代候选物。但抗菌纳米材料在应用中存在容易在肝脏等内皮网状系统聚集、有局部毒性和循环半衰期短等问题。因此，研究开发一种具有高效抗菌活性、良好生物相容性和环境友好型的新型抗菌剂非常重要。


技术实现要素：

4.[技术问题]
[0005]
大尺寸长余辉纳米材料在内皮网状系统聚集多，而小尺寸长余辉纳米材料存在代谢快，病灶部位聚集少的问题。
[0006]
[技术方案]
[0007]
为了解决上述问题，本发明基于热分解法和配体交换制备了一种特异靶向性、可在细菌感染部位自组装的具有成像指引杀菌功能的长余辉探针，其克服和解决了大尺寸长余辉纳米材料在内皮网状系统聚集多，而小尺寸长余辉纳米材料代谢快，病灶部位聚集少的问题。
[0008]
本发明的第一个目的是提供一种制备具有成像指引杀菌功能的长余辉探针的方法，包括如下步骤：
[0009]
(1)基于乙酰丙酮的热分解法，在油相环境中制备得到表面带油酸配体的小尺寸长余辉纳米材料plnp-oa；
[0010]
(2)将小尺寸长余辉纳米材料plnp-oa、磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺dspe-peg-mal、磷脂-聚乙二醇-二硫吡啶dspe-peg-opss溶于溶剂中，分散均匀，之后进行配体交换反应；反应结束后，去除溶剂，离心洗涤、干燥，得到所述的具有成像指引杀菌功能的长余辉探针plnp-mal/opss。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的小尺寸长余辉纳米材料的制备方法包括如下步骤：
[0012]
将乙酰丙酮锌、乙酰丙酮镓和乙酰丙酮铬溶解在十八烯和油酸的混合溶液中，80℃下搅拌至完全溶解后冷却至40-50℃；然后加入无水甲醇，充分搅拌，得到反应液；之后将反应液在220℃下反应24小时；反应结束后，离心洗涤、干燥，得到小尺寸长余辉纳米材料plnp-oa；
[0013]
其中，乙酰丙酮锌、乙酰丙酮镓和乙酰丙酮铬的质量比为358：734：1.396；混合溶液中十八烯和油酸的体积比为5：4；乙酰丙酮锌和混合溶液的用量比为0.358g：90ml；80℃是采用油浴加热；无水甲醇和混合溶液的体积比为1：9；反应液需要转移入衬有特氟隆的不锈钢高压釜中才能进行反应；离心洗涤是用环己烷/无水乙醇(1:1，v:v)离心洗涤5次，再用无水乙醇离心洗涤1次；干燥是在室温环境中真空干燥。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的小尺寸长余辉纳米材料plnp-oa、磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺dspe-peg-mal、磷脂-聚乙二醇-二硫吡啶dspe-peg-opss的质量比为1：0.5：0.5。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的溶剂为chcl3。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的小尺寸长余辉纳米材料plnp-oa和溶剂的用量比为10mg：5ml。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的分散均匀是采用超声分散。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的配体交换反应是60℃下反应8-12小时。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的去除溶剂是通过缓慢加入水，70℃真空旋蒸去除溶剂。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的离心洗涤是用无水乙醇离心洗涤2次，再用水离心洗涤1次。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的干燥是冷冻干燥。
[0022]
本发明的第二个目的是利用本发明所述的方法制备得到具有成像指引杀菌功能的长余辉探针plnp-mal/opss。
[0023]
本发明的第三个目的是本发明所述的具有成像指引杀菌功能的长余辉探针plnp-mal/opss在生物成像、生物检测中的应用。
[0024]
本发明的第四个目的是提供一种抗菌剂，其采用了本发明所述的具有成像指引杀菌功能的长余辉探针plnp-mal/opss。
[0025]
[有益效果]
[0026]
(1)本发明采用小尺寸长余辉纳米材料，通过配体交换使长余辉纳米材料表面同时带有马来酰亚胺(mal)和二硫吡啶(opss)配体，这两种配体可以使小尺寸长余辉纳米材料在细菌感染部位自组装成团簇，增大对细菌膜的表面张力，从而中断细菌与宿主间的可逆反应，将细菌锚定在宿主表面。
[0027]
(2)本发明制备的具有成像指引杀菌功能的长余辉探针plnp-mal/opss表面二硫吡啶与细菌表面黏附素中的游离硫醇反应形成分子间二硫键，探针表面的马来酰亚胺与细菌表面黏附素中的游离硫醇发生不可逆的迈克尔加成反应，均导致细菌黏附素上硫酯键与宿主表面配体的可逆反应中断，细菌被锚定在宿主表面，从而中止细菌的逃逸和繁殖。
[0028]
(3)本发明制备的具有成像指引杀菌功能的长余辉探针plnp-mal/opss探针表面
二硫吡啶的二硫键断裂，与其他探针表面的马来酰亚胺或二硫吡啶反应，得到或-s-s-，探针在细菌表面由单个纳米颗粒自组装成团簇，改变细菌膜表面受到的拉伸，增大对膜的表面张力，使膜破裂，进而导致细菌死亡。
[0029]
(4)本发明制备的具有成像指引杀菌功能的长余辉探针plnp-mal/opss利用表面配体可以阻止细菌在体内的逃逸和繁殖，将细菌锚定在宿主表面，减少了细菌感染其他部位的可能；探针附着在细菌表面后与其他游离探针自组装成大的团簇包裹在细菌表面，增大对膜的表面张力，使膜破裂，从而导致细菌死亡，而在未染菌部位因其长余辉材料尺寸小，能较快代谢；而且探针靶向至细菌感染部位并自组装后，可以通过长余辉材料的独特发光特性，在细菌感染部位达到成像效果，从而实现诊疗目的。
附图说明
[0030]
图1：实施例1所制备的plnp-oa和plnp-mal/opss的红外光谱图；
[0031]
图2：实施例1所制备的plnp-oa和plnp-mal/opss的磷光发射图；
[0032]
图3：实施例1所制备的plnp-mal/opss的透射电镜(tem)图；
[0033]
图4：实施例1所制备的plnp-mal/opss与谷胱甘肽反应后的tem图；
[0034]
图5：实施例1所制备的plnp-mal/opss与谷胱甘肽反应前后的水合粒径图；
[0035]
图6：实施例1所制备的plnp-mal/opss的细菌环境自组装图；
[0036]
图7：实施例1所制备的plnp-mal/opss的平板杀菌图；
[0037]
图8：实施例1所制备的plnp-mal/opss的活体成像图；
[0038]
图9：对比例2-4所制备的探针的平板杀菌图；
[0039]
图10：对比例2-4所制备的探针的活体成像图。
具体实施方式
[0040]
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
[0041]
测试方法：
[0042]
1、体外自组装性能的测试：
[0043]
谷胱甘肽(2mm)与plnp-mal/opss(1mg ml-1
)室温过夜反应后，用超纯水离心洗涤2-3次，然后冻干，通过透射电镜观察plnp-mal/opss与谷胱甘肽反应后的分散状态，通过水合粒径观察plnp-mal/opss与谷胱甘肽反应前后变化。
[0044]
2、细菌靶向性的测试：
[0045]
将1ml细菌(金黄色葡萄球菌)悬浮液(1
×
107cfu ml-1
)与200μg plnp-mal/opss混合，然后在37℃和200rpm的振动台上培养不同时间(1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和10小时)，取出100μl细菌悬液(1
×
107cfu ml-1
)，离心，磷酸盐缓冲溶液(pbs)重悬后用共聚焦显微镜拍摄细菌与材料的孵育情况。
[0046]
plnp-mal/opss与(金黄色葡萄球菌)的悬浮液中加入三(2-羧乙基)膦(tecp)(10mm)，其余实验步骤相同，用共聚焦显微镜拍摄细菌与材料的孵育情况。
[0047]
3、杀菌能力的测试：
[0048]
采用平板涂布实验进行测试，具体如下：将1ml细菌(大肠杆菌)悬浮液(1
×
107cfu ml-1
)与不同质量plnp-mal/opss探针(0μg、200μg、400μg、800μg和1000μg)混合，然后在37℃和200rpm的振动台上培养1小时，然后从各组中提取细菌悬液，梯度稀释后取100μl均匀涂抹于固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养24小时后，计算菌落数；
[0049]
杀菌率计算公式如下式(1)：
[0050]
杀菌率＝1-(c/c0)
×
100％(1)
[0051]
其中，c0是未作任何处理的菌落数，c是和不同浓度plnp-mal/opss溶液混合孵育的菌落数。
[0052]
4、体内靶向和成像能力的测试：
[0053]
在小鼠背部制造直径7mm的圆型伤口，在伤口上滴加20μl细菌(大肠杆菌)悬液(1
×
108cfu ml-1
)，待伤口表面液体干透再将小鼠放回笼子中。24小时后，得到小鼠感染模型，将plnp-mal/opss探针分散于pbs缓冲液中，尾静脉注射125μl plnp-mal/opss溶液(2mg ml-1
)进入小鼠体内，注射后不同时间，用小动物成像仪对小鼠进行拍摄，每次拍摄前用led灯照射2分钟。
[0054]
实施例1
[0055]
一种制备具有成像指引杀菌功能的长余辉探针的方法，所述的方法选用小尺寸长余辉纳米材料，以减少在内皮网状系统的聚集并加快材料在体内的代谢，通过配体交换使长余辉纳米材料表面带有mal和opss配体，使探针具有靶向性的同时可在细菌感染部位由单个颗粒自组装成团簇，从而达到杀菌和成像作用；
[0056]
具体包括如下步骤：
[0057]
(1)将0.358g乙酰丙酮锌、0.734g乙酰丙酮镓和1.396mg乙酰丙酮铬溶解在50ml十八烯和40ml油酸的混合溶液中，80℃油浴加热搅拌至溶解后使其冷却至40-50℃，然后加入10ml无水甲醇，充分搅拌，得到反应液；之后将反应液转移入衬有特氟隆的30ml不锈钢高压釜中，在220℃烘箱中反应24小时；反应结束后，用环己烷/无水乙醇(1:1，v:v)离心洗涤5次，再用无水乙醇离心洗涤1次，最后在室温环境中真空干燥，得到白色粉末plnp-oa；
[0058]
(2)将10mg plnp-oa、5mg dspe-peg-mal和5mg dspe-peg-opss溶于5ml chcl3中，超声分散均匀后在60℃油浴中进行配体交换反应过夜(10h)；反应结束后缓慢滴加5ml超纯水，70℃真空旋蒸去除chcl3，用无水乙醇离心洗涤2次，再用超纯水离心洗涤1次，最后冷冻干燥，得到plnp-mal/opss。
[0059]
对比例1
[0060]
直接采用plnp-oa。
[0061]
将所得的plnp-oa和plnp-mal/opss探针进行性能测定，测试结果如下：
[0062]
图1为plnp-oa和plnp-mal/opss的红外光谱图，从图1可以看出：plnp-mal/opss较plnp-oa，有明显的醚键特征峰(1110cm-1
)、羧酯键特征峰(1720cm-1
)和苯环特征峰(1680cm-1-1450cm-1
)，证明配体交换成功，plnp-mal/opss表面带有mal和opss配体。
[0063]
图2为plnp-oa和plnp-mal/opss的磷光发射图，从图2可以看出：plnp-oa和plnp-mal/opss的在700nm处均有较强的磷光发射，证明plnp-mal/opss可用于后续成像实验。
[0064]
图3为plnp-mal/opss的tem图，从图3可以看出：plnp-mal/opss是比较分散且大小均匀的颗粒。
[0065]
图4为plnp-mal/opss与谷胱甘肽(gsh)反应后的tem图，从图4可以看出：plnp-mal/opss与谷胱甘肽反应后可在体外形成团聚，证明plnp-mal/opss具有自组装能力，可用于后续细菌环境自组装和靶向成像。
[0066]
图5为plnp-mal/opss与谷胱甘肽反应前后的水合粒径图，从图5可以看出：plnp-mal/opss与谷胱甘肽反应后水合粒径增大，说明其与谷胱甘肽反应后可在体外形成团聚，证明plnp-mal/opss具有自组装能力，可用于后续细菌环境自组装和靶向成像。
[0067]
图6为plnp-mal/opss在细菌环境的自组装图，从图6可以看出：plnp-mal/opss可以包裹在细菌(金黄色葡萄球菌)表面，并使得细菌呈现聚集状态，而加入三(2-羧乙基)膦(tecp)后，因tcep是一种硫醇类还原剂，可以阻止plnp-mal/opss探针的自组装，使细菌仍然呈现分散的状态。
[0068]
图7为plnp-mal/opss的平板杀菌图，从图7可以看出：plnp-mal/opss具有较好的杀菌(大肠杆菌)性能，且杀菌效果呈浓度依赖，即plnp-mal/opss探针浓度越高杀菌效果越好，当加入1000μg plnp-mal/opss探针时杀菌率为99.20
±
0.79％。
[0069]
图8为plnp-mal/opss的活体成像效果图，从图8可以看出：plnp-mal/opss具有靶向成像的效果，且在体内代谢较快。
[0070]
对比例2
[0071]
省略dspe-peg-opss，直接采用10mg dspe-peg-mal，其他和实施例1保持一致，制备得到plnp-mal。
[0072]
对比例3
[0073]
省略dspe-peg-mal，直接采用10mg dspe-peg-opss，其他和实施例1保持一致，制备得到plnp-opss。
[0074]
对比例4
[0075]
将实施例1中的dspe-peg-mal和dspe-peg-opss替换成10mg dspe-peg，其他和实施例1保持一致，制备得到plnp-peg。
[0076]
将对比例2-4得到的探针进行性能测试，测试结果如下：
[0077]
图9为对比例2-4得到的探针的平板杀菌图(探针的用量为1000μg)，从图9可以看出：即使探针加入量为1000μg，探针杀菌(大肠杆菌)率仍然不足50％，杀菌效果不如plnp-mal/opss。
[0078]
图10为对比例2-4得到的探针的活体成像效果图，从图10可以看出：plnp-mal和plnp-opss达到靶向成像的效果需要2天以上，而plnp-mal/opss在24小时时即有靶向成像效果，plnp-peg则无明显靶向效果。
[0079]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。