Apelin/APJ通路的上调表达促进剂在百草枯中毒肾损伤药物中的应用

apelin/apj通路的上调表达促进剂在百草枯中毒肾损伤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于药物技术领域，尤其是一种apelin/apj通路的上调表达促进剂在百草枯中毒 肾损伤药物中的应用。


背景技术：

2.急性肾损伤(acutekidneyinjury:aki)是百草枯(pq)对机体早期损害的主要表现之 一，也是患者早期死亡的主要原因。pq导致肾损伤机制复杂，多数研究支持氧化应激，炎症 反应，内质网应激和凋亡学说。aki常表现急性肾小管坏死、上皮细胞空泡变性，肾实质出 血，导致肾功能降低。而肾脏是pq排泄的唯一器官，肾损伤导致pq排泄延迟，因而加重 pq对其他脏器损伤，使患者急性期死亡率明显增加。研究解毒药物，以及如何在早期保护肾 脏功能是目前临床上亟待解决的问题。
3.氢醌(ah2qds)是新近发现对pq中毒有较好解毒作用的化合物。文献报道具有强还原 性和抗氧化作用。已在橡胶抗老化，金属防锈剂等工业中广泛应用。医疗方面主要用于化妆 品，色素性皮肤病的治疗。本课题组前期实验发现ah2qds和百草枯体外反应生成沉淀，动 物实验发现该化合物能够降低消化道、血液及尿液中百草枯浓度，提高大鼠30天生存率。并 通过减少氧化应激、降低自由基含量，抑制炎症反应等机制减轻百草枯中毒所致的肺损伤。 实验还发现ah2qds治疗组肾脏损伤较轻，肾功能恢复时间短。但ah2qds对肾脏保护作用 的分子机制尚不清楚。有学者报道，apelin是g蛋白偶联受体apj的内源性配体，属于脂肪 因子家族，最初在心血管系统有较多研究。已证实apelin/apj有调控血压、减轻心脏损伤以 及调控血糖等作用。而在百草枯中毒中发现apj高表达，但其具体作用机制尚不完全清楚。
4.通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
5.1、一种治疗百草枯急性中毒特异性解毒药物(cn110585180a)，该药的主要成分是氢 醌类化合物或其药学上可接受的盐，优选为9,10-蒽氢醌-2,6-二磺酸或9,10-蒽氢醌-2,6-二磺酸 盐(简称ahqds)。应用方法是：针对百草枯中毒剂量，配比不同剂量解毒药物，通过灌胃方 式予以治疗。该药剂能够使大鼠血液、尿液、肺部组织中的百草枯浓度迅速降低，明显减轻 大鼠百草枯的毒性反应，对百草枯所引起的肺损伤产生保护作用，极大提高了百草枯急性中 毒大鼠的存活率，为临床治疗百草枯中毒提供新的药物。
6.2、一种治疗犬类百草枯急性中毒的方法(cn110478341a)，该方法使用的药物的主要 成分是氢醌类化合物或其药学上可接受的盐，优选为9,10-蒽氢醌-2,6-二磺酸或9,10-蒽 氢醌-2,6-二磺酸盐(简称ahqds)。应用方法是：针对百草枯中毒剂量，配比不同剂量解毒 药物，通过灌胃方式予以治疗。该药剂能够明显减轻犬类百草枯的毒性反应，对百草枯所引 起的肺损伤产生保护作用，极大提高了百草枯急性中毒犬类的存活率。
7.3、一种百草枯快速解毒液及方法(cn105944279a)，制剂为蒽醌、fe(iii)腐殖质还原 菌及其培养基、电子供体、ph缓冲剂共避光厌氧培养至足量蒽醌被还原为氢醌的混合
物。本 发明的制剂，与百草枯溶液接触反应后，可以快速形成针状固体物，该针状固体物既不溶于 强酸强碱，也不溶于水及常见有机溶剂中，无法被人体或动物体吸收，常温常压性质极其稳 定，从而实现了百草枯的快速解毒。同时本发明制剂的制备方法简单，成本低。
8.通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。


技术实现要素：

9.本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种apelin/apj通路的上调表达促进剂 在百草枯中毒肾损伤药物中的应用。
10.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
11.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备百草枯中毒肾损伤的解毒药物方面中的应用。
12.进一步地，所述促进剂为氢醌。
13.进一步地，所述氢醌能够降低氧化应激，减少炎症反应，减少内质网损伤和凋亡；
14.或者，所述氢醌通过上调apelin/apj表达起到对减轻对百草枯中毒肾损伤的保护作用；
15.或者，所述氢醌与百草枯的摩尔比为1:1。
16.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备百草枯中毒肾损伤的早期保护肾脏功能药物方 面中的应用。
17.进一步地，所述促进剂为氢醌。
18.进一步地，所述氢醌能够降低氧化应激，减少炎症反应，减少内质网损伤和凋亡；
19.或者，所述氢醌通过上调apelin/apj表达起到对减轻对百草枯中毒肾损伤的保护作用；
20.或者，所述氢醌与百草枯的摩尔比为1:1。
21.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备百草枯中毒减轻肾损伤的保护药物方面中的应 用。
22.进一步地，所述促进剂为氢醌。
23.进一步地，所述氢醌能够降低氧化应激，减少炎症反应，减少内质网损伤和凋亡；
24.或者，所述氢醌通过上调apelin/apj表达起到对减轻对百草枯中毒肾损伤的保护作用；
25.或者，所述氢醌与百草枯的摩尔比为1:1。
26.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备保护百草枯中毒小鼠肾脏药物中的应用。
27.本发明取得的优点和积极效果为：
28.1、本发明证实，ah2qds对pq中毒肾脏有保护作用，并且优于sivelestat。ah2qds的 作用的可能机制与减少细胞氧化应激，减少肾组织pq含量，减少炎症损伤和内质网应激、 凋亡有关；并可能通过上调apelin/apj通路的表达起到对pq中毒的治疗作用。
29.2、本发明结果显示，在pq组，肾组织的pq含量高于pq ah2qds组。he染色显示， pq组肾实质广泛出血、淤血；同时发现，肾小管上皮细胞空泡变性，肾小囊内新月体样红染 物质沉积，少数炎细胞浸润，可见少量管型；pq sivelestat组、pq ah2qds组上述病理 变化较
轻，(p《0.05)。中毒第3天，肾组织apelin蛋白免疫荧光发现，pq ah2qds组高于 pq组，有显著统计学意义。westernblot实验显示，pq组肾组织中，il-6、tnf-α、nf-κbp65、 caspase-1、caspase-8、grp78、chop蛋白表达水平高于pq ah2qds组(p《0.05)。在pq ah2qds组中，apelin/apj蛋白表达高于pq sivelestat和pq组(p《0.05)，在第3天，第 7天差异明显。肾小管上皮细胞氧化应激检测显示，pq ah2qds组和pq sivelestat组明 显低于pq组(p《0.05)。
附图说明
30.图1为本发明中肾组织pq相对含量图；
31.图2为本发明中大鼠肾组织病理和损伤评分图(
ⅹ
40倍)；其中，a：皮质区损伤，b： 髓质区损伤；c、d分别为皮质区、髓质区评分；
32.图3为本发明中肾组织il-6、nf-κbp65、tnf-α表达及定量分析图；其中，a、b、c、 d、e为定量分析；
33.图4为本发明中人肾小管上皮细胞ros荧光表达及定量图；其中，a为人肾小管上皮 细胞ros荧光表达(10倍
ⅹ
40倍)，b为定量分析；
34.图5为本发明中肾脏内质网应激和凋亡蛋白表达及定量分析图；其中，a、b、c、d、 e分别为其定量分析；
35.图6为本发明中肾组织apelin/apj蛋白检测图；其中，a为肾组织损伤apelin/apj蛋 白表达，b、c为apelin/apj定量分析，d为第3天apelin免疫荧光(
ⅹ
40倍)，e为apelin 荧光定量分析。
具体实施方式
36.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的， 不能以此限定本发明的保护范围。
37.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法， 如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
38.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备百草枯中毒肾损伤的解毒药物方面中的应用。
39.较优地，所述促进剂为氢醌。
40.较优地，所述氢醌能够降低氧化应激，减少炎症反应，减少内质网损伤和凋亡；
41.或者，所述氢醌通过上调apelin/apj表达起到对减轻对百草枯中毒肾损伤的保护作用；
42.或者，所述氢醌与百草枯的摩尔比为1:1。
43.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备百草枯中毒肾损伤的早期保护肾脏功能药物方 面中的应用。
44.较优地，所述促进剂为氢醌。
45.较优地，所述氢醌能够降低氧化应激，减少炎症反应，减少内质网损伤和凋亡；
46.或者，所述氢醌通过上调apelin/apj表达起到对减轻对百草枯中毒肾损伤的保护作用；
47.或者，所述氢醌与百草枯的摩尔比为1:1。
48.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备百草枯中毒减轻肾损伤的保护药物方面中的应 用。
49.较优地，所述促进剂为氢醌。
50.较优地，所述氢醌能够降低氧化应激，减少炎症反应，减少内质网损伤和凋亡；
51.或者，所述氢醌通过上调apelin/apj表达起到对减轻对百草枯中毒肾损伤的保护作用；
52.或者，所述氢醌与百草枯的摩尔比为1:1。
53.apelin/apj通路的上调表达促进剂在制备保护百草枯中毒小鼠肾脏药物中的应用。
54.具体地，相关制备及检测实施例如下：
55.1、本发明设计思路：
56.首先将sd(sprague-dawley)雄性大鼠分为control，pq，pq sivelestat，pq ah2qds 4个组。sivelestat作为阳性对照组。用20％pq(农药)溶液200mg/kg，灌胃建立中毒模型。 中毒后2小时，pq sivelestat组用sivelestat治疗；pq ah2qds组用ah2qds解毒。在中 毒后第1天,第3天,第7天取组织检测。用连二亚硫酸钠法测肾组织pq含量。用he (hematoxylin-eosin)染色观察组织病理变化。用免疫荧光测定肾组织apelin蛋白表达。通过westernblot检测肾组织il-6,tnf-α，apelin/apj(apelin-angiotensinreceptor),nf-κbp65, caspase-1,caspase-8,grp78(葡萄糖调节蛋白78),chop(c/ebp环磷酸腺苷反应元件结合 转录因子同源蛋白)蛋白表达水平。接着用pq纯品干预人肾小管上皮细胞，建立pq中毒模 型。使用sivelestat,ah2qds干预治疗细胞。用ros(reactiveoxygenspecies)荧光探针检测细 胞氧化应激水平。
57.2、材料和方法
58.1)实验动物和细胞
59.sd大鼠，购于湖南长沙天勤生物技术有限公司许可证scxk(湘)2019-0014。海南医 学院动物实验中心，清洁级标准喂养。人肾小管上皮细胞hk2：中国科学研究院上海细胞库。
60.2)主要实验试剂
61.il-6、tnf-α、grp78、chop一抗(bioss,中国北京)。nf-κbp65、caspase-1、caspase-8 一抗、hrp山羊抗兔igg二抗(abcam,英国)。pvdf膜(biosharp中国北京；yeasen中 国上海)。ecl化学发光超敏显色试剂盒(yeasen，中国上海)。sds-page凝胶试剂盒 (sangonbiotech，中国上海)。曙红(biosharp，中国北京)。苏木精染料溶液(biosharp， 中国北京)。dapi(beyotime生物技术，中国上海)。sivelestat(汇伦江苏医药,中国上海)。 20％百草枯水剂(中国河南商丘药厂)。百草枯纯品(accustandard,美国)。无水碳酸钠、 无水碳酸氢钠、焦亚硫酸钠(西陇科学,中国广东)。ah2qds(中国热带植物保护研究所, 海南)。蒽醌-2,6,-二磺酸二钠(东京化学工业公司，日本东京)。tricine-sds-page凝胶 试剂盒(中国，上海)。
62.3)主要仪器设备
63.凝胶电泳仪(americabiorad，德国)。分析天平(梅特勒-托利多)。荧光显微镜(德 国徕卡)。化学发光荧光凝胶成像分析仪(赛智北京)。低温离心机(德国)。超分辨率显 微镜(奥林帕斯，日本)。台式低速离心机(湖南祥力科学仪器有限公司)。二氧化碳细胞 培养箱
(上海新淼医疗器械制造有限公司)。倒置荧光显微镜(德国徕卡)。超低温冰箱(-80℃) (青岛海尔，中国)。旋转切片机(中国金华亿迪医疗器械有限公司)。超纯水系统(德国 默克)。高压灭菌器(日本松下)。
64.4)动物实验设计
65.sivelestat(西维来司他)属于外源性中心粒细胞弹性蛋白酶(ne)抑制剂，具有稳定抗炎 作用，可调节炎症因子(il-6、tnf-α等)的释放，减少炎症细胞活化，减少中性粒细胞聚集， 减轻肺、肝、肾损伤的引起的炎症反应，保护脏器功能。本发明中选用此药作为阳性对照。
66.sd大鼠平均体重300
±
10g，雄性，共72只，分control，pq，pq sivelestat，pq ah2qds，共4组，每组随机抽取18只。建立中毒模型前10小时禁食水。pq组：质量浓度 为20％的pq溶液，200mg/kg/只，灌胃(he切片证实大鼠有脏器损伤，故选取此剂量构建 pq损伤模型)，1次；中毒2小时后灌胃超纯水8ml，第2天～第7天，超纯水5ml/只/天， 灌胃。pq sivelestat组：pq用量同pq组，中毒后2小时sivelestat30mg/kg/只 生理盐 水1ml，腹腔注射，1次/日，共7天；pq ah2qds组：pq用量同pq组，中毒2小时后ah2qds 8ml/只灌胃(根据pq:ah2qds＝1:1，摩尔比，可完全解毒)；第2天～第7天5ml/只/天， 灌胃。
67.分别于中毒后第1天、第3天、第7天每组取6只大鼠取组织检测。10％水合氯醛腹腔 注射麻醉，腹主动脉取血5ml/只，3000转，离心5分钟，取上清，-80℃保存。取左肾放 10％中性福尔马林。取右肾放冻存管，-80℃冰箱保存。
68.5)肾组织pq相对含量测定
69.取第1天，第3天，第7天各组右肾组织，用冰pbs洗净肾组织表面血迹，滤纸吸干水， 每只称肾组织100mg，各加入500μl无菌超纯水，匀浆3分钟，50hz；4℃，12000转， 离心10分钟，取上清100μl,每样品设空白对照孔，加入96孔板。用连二亚硫酸钠碳酸氢 钠法测量pq含量，连二亚硫酸钠粉1.0g,碳酸氢钠粉2.0g,无菌超纯水10ml,混匀，5000 转，10分钟离心2次，取上清，制成测试溶液)。提前开启酶标仪，每组每样迅速加入150 μl测试液(空白孔除外)，立即测量od值(400nm)。每组每只大鼠测一次，共6次，求 平均值。
70.6)肾组织he染色
71.取不同时间点各组左肾组织，10％中性福尔马林液固定24小时，依次经过取材，梯度酒 精脱水，二甲苯透明，浸蜡(软蜡硬蜡各1小时)，包埋，切片(0.3μm)，漂片，烤片，脱蜡， 苏木素染色(6分钟)，水洗，0.5％盐酸乙醇分化，流水返蓝(15分钟以上)，伊红(7分 钟)，梯度酒精至水，二甲苯透明，封片。观察各组病理变化，并进行组织损伤评分。评分 方法：每组6只大鼠，每只大鼠各选取1个染色较好肾组织病理切片，每个切片随机选取皮 质区2个视野和髓质区共2个视野(10倍
ⅹ
40倍)，每组皮质区12个视野，髓质区12个视野， 同组中各视野不同病理类型面积取平均值，进行组间比较。
72.7)westernblot
73.冰上操作，滤纸擦干血迹，称取各组右肾组织50mg，加裂解液500μl，用组织匀浆仪间 断粉碎3分钟，50赫兹。4℃超声裂解30分钟；用12000转，10分钟4℃离心，取组织上 清400μl。用bca试剂盒测总蛋白浓度，并配平各组总蛋白浓度。各加蛋白上样缓冲液(1:4)， 煮沸变性蛋白10分钟。根据耙蛋白分子量配不同浓度sds-page凝胶(sds：十二烷基磺酸 钠；page聚丙烯酰胺凝胶)；tricine-sds-page凝胶用于靶蛋白分子量＜10kd(apelin)。依
据 蛋白分子量用相应电压、时间进行电泳和转膜。5％牛奶封闭2小时；4℃孵育相应蛋白一抗 过夜；洗膜5分钟/1次，共半小时；对应二抗常温孵育2小时。洗膜半小时共6次。用ecl 化学发光超敏显色试剂盒显影。用imagej求灰度值，用graphpadprism8.0作图。目的蛋白 灰度值除以内参灰度值，为蛋白相对表达量，进行组间比较。
74.8)组织免疫荧光
75.经过常规组织he染色步骤至脱蜡后；冰pbs(phosphatebufferedsaline)洗3遍，每次5 分钟。抗原修复，高压锅煮沸，5分钟；冰pbs洗3遍，每次5分钟。3％双氧水室温孵育 半小时；冰pbs洗3遍，每次5分钟。1％bsa(bovineserumalbuminsolution)封闭半小时。 相应蛋白一抗孵育(1:200，用1％bsa稀释)，放湿盒4℃过夜。冰pbs洗3遍，每次5分 钟。37℃避光，二抗fitc(fluoresceinisothiocyanate)孵育1小时。冰pbs洗3遍，每次5 分钟。dapi(4',6-diamidino-2-phenylindole)染核5分钟，避光。pbs洗3遍，每次5分钟。 加防淬灭剂，封片。荧光显微镜拍照(激发光488nm,512nm)。
76.9)人肾小管上皮细胞(hk2)氧化应激测定
77.常规培养人肾小管上皮细胞(胎牛血清，f12-k培养基，5％co2培养箱，37℃等)。实 验分组和药物干预方法同动物实验。根据cck8(cellcountingkit-8)实验测pq纯品ic
50
:166 μmol/l。用160μmol/l浓度干预pq组，pq sivelestat组和pq ah2qds组细胞24小时， 建立细胞中毒细胞模型。24小时后，pq组换正常培养基。pq sivelestat组用含sivelestat (100μg/ml，cck8实验此浓度对细胞活力无影响)培养基治疗细胞24小时。pq ah2qds 组用含ah2qds(160μmol/l,cck8实验此浓度对细胞活力无影响)培养基干预细胞24小时。 48小时后，用活性氧(ros)探针测定试剂盒检测氧化应激水平，免疫荧光显微镜拍照(512nm 波长激发)。
78.10)统计分析
79.用spssstatistics22对实验数据统计分析。荧光定量用imagej/origin分析。计量资料数 表示。p《0.05有统计学意义。
80.3、结果
81.1)ah2qds可降低肾脏pq浓度
82.图1中显示，与control比，pq组pq含量明显升高，**p《0.01。与pq组比，pq ah2qds 含量低，##p《0.01。结果说明pq组pq含量高，导致肾损伤。ah2qds能减少肾组织pq含 量，减轻肾损伤。sivelestat的作用不确定(见图1)。
83.2)ah2qds减轻肾脏的病理损伤
84.从图2中看出，与control比，pq组大鼠中毒后第1天多见肾间质出血，血管内淤血， 箭头所示肾小管上皮细胞空泡变性，部分上皮细胞脱落，少数炎细胞浸润；部分肾小囊有红 染新月体样沉积物，少见管型，pq组病理改变明显，**p《0.01。与pq组比，pq ah2qds 组病理变较轻，#p《0.05。第3天，pq组肾实质淤血，上皮细胞空泡变性明显；pq ah2qds 组空泡变性、淤血较轻，#p《0.05。中毒第7天，pq组淤血减轻，仍有上皮细胞变性；pq ah2qds组明显减轻，#p《0.05。与pq组比，pq sivelestat组病理损伤减轻，无统计学 意义。因此，病理结果说明pq能导致肾脏过度炎症反应损伤；ah2qds能减轻pq中毒导致 的炎症损伤，且优于sivelestat的作用(见图2)。
85.3)ah2qds能减少肾组织炎症反应
86.图3中所见，与control比，pq组il-6，nf-κbp
65
，tnf-α蛋白表达不同程度增高，*p《0.05 或**p《0.01。与pq组比，pq ah2qds组il-6，nf-κbp
65
，tnf-α蛋白表达在第3天、第7 天明显减少，##p《0.01。pq sivelestat组第一天～第7天il-6表达降低，nf-κbp
65
，tnf-α 表达不稳定。因此，westernblot结果说明pq可引起炎症因子过表达，引起肾脏损伤；ah2qds 能减轻炎症因子表达，减轻炎症反应，且作用优于sivelestat(见图3)。
87.4)ah2qds减轻人肾小管上皮细胞氧化应激损伤
88.图4中所见，与control比，pq组ros含量明显升高，**p《0.01。与pq组比，pq ah2qds 和pq sivelestat组ros含量低，##p《0.01。细胞氧化应激检测结果说明pq能引起细胞氧 化应激含量增加，引起细胞损伤；sivelestat和ah2qds能减少细胞氧化应激损伤(见图4)。
89.5)ah2qds减轻肾组织内质网应激和凋亡
90.图5中结果显示，与control组比，pq组第1天，第3天，第7天grp78，chop表达 增高，**p《0.01；caspase-8在3天，第7天表达增高，**p《0.01。与pq组比，pq ah2qds 组grp78，chop，caspase-8第3天，第7天逐渐降低，#p《0.05，##p《0.01。pq sivelestat 组chop，caspase-8蛋白第1天，第3天，第7天逐渐降低。pq sivelestat组和pq ah2qds 组caspase-1蛋白降低不显著。此结果说明pq能不同程度增加内质网应激蛋白表达和部分凋 亡蛋白表达，加重肾损伤；ah2qds能减轻内质网应激和部分凋亡蛋白表达，减少肾损伤， 且优于sivelestat(见图5)。
91.6)ah2qds能促进肾组织apelin/apj表达
92.从图6a，b，c看出，与control组比，pq组肾组织apelin蛋白第1天，第7天表达 减少，**p《0.01；apj蛋白表达3个时间点都减少，**p《0.01。与pq组比，pq ah2qds 组apelin/apj第3天，第7天表达逐渐增多，##p《0.01；pq sivelestat组apj逐渐增高， ##p《0.01，apelin表达增高不稳定。从图d，图e看出，与pq组比，pq ah2qds组第3 天apelin表达增多，##p《0.01，并且荧光在肾小球毛细血管区和间质区分布密度最大。此结 果说明pq能抑制apelin/apj的表达，减少apelin/apj对炎症的抑制；ah2qds能使apelin/apj 表达增高，加强对炎症反应的抑制，第3天～第7天作用更明显。(见图6)。
93.4、讨论
94.肾脏是pq中毒最早损伤的器官，多引起急性肾小管上皮细胞变性、坏死，肾实质出血、 淤血，炎细胞浸润等病理改变。文献报道，pq中毒能引起尿量减少，尿蛋白增加，血bun (bloodureanitrogen)、cr(crea)升高，体液潴留水电解质酸碱平衡紊乱，进一步加重全身损 害。代谢物和毒物蓄积，加重其他脏器损伤，加速mods(multipleorgandysfunctionsyndrome) 进程。
95.本发明发现，肾脏pq含量，pq ah2qds组明显低于pq组(见图1)。从肾组织病理 结果看出，中毒第1天，pq组多数大鼠肾脏广泛皮质区、肾小球内和髓质区出现血管内充血， 间质淤血，部分大鼠肾小囊有明显均质红染新月体样沉积物，多数肾小管上皮细胞空泡变性， 偶见管型，有少数淋巴细胞浸润；与文献报道一致。pq sivelestat组，pq ah2qds组肾实 质出血、空泡变性相对较轻，肾小囊沉积物少，少见管型。pq组第3天肾组织上述病理改变 明显，第7天损伤减轻。与pq组比，从3到7天pq ah2qds组和pq sivelestat组病理改 变较轻(见图2a,b)。肾病理结果说明pq能引起肾脏的炎症病理改变，出血和淤血；sivelestat、 ah2qds能减轻肾组织炎症反应，后者效果更显著(见图2c,d)。肾小管上皮细
胞氧化应 激水平检测发现pq组ros含量较高，pq sivelestat组，pq ah2qds组含量相对较低(图 4)。这一结果进一步证明sivelestat，ah2qds能减少细胞氧化应激损伤。
96.引起肾组织病理改变原因主要是因pq吸收入循环或组织，使淋巴细胞、单核/巨噬细胞 等活化、脱颗粒，释放il-6、tnf-α等炎症因子有关。这些因子与相应靶细胞表面受体结合， 可能调控下游inf-κb通路激活，使更多炎症因子表达(图3)，扩大炎症反应，引发炎症风 暴。最终引起血管扩张，内皮细胞系统激活。导致浆液、血细胞渗出。同时引起间质出血， 水肿，肾小管上皮细胞变性、坏死。引起急性肾组织损伤，导致肾功能降低。文献报道，pq 能氧化应激。可能由于pq进入肾小管上皮细胞，在线粒体nadph(reductivecoenzymeⅱ) 等还原酶作用下，生成pq-。pq-和o2反应生成pq和o
2-。o
2-在超氧化物歧化酶作用下生成 h2o2。h2o2在fe等催化下生成oh.,导致活性氧族增多(图4)。另外还原酶耗竭，使氧 化还原平衡紊乱
[29,30]
。导致细胞代谢障碍。引起过多自由基产生，破坏膜结构和转运功能， 引起细胞内水钠代谢物蓄积，导致细胞空泡变性、坏死。但pq ah2qds组和pq sivelestat 组ros含量较少，组织损伤也较轻。说明ah2qds在体内具有明显的抗氧化作用。从蛋白 水平来看，肾组织中，pq组il-6，tnf-α，nf-κbp
65
，grp78，chop，caspase-8,caspase-1 指标表现不同程度增高，而pq sivelestat组，pq ah2qds组表达相对较低，从3天到7 天结果更明显，p《0.05(图3，图5)。证明sivelestat、ah2qds在不同程度上降低炎症因 子水平具有保护肾组织的作用。ah2qds能减少氧化应激，减少自由基损伤，从而减少grp78、 chop生成，减少异常蛋白堆积。作用优于sivelestat。ah2qds也能在不同程度减少凋亡蛋 白表达。
[0097]
apelin/apj在减轻组织氧化应激，炎症反应和凋亡中有重要作用。本实验结果发现，与 control组比，pq组apelin/apj蛋白表达降低；pq sivelestat组和pq ah2qds组表达高 于pq组和control组，从第3天到第7天结果较明显(图6a,b,c)；第3天apelin免疫荧 光显示：在肾小球毛细血管小叶区和间质区分布密度，pq ah2qds组apelin免疫荧光比 pq组和control组高；pq组apelin荧光含量比control组低(图6d、e)。两项结果说明 pq中毒能使apelin/apj表达下调，可能减弱apelin/apj对炎症反应和氧化应激的抑制作用； ah2qds能上调apelin/apj的表达，进一步提高机体抗氧化能力。
[0098]
总之，ah2qds可能通过上调apelin/apj表达抑制下游nf-κb活化，降低炎症因子il-6、 tnf-α水平，减轻炎症损伤。ah2qds作为还原性物质，能降低细胞氧化应激含量，减少炎 症反应、内质网应激和细胞凋亡发生。
[0099]
5、结论
[0100]
本发明表明ah2qds对pq中毒肾损伤有保护作用，且其治疗效果优于sivelestat。ah
2 qds对pq中毒肾损伤的保护作用可能与降低氧化应激，减少炎症反应，减少内质网损伤和 凋亡相关；并且可能通过上调apelin/apj表达抑制上述的损伤机制。
[0101]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本 发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的 范围不局限于实施例所公开的内容。