包含PEDF衍生的短肽的组合物及其制备方法和用途与流程

包含pedf衍生的短肽的组合物及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及包含pedf衍生的短肽(pdsp)的组合物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.人色素上皮衍生因子(pedf)是一种含有418个氨基酸的分泌蛋白质，分子量约为50kda。pedf是一种具有多种生物学功能的多功能蛋白质(参见公开号为2010/0047212的美国专利申请)。
3.已发现人pedf衍生的短肽(pdsp)是用于治疗或预防各种疾病或病症的有前途的治疗剂。例如，已发现pdsp有效促进肌肉再生或动脉生成(美国专利9,884,012)，治疗脱发和/或毛发脱色(美国专利9,938,328)，治疗骨关节炎(美国专利9,777,048)，预防或改善皮肤老化(美国专利9,815,878)或治疗肝硬化(美国专利8,507,446)。
4.然而，发现这些肽的制剂缺乏长期稳定性(经过数月)。因此，需要用于这种有前途的生物药学产品的更好的组合物。


技术实现要素：

5.在第一方面，本发明提供了一种组合物，其包含pedf衍生的短肽(pdsp)、稳定剂和缓冲剂；其中所述组合物为液体形式；其中所述组合物的ph在4-9范围内；其中所述稳定剂为乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物；其中所述缓冲剂选自柠檬酸缓冲体系、磷酸缓冲体系、硼酸缓冲体系、组氨酸缓冲体系，或其组合。
6.在第二方面，本发明提供了一种制备上述组合物的方法，其包括：a)添加稳定剂和缓冲剂；b)用碱/酸将ph调节至4-9范围内；和c)添加pedf衍生的短肽(pdsp)。
7.在第三方面，本发明提供了上述组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自肌肉再生或动脉生成、脱发和/或头发脱色、骨关节炎、皮肤老化、肝硬化、眼部疾病，或其组合。
8.本发明的包含pedf衍生的短肽的组合物具有改进的稳定性(物理稳定性和/或化学稳定性)、对眼部的刺激性小和/或生物利用度高。
具体实施方式
9.如本文中所使用的，术语“pedf衍生的短肽(pdsp)”是指衍生自pedf且具有不同数量的氨基酸残基的肽，如具有5个氨基酸残基至40个氨基酸残基的肽。
10.pdsp的示例可以包括表1中所示的那些：
11.表1:pedf衍生的短肽(pdsp)的实例
[0012][0013]
另外，pdsp的n-末端可以任选地被酰化保护(例如，乙酰基或丙酰基保护)，并且c-末端可以任选地被保护为酰胺。
[0014]
本文中提及的肽(即，pdsp)的氨基酸序列同一性为至少70％，优选至少80％，更优选至少90％。具体地，本文中提及的肽(即，pdsp)可被具体修饰而改变与其生理学活性不相干的肽的特征。
[0015]
本领域技术人员应理解，上述表1所列的肽序列仅用于说明，在不背离本发明范围的情况下其他序列也是可能的。此外，尽管上文可表示在预防和/或治疗疾病(例如干眼综合征)方面有效的一些短肽，但也可使用更短或更长的肽。具体地，较长的肽可能提供更有利的药代动力学和/或生物利用度。
[0016]
如本文中所使用的，术语“乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物”是聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)与聚乙酸乙烯酯(pvac)的不同比例的嵌段聚合物。通常，乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物为其中乙烯基吡咯烷酮结构单元与乙酸乙烯酯结构单元的比例为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20和/或90:10的乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物；更具体地，乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物的实例包括但不限于pvpva19、pvpva28、pvpva37、pvpva55、pvpva64、pvpva73，或其组合。
[0017]
如本文中所使用的，术语“柠檬酸缓冲体系”是指由能够提供柠檬酸根的物质与碱/酸(取决于所需的ph而选择使用碱还是酸)共同组成的缓冲体系。其中，能够提供柠檬酸根的物质可选自柠檬酸、柠檬酸盐，或其组合；碱通常为无机碱，例如可选自碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐，或其组合；和/或，酸通常为无机酸，例如可选自盐酸、磷酸，或其组合。
[0018]
如本文中所使用的，术语“磷酸缓冲体系”是指由能够提供磷酸根的物质和碱/酸(取决于所需的ph而选择使用碱还是酸)共同组成的缓冲体系。其中，能够提供磷酸根的物质可选自磷酸、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、磷酸盐，或其组合；碱通常为无机碱，例如可选自碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐，或其组合；和/或，酸通常为无机酸，例如可选自盐酸、磷酸，或其组合。
[0019]
如本文中所使用的，术语“硼酸缓冲体系”是指由能够提供硼酸根的物质和碱/酸
(取决于所需的ph而选择使用碱还是酸)共同组成的缓冲体系。其中，能够提供磷酸根的物质可选自硼酸、硼酸盐，或其组合；碱通常为无机碱，例如可选自碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐，或其组合；和/或，酸通常为无机酸，例如可选自盐酸、磷酸，或其组合。
[0020]
如本文中所使用的，术语“组氨酸缓冲体系”是指由组氨酸和碱/酸(取决于所需的ph而选择使用碱还是酸)共同组成的缓冲体系。其中，碱通常为无机碱，例如可选自碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐，或其组合；和/或，酸通常为无机酸，例如可选自盐酸、磷酸，或其组合。
[0021]
如本文所使用的，术语“碱金属氢氧化物”通常包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯等；更具体地，碱金属氢氧化物选自氢氧化钠、氢氧化钾，或其组合。
[0022]
如本文所使用的，术语“碱金属碳酸盐”通常包括碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铷、碳酸铯等；更具体地，碱金属碳酸盐选自碳酸钠、碳酸钾，或其组合。
[0023]
如本文所使用的，术语“碱金属碳酸氢盐”通常包括碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铷、碳酸氢铯等；更具体地，碱金属碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾，或其组合。
[0024]
本技术中所述的重容百分比(w/v)按所述制剂以液体形式存在时的终体积为基准，表示每100ml终体积中各组分的克数。
[0025]
在第一方面，本发明提供了一种组合物，其包含pedf衍生的短肽(pdsp)、稳定剂和缓冲剂；所述组合物的ph在4-9范围内；其中所述稳定剂为乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物；其中所述缓冲剂选自柠檬酸缓冲体系、磷酸缓冲体系、硼酸缓冲体系、组氨酸缓冲体系，或其组合。
[0026]
在一个具体的实施方案中，所述组合物为溶液形式或悬浮液形式，优选为溶液形式，更优选为眼用溶液形式。具体地，所述溶液或悬浮液的溶剂为水，优选为蒸馏水。
[0027]
在一个具体的实施方案中，pdsp选自seq id no:1(39-mer),seq id no:2(34-mer),seq id no:3(29-mer),seq id no:5(24-mer),seq id no:6(20-mer),seq id no:8(mo29-mer),seq id no:9(mo20-mer)，或其组合，其中mo29-mer和mo20-mer是分别对应于人29-mer和20-mer的小鼠pdsp。优选地，pdsp选自seq id no:3,8，或其组合。
[0028]
在一个具体的实施方案中，稳定剂为pvpva64。
[0029]
在一个具体的实施方案中，柠檬酸缓冲体系是由柠檬酸(或柠檬酸盐)和碱金属氢氧化物/盐酸(取决于所需的ph而选择使用碱金属氢氧化物还是盐酸)组成。
[0030]
在一个具体的实施方案中，磷酸缓冲体系是由磷酸和磷酸氢盐组成、由磷酸氢盐和磷酸二氢盐组成，或者由磷酸(或磷酸氢盐或磷酸二氢盐)和碱金属氢氧化物/盐酸(取决于所需的ph而选择使用碱金属氢氧化物还是盐酸)组成。优选地，磷酸缓冲体系选自磷酸-磷酸氢盐、磷酸氢盐-磷酸二氢盐、磷酸氢盐-盐酸、磷酸二氢盐-碱金属氢氧化物，或其组合。
[0031]
在一个具体的实施方案中，硼酸缓冲体系是由硼酸(或硼酸盐)和碱金属氢氧化物/盐酸(取决于所需的ph而选择使用碱金属氢氧化物还是盐酸)组成。
[0032]
在一个具体的实施方案中，组氨酸缓冲体系是由组氨酸和碱金属氢氧化物/盐酸(取决于所需的ph而选择使用碱金属氢氧化物还是盐酸)组成。
[0033]
优选地，在本发明的组合物中，缓冲剂为柠檬酸缓冲体系和/或组氨酸缓冲体系。
[0034]
在一个具体的实施方案中，pdsp的浓度可为0.001％-5％w/v，优选为0.005-1％w/v，更优选为0.01％-0.05％w/v，最优选为0.02％-0.04％w/v，例如0.03％w/v。
[0035]
在另一个实施方案中，pdsp的浓度通常为0.01-50mg/ml，优选为0.05-10mg/ml，更优选为0.1-0.5mg/ml,更优选为0.2-0.4mg/ml，例如0.3mg/ml。
[0036]
在一个具体的实施方案中，稳定剂的浓度可为0.1％-4％w/v，优选为0.1％-3％w/v，更优选为0.3％-2％w/v，最优选为0.5％-1.5％w/v。
[0037]
在另一个实施方案中，稳定剂的浓度可为1-40mg/ml，优选为1-30mg/ml，更优选为3-20mg/ml，最优选为5-15mg/ml。
[0038]
在一个具体的实施方案中，缓冲剂的浓度可为1mm-200mm，优选为5-150mm，更优选为10-100mm，最优选为40mm-60mm，例如50mm。
[0039]
在另一个实施方案中，缓冲剂的浓度可为0.005％-5％w/v，优选为0.03％-3.5％w/v，更优选为0.06％-2.5％w/v，最优选为0.2％-1.5％w/v。
[0040]
在又一个实施方案中，所述缓冲剂的浓度可为0.05-50mg/ml，优选为0.3-35mg/ml，更优选为0.6-25mg/ml，最优选为2-15mg/ml。
[0041]
在一个具体的实施方案中，组合物的ph优选在6-8范围内，更优选在6.5-7.5范围内，最优选在7-7.5范围内。
[0042]
在一个具体的实施方案中，组合物还包含其他辅料添加剂。具体地，所述其他辅料添加剂可选自渗透压调节剂、抑菌剂、助悬剂，或其组合，优选地选自渗透调节剂、抑菌剂，或其组合。
[0043]
具体地，所述渗透压调节剂可选自山梨醇、氯化钠、氯化钾、葡萄糖、硼酸，或其组合，优选地选自山梨醇、葡萄糖，或其组合。具体地，所述渗透压调节剂的浓度通常为0.005％-5％w/v，优选为0.1％-4％w/v，更优选为1％-3.5％w/v，最优选为2％-3％w/v；或者，其中所述渗透压调节剂的浓度通常为0.05-50mg/ml，优选为1-40mg/ml，更优选为10-35mg/ml，最优选为20-30mg/ml。
[0044]
具体地，所述抑菌剂可选自季铵盐类、有机汞类、脒类、醇类、酯类，或其组合，优选地选自苯扎氯铵、苯扎溴铵、硫柳汞、硝酸汞、氯己定、苯甲醇、三氯叔丁醇、羟苯乙酯、羟苯甲酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯，或其组合，更优选地选自苯扎氯铵、苯扎溴铵、硫柳汞、氯己定、三氯叔丁醇、羟苯乙酯，或其组合，最优选地选自苯扎氯铵、苯扎溴铵、硫柳汞，或其组合。具体地，所述抑菌剂的浓度通常为0.004％-0.025％w/v，优选为0.008％-0.021％w/v，更优选为0.01％-0.02％w/v；或者，其中所述抑菌剂的浓度通常为0.004-0.25mg/ml，优选为0.08-0.21mg/ml，更优选为0.1-0.2mg/ml。
[0045]
具体地，所述助悬剂可选自低分子助悬剂、高分子助悬剂、硅酸盐类、触变胶，或其组合。具体地，低分子助悬剂可选自甘油、糖浆，或其组合；高分子助悬剂可选自树胶类(如阿拉伯胶、西黄蓍胶、桃胶，或其组合)、植物粘液质及多糖类(如海藻酸钠、琼脂、淀粉、果胶、角叉菜胶、脱乙酰甲壳素，或其组合)、纤维素衍生物(如甲基纤维素或其盐、羧甲基纤维素或其盐、羟丙基纤维素或其盐、羟乙基纤维素或其盐，或其组合)，或其组合；硅酸盐类可选自膨润土、硅酸镁铝、硅酸铝，或其组合；和/或，触变胶可选自枸橼酸盐，枸橼酸氢盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、磷酸盐、alcl3，或其组合。具体地，所述助悬剂的浓度通常为0.1％-15％w/v，优选为0.1-10％w/v，更优选为1-5％w/v；或者所述助悬剂的浓度通常为1-150mg/
ml，优选为1-100mg/ml，更优选为10-50mg/ml。
[0046]
在第二方面，本发明提供了一种制备上述组合物的方法，其包括：a)添加稳定剂和缓冲剂；b)将ph调节至4-9范围内；和c)添加pedf衍生的短肽(pdsp)。
[0047]
在本发明的方法中，稳定剂、缓冲剂、pedf衍生的短肽(pdsp)和/或其浓度具有上文所述的定义。
[0048]
在一个具体的实施方案中，所述方法包括：a)添加稳定剂和缓冲剂，加水搅拌或超声至溶解；b)用碱/酸将ph调节至4-9范围内；和c)添加pedf衍生的短肽(pdsp)，搅拌或超声至溶解。优选地，步骤a)和/或c)中的溶解通过搅拌实现；更优选地，步骤a)和/或c)中的溶解通过手动搅拌或者加入磁子在磁力搅拌器中搅拌实现。优选地，步骤b)中的碱为无机碱，例如可选自碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐，或其组合。优选地，步骤b)中的酸为无机酸或有机酸，例如可选自盐酸、磷酸、柠檬酸，或其组合。
[0049]
在另一个具体的实施方案中，所述方法还包括d)经0.22μm过滤器过滤，优选地步骤d)在室温下进行。具体地，所述过滤器为针头式过滤器。
[0050]
具体地，步骤a)、b)和/或c)是在室温下进行。
[0051]
在第三方面，本发明提供了上述组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自肌肉再生或动脉生成、脱发和/或头发脱色、骨关节炎、皮肤老化、肝硬化、眼部疾病，或其组合。
[0052]
优选地，所述眼部疾病选自干眼症、以及与干眼症相关的症状(如由干眼症引起的眼表损伤、眼表炎症)。
[0053]
本文述及的各实施方案或者不同优选级别的方案，除非另有说明，均可任意组合。
[0054]
以下通过实施例形式举例说明本发明，但不应将此理解为本发明主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。
[0055]
实施例
[0056]
实施例1
[0057]
室温下，称取0.80g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂1。
[0058]
实施例2
[0059]
室温下，称取0.60g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂2。
[0060]
实施例3
[0061]
室温下，称取0.40g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和
0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂3。
[0062]
实施例4
[0063]
室温下，称取0.12g pvpva64(商品名：va64，购自德国basf公司)和0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入12mg pdsp(如29-mer)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂4。
[0064]
实施例5
[0065]
室温下，称取40mg pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂5。
[0066]
实施例6
[0067]
室温下，称取0.80g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.0；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂6。
[0068]
实施例7
[0069]
室温下，称取0.80g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入4mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂7。
[0070]
实施例8
[0071]
室温下，称取0.80g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入20mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂8。
[0072]
实施例9
[0073]
室温下，称取0.80g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.42g柠檬酸钠(购自北京百灵威科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入12mg pdsp(如29-mer)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂9。
[0074]
实施例10
[0075]
室温下，称取0.80g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)、0.42g柠檬酸钠(购自北京百灵威科技有限公司)和1.00g山梨醇(购自北京百灵威科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.5；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂10。
[0076]
实施例11
[0077]
室温下，称取0.80g pvpva64(商品名：va 64，购自德国basf公司)和0.42g柠檬酸钠(购自北京百灵威科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph6.5；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到本发明制剂11。
[0078]
对比例1
[0079]
室温下，称取0.42g柠檬酸钠(购自北京百灵威科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph6.5；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到对比制剂1。
[0080]
对比例2
[0081]
室温下，称取0.31g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.0；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到对比制剂2。
[0082]
对比例3
[0083]
室温下，称取0.12g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)和1.71g烟酰胺(购自西安悦来医药科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.0；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到对比制剂3。
[0084]
对比例4
[0085]
室温下，称取0.10g硼酸(购自陕西盘龙医药物流有限公司)和1.12g甘油(购自北京百灵威科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.0；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到对比制剂4。
[0086]
对比例5
[0087]
室温下，称取0.10g硼酸(购自陕西盘龙医药物流有限公司)和2.38g山梨醇(购自西安泰华医药科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.0；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到对
比制剂5。
[0088]
对比例6
[0089]
室温下，称取0.12g组氨酸(购自无锡必康生物工程有限公司)、0.73g烟酰胺(购自西安悦来医药科技有限公司)和1.02g山梨醇(购自西安泰华医药科技有限公司)，加水30ml搅拌至溶解；用2n naoh溶液或1n盐酸将ph调至ph7.0；加入12mg pdsp(如29-mer，购自全福生物科技股份有限公司)，搅拌至溶解，加水定容至40ml；经0.22μm针头式过滤器(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)过滤，得到对比制剂6。
[0090]
实施例12
[0091]
强制聚集(forced aggregation)实验
[0092]
将相同体积(如40ml)的对比制剂3以及本技术实施例1-5所制备的制剂置于烧瓶中，加入1.5cm磁子，在磁力搅拌器中室温下以1150rpm(revolutions per minute，转/分钟)搅拌速度进行搅拌，肉眼观察溶液出现可见异物，并且在不同时间点(0小时、24小时、48小时、72小时)通过微粒检测仪(gwj-16型微粒检测仪，购自天大天发科技有限公司)测量不溶性微粒的情况。
[0093]
对比制剂3和本发明制剂1-4在72小时时肉眼观察到的浑浊程度顺序如下：
[0094]
对比制剂3＞本发明制剂4＞本发明制剂3＞本发明制剂2＞本发明制剂1。
[0095]
另外，由于72小时肉眼看到所测试溶液发生了聚集现象，而第一次的不溶性微粒结果确不明显，因此第二次测的是时候加上了1μm的范围，就发现聚集大部分集中在1μm的范围。
[0096]
对比制剂3和本发明制剂1-5的不溶性微粒的测量结果如下所示：
[0097][0098][0099]
实施例13
[0100]
asap(accelerated stability assessment program)实验
[0101]
将相同体积(如40ml)的对比制剂2-6以及本技术实施例6所制备的制剂放入稳定性实验箱(型号zsw-100～zsw-2000，购自侦翔机电科技(上海)有限公司)中，在不同的温度下加速不同的时间(60℃加速3天、6天)，然后通过在0天、3天和6天时用hplc法检测所测试的制剂中相应的pdsp的纯度，通过3天时的纯度差值(即，3天时的纯度减去0天时的纯度)和6天时的纯度差值(即，6天时的纯度减去0天时的纯度)来评价制剂的化学稳定性。
[0102]
hplc法(根据中国药典2015年版四部通则0512)的具体检测条件和步骤如下：
[0103]
用表面多孔为填充剂(安捷伦advance bio peptide map 4.6mm
×
150mm，2.7μm，或效能相当的色谱柱)；以0.1％三氟乙酸为流动相a，以[(甲醇/乙腈/水＝5:4:1) 0.085％三氟乙酸]为流动相b，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为50℃；检测波长为220nm。
[0104][0105]
将完成加速实验后的制剂以精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得制剂中pdsp纯度。
[0106]
具体结果如下所示：
[0107]
制剂3天时的纯度差值6天时的纯度差值对比制剂26.7015.66对比制剂37.2612.90对比制剂48.0315.27对比制剂512.9617.15对比制剂67.2715.73本发明制剂66.4711.16
[0108]
上述结果显示，与对比制剂2、3、4、5或6相比，本发明制剂6具有改进的化学稳定性。
[0109]
实施例14
[0110]
原料：
[0111]
羧甲基纤维素钠(cmc)、高碘酸希夫(pas)试剂均来自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯(st.louis,mo,usa))。将含cmc(1％w/v)的平衡盐溶液(bss；alcone)用作媒介物。
[0112]
动物：
[0113]
7至8周龄雌性c57bl/6小鼠用于这些实验。
[0114]
方法：
[0115]
1.干眼模型
[0116]
如先前所述(barabino等人,2005)，通过将小鼠放入受控环境室(cec)中来诱发干眼。简言之，被放入cec中的小鼠暴露于相对湿度(rh)《25％、20℃至22℃的温度及15升/分钟的气流下，每天12小时。将不患有应力诱发干眼的未受应力(ns)小鼠保持在正常的环境(rh》50％，无气流，21℃至23℃的温度)下持续相同时间。
[0117]
2.角膜荧光素染色
[0118]
腹膜内注射舒泰(zoletil)(6mg/kg)与甲苯噻嗪(3mg/kg)的混合物来麻醉动物。用局部荧光素(fluor-i-strip,ayerst laboratories,philadelphia,pa)染色来测定角膜上皮损伤。角膜荧光素染色用裂隙灯生物显微镜在钴蓝光下检查且用数字相机摄影。角膜染料染色评分方式如下：无斑点染色记0分；当少于三分之一的角膜染色时记1分；当三分之二或更少染色时记2分；当超过三分之二染色时记3分(horwath-winter j 2013)。
[0119]
3.泪液产生的测量
[0120]
用酚红浸渍棉线(zone-quick；oasis,glendora，加拿大)测量泪液产生。如先前所述(dursun等人，2002)来验证该试验的有效性。用珠宝商镊子(jeweler forcep)固持棉线且放入外眦60秒。以被眼泪润湿后变红的棉线的毫米数来表示泪液产生。
[0121]
4.杯状细胞的pas染色
[0122]
动物安乐死后，眼睛以手术方式切除，固定在10％福尔马林中，石蜡包埋，切成5-μm段。这些切段经高碘酸希夫试剂(pas；sigma-aldrich)染色以测量上下结膜中的杯状细胞，且用配备有数字相机的显微镜检查及摄影。在来自各眼睛的五个切段中测量结膜中的pas阳性杯状细胞。
[0123]
实施例14.1用本发明制剂局部处理恢复由干燥应力诱发的眼表损伤
[0124]
为判定本发明制剂对干燥应力(ds)诱发的眼表缺陷是否具有治疗作用，在受控环境室(cec)中圈养小鼠14天以形成眼表破裂。在cec中14天后，我们使用荧光分数超过2的小鼠进行首次实验。随后，在维持相同干燥应力方案的情况下，用本发明制剂1-11或媒介物(含1％cmc的bss)再局部干眼处理5天(3次/天)。
[0125]
通过棉线试验的测量，在第0天，与未受应力(ns)小鼠相比，小鼠的泪液体积平均值显著降低。与媒介物组相比，在用本发明制剂1-11处理小鼠5天之后，眼睛中的泪液产生显著增加。
[0126]
实施例14.2本发明制剂部分恢复结膜中的杯状细胞数量
[0127]
杯状细胞主要存在于结膜穹窿的浅上皮中，并负责产生黏液性泪液。ns眼睛的高碘酸希夫(pas)染色显示杯状细胞在结膜上皮呈连续均匀型态。然而，14天的干燥应力后(第0天)，结膜的pas染色显示杯状细胞的数量相比于ns组明显减小。用本发明制剂1-11或媒介物处理5天，与经媒介物处理的对照，经本发明制剂处理的眼睛中结膜的杯状细胞数显著增多。总之，本发明制剂的处理确实挽救了杯状细胞的数量。
[0128]
实施例14.3用本发明制剂局部处理预防由干燥应力诱发的眼表损伤
[0129]
为研究本发明制剂是否能够抑制ds诱发的角膜上皮破坏，我们对小鼠施加14天的干燥应力方案，并用本发明制剂1-11每天3次局部处理这些小鼠。14天后，用荧光素染料染色评估角膜上皮缺陷，结果表明，与经本发明制剂处理的眼睛相比，经媒介物处理的眼睛中的角膜荧光素染色分数显著升高。此结果提示，本发明制剂对眼表抗干燥应力也表现出预防作用。
[0130]
实施例14.4本发明制剂抑制干燥应力诱发的炎症反应
[0131]
已经在实验动物中提出，在干燥应力诱发的干眼中，发炎会使眼表损伤增加(luo等人，2004；de paiva等人，2006)。在促炎介质中，已报导用tnf-α或白介素-1(il-1)阻断剂预处理的小鼠，干燥应力诱发的干眼得到改善[ji yw 2013；okanobo a2012]。小鼠在cec中圈养14天后(设定为第0天；未经处理的小鼠)，与在未受应力(ns)环境中圈养的小鼠相比，促炎介质的mrna水平，包括il-1β、tnf-α、il-6和mcp-1，分别显著上调了2-4倍。然而，与媒介物处理组相比，小鼠经本发明制剂1-11局部处理5天，眼部il-1β、tnf-α、il-6和mcp-1的mrna表达分别以1-2.5倍的因子被明显抑制。总之，结果表明本发明制剂减轻ds诱发的眼部炎症反应。
[0132]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以进行其它多种形式的修改、替换或变更。本领域人
员能够理解，本技术所描述的本发明技术方案的各个特征均可根据需要进行适当的组合。