药物组合物及其抑制膜ACE2表达的用途的制作方法

药物组合物及其抑制膜ace2表达的用途
1.相关申请的交叉引用本技术要求2020年4月10日提交的美国临时申请63008560号及2020年6月20提交的美国临时申请63042821号的优先权。本技术还要求2021年3月9日提交的美国实用申请17196121号的优先权。这些公开内容通过此引用以它们的整体将其全部教导并入本文。
2.研究领域本公开涉及利用含有维生素c和其他天然化合物的药物组合物抑制病毒利用血管紧张素转化酶2（ace2）受体进入细胞。
3.背景当前的covid-19流行病构成近代史上对全球健康的最大威胁之一。尽管已经作出很大努力，但仍然没有有效的疫苗或安全的药物成为全球控制该病毒流行的有前景的策略。因此，急需有效的预防和治疗策略，其不限于世界的更富裕地区，而是可提供全球方案。
4.冠状病毒（包括导致当前流行病的亚型）经由特定受体（血管紧张素转化酶2（ace2））进入体内细胞，许多细胞类型表达该受体，包括肺上皮细胞和血管系统的内皮细胞。
5.概述本公开涉及通过利用含有维生素c和其他天然化合物的组合物抑制病毒利用ace2受体进入细胞。在一个实施方式中，维生素c被用于抑制上皮细胞和内皮细胞中的ace2受体表达，这两种细胞被认为是严重急性呼吸道综合症冠状病毒2（sars-cov-2）的进入点。
6.在一个实施方式中，该药物组合物包含一种或多种以下化合物：l-抗坏血酸、抗坏血酸镁、抗坏血酸钙、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸盐、抗坏血酸磷酸钠或另一种形式的抗坏血酸盐，单独地或与其他活性的天然和合成产物组合。还公开了用于预防和治疗人和其他物种的病毒性感染和/或病毒性疾病的药物组合物。
7.还公开了由抗坏血酸和天然化合物组成的药物组合物。在另一个实施方式中，还公开了单独使用天然化合物来抑制用于病毒进入的血管紧张素转化酶2表达，从而治疗被感染的患者。在另一个实施方式中，天然化合物是黄芩黄素（baicalein）、茶黄素（theaflavin）、欧亚甘草（licorice）、十一烯酸中的至少一种，它们被单独使用或与抗坏血酸组合使用来治疗sars-cov-2患者。
8.对于哺乳动物，每种组分的每日生理剂量是：抗坏血酸的哺乳动物消耗量为10 mg至200000 mg，黄芩黄素和茶黄素各为至多2000 mg，天冬氨酸锌为0.1 mg至200 mg（以元素锌计），欧亚甘草为1 mg至200 mg/天，十一烯酸为1 mg至200 g。
9.公开了一种用于预防和治疗病毒感染的药物组合物，该病毒利用上皮细胞、内皮细胞和/或其他细胞类型的表面上的细胞受体进入细胞。公开了一种用于预防和治疗病毒感染/疾病的药物组合物，该病毒利用上皮细胞、内皮细胞和其他细胞类型上的血管紧张素酶2（ace2）受体进入细胞。
10.公开了一种用于预防和治疗严重急性呼吸道综合症相关冠状病毒(sars-cov-1)的感染的药物组合物，该病毒利用上皮细胞、内皮细胞和其他细胞类型的表面上的血管紧
张素酶2（ace2）受体进入细胞。
11.公开了一种用于预防和治疗中东呼吸道综合症相关冠状病毒(mers-cov)的感染的药物组合物，该病毒利用上皮细胞、内皮细胞和其他细胞类型的表面上的血管紧张素酶2（ace2）受体进入细胞。
12.公开了一种用于预防和治疗严重急性呼吸道综合症相关冠状病毒2(sars-cov-2/covid-19)的感染的药物组合物，该病毒利用上皮细胞、内皮细胞和其他细胞类型的表面上的血管紧张素酶2（ace2）受体进入细胞。还公开了用于以生理浓度口服的药物组合物。
13.公开了用于静脉内施用、用作气雾剂、吸入溶液、鼻喷雾剂或口喷雾剂、牙膏、漱口水、护肤霜、皮肤贴片、栓剂或任何其他医学上可接受的施用形式的药物组合物。公开了以各组分的物理混合物形式施用的药物组合物。
14.一种药物组合物，其中两种或更多种化合物彼此化学结合/共价连接。公开了一种药物组合物，其包含载体、稳定剂和/或其他医学上可接受的添加剂。
15.一种药物组合物，其中一种或多种化合物共价连接至载体分子。公开了一种药物组合物，其以纳米颗粒或任何其他医学上可接受的递送形式被施用至患者。
16.附图简述参考实施例和附图描述示例性实施方式，相似的参考标记代表相似元素，其中：图1显示抗坏血酸（7天补充）对aoec中的ace2表达的影响。
17.图2a、2b、2c、2d、2e、2f和2g显示不同浓度的抗坏血酸对ace2受体表达的影响，蛋白质水平，由western杂交测定。
18.图3显示抗坏血酸对ace2受体蛋白的mrna表达的影响。1 mm抗坏血酸（asa）时saec和haec中mrna水平的ace2表达。
19.图4显示抗坏血酸对saec中ace2表达的影响。
20.图5a和5b显示在存在抗坏血酸和抗坏血酸棕榈酸酯时saec上ace2的细胞表达的变化。
21.图6显示天冬氨酸锌和抗坏血酸对saec中的ace2表达的影响。
22.图7显示黄芩黄素和抗坏血酸对saec中的ace2表达的影响。
23.图8显示欧亚甘草乙醇提取物和抗坏血酸对saec中的ace2表达的影响。
24.图9显示十一烯酸和抗坏血酸对saec中的ace2表达的影响。
25.图10显示茶黄素和抗坏血酸对saec中的ace2表达的影响。
26.图11a、11b和11c显示病毒感染的一般机制（现有技术）。
27.本发明实施方式的其他特征将会从附图和下文的详细描述中明显看出。
28.详细描述ace2是存在于人体的许多细胞上的膜内在蛋白，其强表达于心血管系统、胃肠道系统、肾脏和肺系统。在表达ace2的细胞类型中，血管内皮细胞和肺部的肺泡细胞被特别充分地研究。表达ace2的细胞可作为靶细胞，它们在人体的分布可能表明2019-ncov的潜在感染路径(hamming 2004, wan 2020)。
29.多年来，我们成功测试了特定的微量营养素作为病毒感染的天然抑制剂并识别出这些天然化合物的与具体病毒类型无关的共同靶标。这些结果显示，维生素c（特别是与其他天然化合物如赖氨酸、绿茶提取物、硒和其他微量营养素组合时）可以在体外和体内影响
与下述病毒感染相关的关键机制：人流感病毒h1n1(jariwalla 2007)、禽流感h5n1(deryabin 2008)、禽流感h9n2 (barbour 2009)以及hiv (jariwalla 2010)。
30.这些微量营养素有效抑制病毒感染性、复制、传播并保护受感染组织免受感染相关的损害。而且，与抗病毒药物如tamiflu和金刚烷胺相比，这些天然成分已显示出更好且更持久的保护被感染细胞不受损害的效果(deryabin 2008)。
31.为了提供控制当前流行病的切实可行的解决方案，我们决定寻找维生素对ace2受体表达的潜在作用。我们假设这种维生素可潜在地抑制病毒附着和进入所需的这些细胞“锚定物”的表达。在这种假设中，我们受到今年早些时候中国临床报告的鼓舞，其成功使用高剂量静脉内维生素c来治疗covid-19患者。
32.方法和材料我们的研究显示，维生素c可降低血管内皮细胞中ace2的表达，ace2是导致当前流行病的冠状病毒结合并进入细胞的决定性受体。通过以膳食补充剂的形式口服即可在相对低浓度的该维生素时观察到实质性的降低。
33.人主动脉内皮细胞（haec）中血管紧张素转化酶2（ace-2）的表达：培养细胞：人主动脉内皮细胞（haec）购自lonza，并在塑料培养瓶中培养于egm-2生长培养基（lonza），37℃，5% co2。实验时，细胞铺板于胶原覆盖的96孔塑料平板（corning）中的100 mcl egm-2培养基，并生长7天至细胞融合。
34.细胞补充抗坏血酸：细胞在egm-2中以所示抗坏血酸（sigma）剂量补充7天，每个剂量设置6个重复。每2-3天以新鲜配制的抗坏血酸egm-2溶液更换实验培养基。
35.ace-2 elisa试验：以磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）洗涤孔板2次，并以3%甲醛/0.5% triton x100/pbs溶液在4℃固定1h，随后用pbs洗涤4次。加入在pbs中的200 mcl的1%牛血清白蛋白（bsa，sigma），平板在4℃孵育过夜。加入在100 mcl 1% bsa/pbs中的鼠抗ace-2单抗（santa cruz biotechnology)，在室温（rt）孵育1.5 h。用0.1%bsa/pbs洗涤3次后，向孔中加入结合有辣根过氧化物酶(hrp, rockland)的100 mcl抗鼠igg抗体，在rt孵育1h。以0.1%bsa/pbs洗涤3次后，残留的hrp活性通过在rt与100 mcl tmb底物溶液（sigma）孵育20 min并加入50 mcl的1n h2so4来测定，通过酶标仪（molecular devices）测定450 nm处的光密度来测定。结果表示为无抗坏血酸盐的对照的百分数（均值 /
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sd, n=6）。
36.表1：
图1显示，人内皮细胞中的研究表明维生素c能够以剂量依赖性方式抑制导致covid-19的病毒的细胞进入位点的ace2受体的表达。即使在50-100 mcm的低浓度（可通过维生素的膳食补充实现），该维生素也能够抑制ace2受体表达超过50%。更高的维生素c浓度（可通过静脉注射实现）导致这些人细胞的ace2表达的进一步抑制。
37.图2a、2b、2c、2d、2e、2f和2g显示抗坏血酸在蛋白质水平对ace2受体表达的作用。western杂交分析了人小肺泡上皮细胞和人肺大泡细胞在存在各种浓度的抗坏血酸时的ace2蛋白表达。按以下所述定量分析抗坏血酸（asa）对ace2的影响。
38.材料和方法：试剂：如无其他说明，所有试剂均购自sigma-aldrich (st. louis, mo, usa)。槲皮素二水合物（quercetin dihydrate）和天冬氨酸锌购自powder city (york, pa, usa)。银杏叶提取物购自monterey bay spice company (monterrey, ca, usa)，茶黄素购自cayman chemicals (ann arbor, mi, usa)。
39.培养的细胞人小气道上皮细胞（saec）购自atcc (manassas, va, usa)，在塑料培养瓶中培养于气道上皮细胞生长培养基（atcc），37℃，5% co2。实验时，将细胞（传代5-7代）铺板于覆盖胶原的96孔平板，每孔100 μl生长培养基，生长4-7天至融合。分离自肺的人微血管内皮细胞(hmec)购自lonza, (hayward, ca, usa)，在塑料培养瓶中培养于egm-2 mv生长培养基（lonza），37℃，5% co2。实验时，将传代5-7代的细胞铺板于覆盖胶原的96孔平板，每孔100 μl生长egm-2 mv培养基，生长3-5天至融合。
40.ace2 elisa试验实验时，向在100 μl每孔的细胞生长培养基中的细胞添加所示剂量的测试化合物，持续6天，每2至3天添加新鲜培养基。对照细胞生长培养基不含抗坏血酸。培养板孔用磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）洗涤2次，用3%甲醛/0.5% triton x-100/pbs溶液在4℃固定1h，随后用pbs洗涤4次。加入200 μl在pbs中的1%牛血清白蛋白-bsa (sigma-aldrich, st. louis, mo, usa)，平板在4℃孵育过夜。以100 μl/孔1% bsa/pbs溶液加入兔抗ace-2多抗
(sigma aldrich, st. louis, mo, usa)，室温（rt）孵育1.5小时。用0.1% bsa/pbs洗涤3次后，每孔加入100 μl的结合有辣根过氧化物酶(hrp, sigma, st. louis, mo, usa)的抗兔igg抗体，rt孵育1h。用0.1% bsa/pbs洗涤3次后，通过与100 μl/孔tmb底物溶液(sigma-aldrich, st. louis, mo, usa)在rt孵育20分钟来测定残留的hrp活性，随后加入50 μl/孔的1n h2so4，用酶标仪(molecular devices, san jose, ca, usa)测定450 nm处的光密度。
41.图2a和2b显示通过western杂交测定的不同浓度的抗坏血酸盐对saec和人微血管内皮细胞（hmvec）中的ace2蛋白表达的影响。图2a显示1 mm浓度的抗坏血酸盐可显著降低人微血管内皮细胞和人小气道上皮细胞中的ace2表达，如图2f和2g的western杂交所识别的。
42.结果以实验性添加-无添加对照的百分比形式表示（均值
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sd, n = 6）。从所有样品值中减去非特异性对照（未与抗ace2抗体孵育的孔）的均值（n=6）。
43.western杂交：saec和hmec铺板于6孔平板上并分别添加0.3、0.6、0.8和1 mm抗坏血酸。6天后，使用裂解缓冲液（50 mm tris-hcl [ph = 7.4], 1% tritonx-100, 150 mm nacl, 1 mm edta, 2 mm na3vo4, 和1x 完全蛋白酶抑制剂 [roche applied science, indianapolis, in, usa]）分别制备saec和hmec的全细胞裂解物。蛋白质浓度通过dc蛋白试验（bio-rad, hercules, ca, usa）测定。每孔50毫克的蛋白被分离于8%至16%梯度sds-page凝胶上（即使用标准laemmle氏法，基于tris的电泳法，不向样本缓冲液中添加β-me）并转移至pvdf膜。使用以1:250稀释的可商购的抗ace-2单抗(r&d, minneapolis, mn, usa)检测蛋白质，抗β肌动蛋白抗体(cell signaling, danvers, ma, usa)作为上样对照。
[0044]
qrt-pcr：将saec和hmec铺板于6孔平板上，并分别用0、0.3、0.6、0.8和1.0 mm的抗坏血酸刺激。6天后，使用rneasy plus mini kit (qiagen, germantown, md, usa)分离总rna。随后，使用rt
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ht first strand kit (qiagen, germantown, md, usa)将2500 ng的每种分离物转录为cdna并进行qrtpcr，ace2特异性引物：正向引物，5
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tgggcaaactctatgctg-3
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; 反向引物：5
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ttcattggctccgtttctta-3，β肌动蛋白特异性引物：正向引物，5
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catccgtaaagacctctatgccaac-3
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；反向引物，5
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atggagccaccgatccaca-3
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。进行pcr，2.5 mm mg
2
、脱氧核苷酸和hotstartaq dna聚合酶来源于quantitect sybr
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green pcr kit，每种引物使用浓度为0.3 μm，50 μl qpcr混合物（qiagen, germantown, md, usa），biorad cfx仪器(biorad, hercules, ca, usa)。qpcr循环条件根据制造商推荐编程，条件如下：95℃激活15分钟，40个循环：94℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。为核实qpcr产物的特异性和同一性，进行了熔解曲线分析。β肌动蛋白cdna的量被用于标准化用于测量的样品量。所有样品进行重复pcr反应，反应的均值用于计算表达水平。
[0045]
结果：分别显示抗坏血酸对ace2受体表达在蛋白质水平的影响。图2c显示在各种浓度的抗坏血酸的存在下孵育6天的人小肺泡上皮细胞和人肺微血管细胞中经western杂交分析的ace2蛋白表达的结果。定量分析（图2d）进一步证实ace2蛋白减少的剂量依赖性趋势（从0.3 mm抗坏血酸至1 mm）。在1.0 mm抗坏血酸时，在saec和hmec细胞系中分别观察到55%和60%的该蛋白的统计学显著减少。
[0046]
该结论进一步被维生素c在相对低浓度时已可抑制ace2受体在内皮细胞上的表达这一事实所支持，该浓度的维生素可通过该维生素的最佳口服摄入来实现，即，通过膳食补
充剂来实现。通过静脉内注射可获得高维生素c浓度，可解释临床试验（ref）中所报道的高维生素c剂量在sars-co-v2感染患者中的有益效果的内在机制。其中一个机制是ace2受体的降低。低和高浓度的维生素c时的ace2表达的降低表明该受体的表达受该维生素的严格调节。
[0047]
图3显示在存在1 mm抗坏血酸（asa）下抗坏血酸对saec和hmec中的ace2受体蛋白的mrna表达的影响。水平线表示0.5倍的变化。也做了实验来观察抗坏血酸对ace2受体蛋白的mrna表达的影响。为了进一步评估抗坏血酸是否可抑制rna水平的ace2水平，我们进行了qrt-pcr分析。图3的结果显示，在存在1.0 mm抗坏血酸的情况下，saec和hmec中的ace2基因表达分别降低0.61和0.54倍。抗坏血酸的这种向下调节趋势在两种类型的细胞中都是明显的，虽然未超过标准截止值（即0.5倍变化）。
[0048]
图4显示抗坏血酸对asec中ace2表达的影响。图4显示在800 mcm抗坏血酸盐浓度时，这些细胞中的膜ace2表达可被降低27%。
[0049]
图5a显示在存在抗坏血酸和抗坏血酸棕榈酸酯的情况下saec上的ace2的细胞表达的变化。在存在各种浓度的抗坏血酸及其脂溶性衍生物抗坏血酸棕榈酸酯的情况下，利用亲和靶向该受体的特异性抗体来测量saec上ace-2细胞表达的变化（图5b）。研究了在存在天然化合物的情况下抗坏血酸对ace2受体的细胞表达的影响。虽然使用分子建模技术的早期研究表明几种天然化合物可作为对抗冠状病毒的潜在候选物，但并未评估它们疗效的实验性证据，特别是它们对sars-cov-2靶向的细胞ace2受体的直接作用。理解这些方面是至关重要的，因为许多这些天然化合物都可在饮食中获得或者可作为用于不同保健方面（包括作为预防病毒感染的措施）的膳食补充剂服用。在存在抗坏血酸的情况下，ace2表达呈剂量依赖性降低，在0.6 mm浓度时降低约18%，在1.0 mm浓度时降低27%（图5a）。如图5b所示，当这些上皮细胞暴露于抗坏血酸棕榈酸酯时，即使已处于75 μm这一相比于抗坏血酸的低得多的浓度时，也导致ace2表达的50%抑制。在较高浓度(》100 μm)时，抗坏血酸棕榈酸酯表现出细胞毒性作用。
[0050]
我们使用人内皮细胞进行该研究是因为这些细胞已知可表达ace2，也因为这种细胞类型通常在感染性疾病的起始和进展中起到特别的作用。维生素c缺乏通常例如通过使血管连结组织不稳定、导致内皮细胞之间产生间隙和通过弱化血管基底膜促进病毒的感染性(gore 1965, friederici 1966, mahmoodian 1999)。所有这些细胞外作用损害了血管壁的天然屏障作用，包括肺毛细血管的内皮内衬。
[0051]
虽然这些数据是在体外利用人内皮细胞获得的，它们为入院covid-19患者的体内观察结果提供了重要的科学解释，这些患者因静脉内施用维生素c而康复。
[0052]
在一个实施方式中，我们评估了在存在经选择的天然成分（单独或与抗坏血酸组合）时，saec中ace2表达的变化。结果显示，所有这些天然化合物都显示在saec中的ace2表达的抑制性作用，但程度不同。单独使用茶黄素可抑制ace2表达，在浓度为33μg/ml 和50 μm时抑制率分别为约50%（图10）。将这些化合物与抗坏血酸组合进一步增强了它们对ace2表达的抑制作用，与茶黄素组合时从50%提高至87%，与黄芩黄素组合时从75%提高至82%。图6显示了抗坏血酸盐与天冬氨酸锌组合将锌的抑制效果额外增加40%，导致两个化合物一起实现62%的ace2表达抑制。抗坏血酸盐与十一烯酸组合也将ace2表达从18%（单独作用）降低至53%，当与aa组合时导致额外的35%的抑制作用（图9）。在所有测试的成分中，黄芩黄素最
有效，在25 μm浓度时，与无抗坏血酸盐对照相比，能够以75%抑制ace2表达（图7）。
[0053]
随后，我们评估了在存在经选择的天然成分（单独或与抗坏血酸组合）的情况下， saec中ace2表达的变化。结果显示于图7、图8、图9和图10.这些结果显示，所有这些天然化合物对saec中的ace2表达均有抑制效果，但程度不同。在所有测试的成分中，黄芩黄素最有效，在25 μm浓度时，与无抗坏血酸盐对照相比，能够以75%抑制ace2表达（图7）。图8显示欧亚甘草乙醇提取物与抗坏血酸对saec中ace2表达的效果。欧亚甘草本身显示出表达的显著性下降，当与抗坏血酸组合时，它具有显著的有益效果。
[0054]
单独使用茶黄素可抑制ace2表达，在浓度为33 μg/ml 和50 μm时抑制率分别为约50%（图10）。将这些化合物与抗坏血酸组合进一步增强了它们对ace2表达的抑制作用，与茶黄素组合时从50%提高至87%，与黄芩黄素组合时从75%提高至82%。图6显示了抗坏血酸盐与天冬氨酸锌组合将锌的抑制效果额外增加40%，导致两个化合物一起实现62%的ace2表达抑制。抗坏血酸盐与十一烯酸组合也将ace2表达从18%（单独作用）降低至53%，当与aa组合时导致额外的35%的抑制作用（图9）。与其他化合物相比，nac具有最小的对saec中ace2表达的作用（2 mm时18%抑制）。但是，nac与抗坏血酸组合时进一步降低ace2表达，导致26%抑制（图4d）。
[0055]
基于这些结果，我们提议微量营养素对ace2表达的作用的所揭示的机制（图11）。图12以三个小图形式显示病毒活动的一般性概念。图11a：导致当前流行病的病毒经由细胞壁中表达的“锚定物”（受体）进入血管内皮细胞和肺上皮细胞。缺乏该锚定物，病毒无法进入。图11b：通过阻断该“锚定物”尝试阻断病毒进入细胞已成为疫苗开发的首要靶标，成功尚未可知。图11c：我们已在人内皮细胞中显示，特定微量元素的组合物能够消除该病毒锚定物的活性（表达）。因此，病毒进入非细胞的“大门”被关闭。该天然手段具有控制当前流行病的潜力。
[0056]
该研究显示单独使用维生素c和与选定的天然生物活性化合物组合使用维生素c可抑制ace2受体蛋白的表达，该蛋白已吸引了广泛的科学关注，因为它是导致当前covid-19流行病的sars-cov-2的主要细胞进入途径。我们观察到，抗坏血酸本身可在蛋白和rna水平降低肺小气道上皮细胞（saec）和人微血管内皮细胞（hmec）中的ace2受体的细胞表达。抗坏血酸对ace2表达的抑制作用见于其较高浓度（0.8至1 mm之间）且在细胞暴露后6天。这个发现对于理解在covid-19患者中高剂量施用（例如静脉内施用）抗坏血酸的疗效的某些临床方面是有帮助的。静脉内递送途径使得能够实现比膳食摄入的1 mm抗坏血酸血浆浓度高得多的浓度，可能是导致ace2受体降低的机制之一。
[0057]
血浆中的抗坏血酸浓度在静脉内输注后由于肾脏清除而快速下降。但是，它们允许高达10 mm水平的持续性的细胞内抗坏血酸累积。在细胞培养基中发生类似的作用。细胞培养基中的抗坏血酸含量在细胞添加的数小时内由于抗坏血酸氧化而快速下降。但是，即使每2或3天添加新鲜细胞培养基，仍有持续性的细胞内抗坏血酸累积。因此，细胞培养物模型可被认为是相应体内环境的有效代表。这些结果的解释对于肺上皮细胞可能较不直接，因为肺泡上皮中的抗坏血酸含量的变化在其静脉内注射后并未被表征。抗坏血酸作用的分子机制研究及其对raas和病毒感染性的生理意义超出了本研究的范围，它应当是进一步研究的目标。但是，在我们的假设中，所观察到的抗坏血酸对ace2蛋白表达的细胞作用归因于
细胞内作用而非细胞外作用。我们的实验结果显示，更长时间的抗坏血酸暴露对于获得可测量的抑制作用是需要的。抗坏血酸棕榈酸酯比抗坏血酸在降低ace2方面更有效，并且在低得多的浓度时起作用，因为该脂溶性化合物可容易跨越细胞膜并且比抗坏血酸更稳定。
[0058]
本研究的另一个新颖性方面包括各种天然化合物在抑制ace2受体表达方面的效果的实验性证据，这些天然化合物的作用可通过它们与抗坏血酸的相互作用被进一步增强。虽然一些分子建模研究显示单个天然化合物抵抗冠状病毒的潜在作用13，它们并未包括实验性测试，也未评估它们的组合的最终协同效果。天然化合物效果的实验性证据在阐释有关冠状病毒感染的具体机制方面非常少，据我们所知均未研究ace表达。我们研究中所选择的所有化合物均证实与抗坏血酸的协作性效果，虽然程度不同。几个综述研究显示维生素c和其他天然化合物在covid-19患者中的可能治疗作用，以作为辅助药物治疗。除了维生素c已在临床上被用于covid-19患者之外，这些建议通常基于回顾天然化合物的一般性抗病毒和免疫增强作用的可用数据而获得。
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但是，本发明是第一个系统的实验性方案以评估天然化合物与抗坏血酸盐协同起作用来阻碍冠状病毒感染的关键机制。黄芩黄素和茶黄素单独使用以及与抗坏血酸组合使用，通过包括显著性降低saec中细胞ace2受体表达等方式，对于对抗covid-19流行病可能是有益的。茶黄素与抗坏血酸盐组合显示出最强的87%的ace2表达抑制。我们的发现显示维生素c在人肺泡上皮细胞和微血管内皮细胞（sars-cov-2影响的2种主要细胞类型）中在不同的分子水平都具有一致的且显著的降低ace2表达的作用。在微血管内皮细胞中，抗坏血酸可在蛋白质（western杂交）和rna水平抑制ace2表达。我们研究的结果显示，saec和hvec细胞中ace2受体表达的抗坏血酸依赖性调节可能是covid-19危重症患者静脉内抗坏血酸施用产生有益治疗效果的至少一种细胞机制。而且，这些结果表明，抗坏血酸与经选择的天然化合物组合可进一步增强其效果，这应当在未来研究和设计针对当前流行病的预防性和治疗性康复措施时考虑。