基于TPGS修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体的制备方法与应用

基于tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体的制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种基于tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体的制备方法与应用。


背景技术：

2.白藜芦醇（res）又称芪三酚（3,4',5-三羟基-1,2-二苯基乙烯），是一种药食同源的多酚类化合物，存在于葡萄、毛藜芦、决明子、虎杖、桑椹等多种植物中。res生物活性很强，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等药理作用。但白藜芦醇水溶性低、性质不稳定、体内生物利用度较低、代谢迅速，因此不足以发挥相应的药理活性。因此，如何提高白藜芦醇稳定性及生物利用度，成为开发利用的关键。
3.纳米晶体技术是近年来针对难溶性药物开发的一种将药物粒径降低到纳米水平(1～1000nm)的特殊方法，药物应用纳米技术后粒径小、载药量高、比表面积大，可有效提高难溶性药物的溶解度和溶出度。纳米晶的制备方法一般分为top-down和bottom-up法，还有将两种技术进行组合的制备方法。
4.纳米晶虽然在提高难溶性药物的口服生物利用度方面发挥着重要作用，但纳米晶属于热力学不稳定系统，近年来，很多研究都通过对纳米晶表面进行修饰达到增加稳定性、延长药物在体内滞留时间或其他目的。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供基于tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体的制备方法与应用，将白藜芦醇纳米晶体负载于tpgs修饰的脂质体，tpgs可以减小脂质体的粒径并增加其稳定性，同时可以促进药物进入肿瘤细胞抑制p糖蛋白（p-gp）介导的外排作用。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：提供了基于tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体的制备方法，包括以下步骤：s1：将白藜芦醇与稳定剂混合超声分散，并加入氧化锆珠在磁力搅拌下研磨，研磨后将纳米悬浮液吸取，得到白藜芦醇纳米晶溶液；s2：将大豆卵磷脂、胆固醇、tpgs用有机溶剂溶解，将溶液减压蒸发除去有机溶剂，至形成一层乳白色薄膜，加入白藜芦醇纳米晶溶液与缓冲溶液超声水化，然后再使用超声探头超声，得到tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体；所述稳定剂为十二烷基硫酸钠，白藜芦醇与稳定剂的质量比为2:1；所述大豆卵磷脂、胆固醇、tpgs的质量比为20:2:1或10:2:1或6:3:2；所述有机溶剂为三氯乙烷。
7.维生素e聚乙二醇1000琥珀酸酯（tpgs）是维生素e的水溶性衍生物，由维生素e琥珀酸酯的羧基与聚乙二醇的羟基反应而成。由于其既含有维生素e亲酯基团，又含有聚乙二醇亲水长链，因而具有较好的表面活性剂性质和水溶性，能显著增加难溶性药物的在胃肠道的吸收，提高生物利用度。
8.进一步的，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，白藜芦醇纳米晶溶液与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1:1。
9.进一步的，氧化锆珠的规格为0.5mm。
10.进一步的，磁力搅拌的转速为1500r/min，研磨时间为12h。
11.进一步的，所述超声水化的时间为30min。
12.进一步的，所述超声探头的功率为150w，超声时间为10min，且超声8s，间隔4s。
13.一种基于tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体在制备口服制剂中的应用。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明的tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体，将难溶性药物白藜芦醇制备成白藜芦醇纳米晶体，可提高药物溶解度和溶出速率，且采用的微型介质研磨法技术，操作简单，不涉及有机溶剂，不需要专门的设备，成本低；2、本发明的tpgs修饰的白藜芦醇纳米晶脂质体，用tpgs修饰脂质体可以减小脂质体的粒径并增加其稳定性，并促进脂质体在转运，减弱被网状内皮系统的细胞识别并摄取，延长药物在体内的作用时间。
附图说明
15.通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1是白藜芦醇纳米晶溶液与冻干粉图。
16.图2是白藜芦醇纳米晶体的粒径与电位图。
17.图3是白藜芦醇纳米晶体的透射电镜图。
18.图4是白藜芦醇原料药与白藜芦醇纳米晶体的扫描电镜图。
19.图5是tpgs-lipo@res-nc图。
20.图6是tpgs-lipo@res-nc的粒径与电位图。
21.图7是tpgs-lipo@res-nc的透射电镜图。
22.图8是res-nc、tpgs-lipo@res-nc的稳定性实验图。
23.图9是res原料药、res-nc与tpgs-lipo@res-nc的体外释放实验图。
24.图10是tpgs-lipo@res-nc的caco-2细胞毒性实验图。
25.图11是c6@lipo、c6与@tpgs-lipo的caco-2细胞摄取、细胞定位实验图。
具体实施方式
26.下面结合附图和实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
27.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本技术。
28.一、tpgs脂质体包载白藜芦醇纳米晶体口服制剂的制备1、白藜芦醇纳米晶体（res-nc）的制备以西林瓶作为研磨室，以磁力搅拌器为动力装置，采用0.5mm氧化锆珠为研磨介
质。将磁转子加入洁净的西林瓶，称取20mgsds于西林瓶，加入2ml去离子水超声溶解，再称取40mg白藜芦醇加入西林瓶超声分散，然后加入5ml氧化锆珠，封口后通过磁力搅拌器以1500r/min的转速带动氧化锆珠研磨12小时。研磨结束后用注射器将纳米混悬液吸取于ep管，后分五次取3ml取离子水于西林瓶洗涤，并将洗涤液一并加入ep管即得res-nc。
29.将res-nc冷冻干燥得冻干粉。res-nc溶液及冻干粉如图1所示；粒径与电位图如图2所示；透射电镜图如图3所示；白藜芦醇原料药与纳米晶体的扫描电镜图如图4所示。由图可知，由微型介质法制备的白藜芦醇纳米晶粒径为（138.0
±
3.5）nm（n=3），pdi值为0.232
±
0.096（n=3），电位为-7.15
±
0.02(n=3)。通过sem观察白藜芦醇药物和res-nc，然后通过tem表征res-nc。两次电镜表征结果表明，纳米晶体具有较均匀的粒径分布。这与粒度仪测得的结果基本一致。
30.2、白藜芦醇纳米晶体脂质体（tpgs-lipo@res-nc）的制备薄膜分散法制备白藜芦醇纳米晶体脂质体。称取大豆卵磷脂、胆固醇、tpgs（质量比为20:2:1、10:2:1、6:3:2），用12ml有机溶剂三氯乙烷溶解，将溶液加入圆形烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机溶剂，至瓶壁上形成一层乳白色薄膜，加入10ml白藜芦醇纳米晶溶液与10ml磷酸盐缓冲溶液（pbs溶液）超声水化30min，然后再使用超声探头超声10min（功率150w，超声8s、间隔4s），得到白藜芦醇纳米晶脂质体，状态图如图5所示。
31.将白藜芦醇纳米晶脂质体放入-80℃冰箱冷冻层进行预冻干，预冻12小时后再将其转移至冻干机中进行冻干，得冻干粉备用。
32.将tpgs-lipo@res-nc适当稀释，用粒度仪测定tpgs-lipo@res-nc的粒径（113
±
5.21）nm（n=3），pdi为（0.242
±
0.010)，电位为(-3.43
±
1.48)mv，如图6所示。tpgs-lipo@res-nc的形貌通过tem表征（图7）。tpgs-lipo@res-nc呈球形，大小与实测粒径一致。
33.二、白藜芦醇纳米晶体脂质体（tpgs-lipo@res-nc）的表征1、tpgs-lipo@res-nc的包封率测定将1ml制备好的tpgs-lipo@res-nc用甲醇破乳，稀释成所需浓度，并过0.22μm的微孔滤膜，通过紫外分光光度计测定在波长为356nm处的吸光度，并按照公式计算tpgs-lipo@res-nc的包封率。
34.包封率（%）=（制剂中所包载药物含量/药物的初始加入量）
×
100%。
35.进行了3组平行验证试验，进行了3组平行验证试验，实验结果如表1所示。表1为包封率验证试验结果。
36.表1包封率验证试验结果
实验结果表明，当大豆卵磷脂、胆固醇、tpgs的质量比为10:2:1时，包封率最高，三次测试的包封率分别89.97%、89.21%、88.32%，平均包封率为89.17%，sd为0.008，rsd为0.93%，小于2%，说明试验重现性良好。
37.2、tpgs-lipo@res-nc的稳定性实验对tpgs-lipo@res-nc进行稳定性实验，定期测量30天内tpgs-lipo@res-nc粒径、多分散指数（pdi）、zate电位的变化。结果如图8所示，制剂粒径、多分散指数、电位在30天内均无明显变化，稳定性良好。
38.3、res原料药、res-nc和tpgs-lipo@res-nc的体外释放实验采用透析袋扩散法研究了res原料药、res-nc和tpgs-lipo@res-nc在不同介质（ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液、ph=1.2hcl的溶液以及双蒸水）中的体外释放情况。res、res-nc和tpgs-lipo@res-nc分散在5ml含0.5%sds的pbs中。并置于截留分子量为14000da的透析袋中。释放介质体积为20ml，转速为100r/min，温度保持在37.0
±
0.5
°
c。1ml等分试样在预定的时间间隔取出从释放介质中加入等体积的pbs和0.5%sds溶液到释放介质中。然后将所有样品通过0.22μm孔径过滤器进行过滤。在高效液相色谱(hplc)上测定药物浓度，并计算累积药物释放量。
39.累积释放量的计算公式如下：。
40.在该公式中，er％代表释放的药物累积量，ve代表不同时间点的采样体积。在不同时间点采样时，ci表示实时药物浓度；vo表示每个离心管中释放介质的体积；m
drug
表示每个透析袋中最初包含的res质量。
41.不同制剂在不同介质中的体外累积释放曲线如图9所示。从图9可以看出tpgs-lipo@res-nc在磷酸盐缓冲液中36h内的释放率(87.21
±
1.86)%，高于游离药物溶液(38.77
±
2.089%)。同样，94.91
±
2.60%的药物在hcl溶液中从载药脂质体中释放出来，而游离药物在36h内的释放率为49.31
±
1.75%%。同期，载药脂质体在双蒸水中的药物释放率为89.21
±
1.41%，而在游离药物悬浮液中仅为35.01
±
2.58%。观察到res-nc和tpgs-lipo@res-nc在三种介质中的溶出速度都快于游离药物。也可以看出tpgs-lipo@res-nc在三种介质中的溶出速度都比res-nc慢，但36h内的累积释放与res-nc相差不大，说明res-nc提高了res的溶解度。tpgs-lipo@res-nc提高了res-nc在外部环境中的稳定性。
42.4、tpgs-lipo@res-nc的caco-2细胞毒性实验采用mtt法，测定不同浓度tpgs-lipo@res-nc对caco-2的细胞毒性。结果表明，tpgs-lipo@res-nc对caco-2细胞的毒性较小，在培养48h之后，tpgs-lipo@res-nc的浓度为200ug/ml时，细胞存活率依然大于80%，因此证明tpgs-lipo@res-nco具有很低的细胞毒性。实验结果如图10所示。
43.5、c6@lipo、c6@tpgs-lipo的caco-2细胞摄取、细胞定位实验以香豆素为荧光染料，采用实施例一中的制备方法制备c6@lipo与c6@tpgs-lipo。观察不同浓度制剂与不同时间下caco-2细胞对c6、c6@lipo和c6@tpgs-lipo的摄取情况。
44.用细胞核染色法对细胞核进行特异性染色，利用倒置荧光显微镜观察c6@tpgs-lipo被caco-2细胞内吞后在细胞内的分布情况。
45.实验结果表明，随着不同制剂摄取时间和浓度的增加，细胞荧光强度会随之增加，说明制剂对caco-2细胞具有时间和浓度依赖性。从图11可以看出，caco-2细胞对c6@tpgs-lipo具有更高的摄取量，这是因为在caco-2细胞模型中，tpgs可显著促进caco-2细胞的摄取，说明了经tpgs修饰过的中脂质体可以提高药物的口服利用度，从而证明了tpgs-lipo@res-nc具有更好的生物利用度。实验结果如图11所示。
46.本发明针对白藜芦醇不溶于水、生物利用度低的问题，采用微型介质研磨法将白藜芦醇制备成纳米晶体，纳米晶体粒径小、载药量高，提高了白藜芦醇溶出速率。再通过tpgs修饰的脂质体包载白藜芦醇纳米晶体，提高了纳米晶体的稳定性，增强了caco-2细胞对白藜芦醇的摄取。结合两种制剂的优点共同提高了白藜芦醇的生物利用度。
47.本领域技术人员应当理解，本技术中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本技术中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。