一种检测水产品镉和氨苄青霉素的电化学发光传感器制备方法

1.本发明涉及一种电化学发光适配体传感器和这种传感器的制备方法以及使用方法，属于电化学发光适配体传感器技术领域。


背景技术：

2.水产食品是我国动物性食品的重要来源，是我们日常生活中食用比例较大的一部分食品，它富含各种氨基酸，易于人体吸收，食用价值高于一般肉类，更是高血脂、高血压患者的最佳食品，然而，随着工业社会的推进，水产品的质量严重受到了影响，致使水产品被重金属污染、药残超标、抗生素含量过高等，其中被重金属和抗生素污染后的水产品，人们误食后对身体带来的伤害最大，针对水产动物而言，往往受到有毒金属和抗生素的污染，包括:外源性的、内源性的等，而外源性的污染，即饲料带来的污染、水质带来的污染、空气带来的污染、以及药物带来的污染等，最终这些危害身体健康的有毒有害的金属以及抗生素通过食物链进入人体，危害神经和血液系统、胃肠道、心血管、肾脏系统以及免疫系统，所以开发一种便捷、高效、快速和实用的水产品中重金属和抗生素污染的分析方法显得格外重要，这一工作对保护生态环境、提高食品质量、保护人类安全具有重要的理论和实际意义。
3.重金属和抗生素的检测方法：目前重金属的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、原子吸收光谱法、分光光度法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、比色法等这些传统的重金属检测方法虽然应用比较成熟、灵敏度和准确性较高、检测限低、检测范围宽等，抗生素的检测主要有液相色谱法、酶免疫分析法、毛细管电泳法等，但这些仪器价格昂贵、耗时长、样品处理复杂、携带不方便、无法连续监测及现场测定等，极大地限制了其广泛应用，因此，寻求一种简单、快速、灵敏的重金属离子和抗生素同时检测技术，仍然是人们不断追求的目标，为了切实保障食品安全及人类生命安全，需要建立高效、灵敏、实用的重金属和抗生素快速检测方法。
4.发明的目的在于提供一种能克服上述问题以及制备简单、操作灵活、高灵敏度、高准确性、选择性及稳定性好，构建的电化学发光适配体传感器无需酶的催化作用，直接通过适配体与靶标物质结合，并且能够实现同时检测两种物质，可实现对水产品中重金属镉离子和氨苄青霉素特定检测的电化学发光适配体传感器的制备方法。


技术实现要素：

5.技术方案为：一种检测镉重金属和氨苄青霉素的适配体传感器的制备方法，其特征在于：适配体传感器的敏感界面组成包括硫化铋和金的(bi2s3@au)复合材料、金和鲁米诺 (au@luminol)复合材料、硫化镉(cds qds)，进而固定重金属镉和氨苄青霉素的适配体。
6.所述的一种同时双检的适配体传感器的制备方法，其特征在于：玻碳电极(d＝3 mm)的清洗，适配体传感器敏感界面的构建及过程表征(制备bi2s3@au、au@luminol， cds qds，利用纳米花状bi2s3@au对适配体进行固载、au@luminol和cds qds与识别靶标物质的适
配体相连形成生物发光探针，共同修饰电极)，适配体传感器工作曲线的建立，适配器传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。
7.所述的一种同时双检的适配体传感器的制备方法，其特征在于：实验条件的优化，主要包括适配体浓度、测试底液的ph、底液浓度以及适配体与靶标物质的孵育时间，所制备的适配体传感器的工作曲线为：y＝7574.57-1051.10lgx(r2＝0.998)，y＝5608.49
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916.00lgx(r2＝0.996)，适配体传感器性能检测包括特异选择性、重现性、稳定性以及适配体传感器对水产品回收率的测定。
8.目标离子电化学发光检测：采用电化学发光检测法利用三电极体系在最佳实验条件下检测水产品，根据检测结果中电化学发光强度值进行分析即可获知电化学发光强度峰值大小与镉金属离子、氨苄青霉素的浓度成反比，据此可获得靶标物质的浓度信息。
9.本发明的制备原理为：利用核酸适配体的高亲和力特性和碱基互补原则，将适配体末端交联到固相载体作为捕获分子，去捕获待测标本中的靶标物质，同时适配体与相应的发光指示剂相连接，作为检测靶标物质的信号分子，当信号分子与相应的待测标本结合后就会产生信号，从而达到检测目的，本发明采用柳叶状的纳米花bi2s3@au、au@luminol以及 cds qds对玻碳电极进行修饰，由于纳米花状的bi2s3@au高比表面积和导电性，不仅为适配体提供更多的活性位点，而且增加电极表面电子传输能力和稳定性，通过bi2s3@au的高比表面积，从而为识别靶标物质的适配体固定提供了良好的传感器界面，保持了镉重金属和氨苄青霉素适配体的有效固定量，进而增加了传感器的检测精度，同时利用au@luminol和 cds qds两种发光物质，在不同电位下显示电化学发光信号值，实现两种靶标物质镉离子和氨苄青霉素的检测，经上述步骤制备的适配体传感器，简单灵敏，稳定性和特异性较好，重现性好，而且回收率符合要求。
10.为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种同时双检的适配体传感器的制备方法，其特征在于：(1)适配体传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试，并且在循环伏安法下测试电极，直到符合；(2)清洗好的玻碳电极表面滴涂分散均匀的纳米花 bi2s3@au，然后把适配体dna1链固定在bi2s3@au上，并用六巯基一己醇(mch)对未结合的位点进行封闭，之后滴涂构建好的生物发光探针au@luminol和cds qds与适配体 dna1链碱基互补配对，最后加入两种靶标物质；适配体传感器制备结束后，放入4℃冰箱里保存备用。
11.为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种同时双检的适配体传感器的制备方法，其特征在于：(1)将上述制备好的适配体传感器在工作底液中用电化学发光方法检测，得到峰值和两种靶标物质的关系；(2)配置一系列的镉离子和氨苄青霉素浓度标准液，进行电化学发光方法测定，进一步得到上述制备的适配体传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(3)配置一系列常见的重金属和抗生素溶液，以检测所制备的适配体传感器的抗干扰性；(4)通过电化学发光法多次验证上述适配体传感器的稳定性；(5)对实际水产品进行分析得出适配体传感器的回收率。
12.所述适配体传感器的制备工艺如下：在玻碳电极(gce)上滴加6μl的纳米花 bi2s3@au，在室温下将电极进行干燥，得到bi2s3@au/gce。接着在bi2s3@au/gce电极上滴加6μl 200nm的适配体dna1链，于室温下与bi2s3@au通过化学键au-s键结合，再滴加mch封闭非特异性结合位点，于室温下待电极自然晾干，最后再滴加6μl的 au@luminol和cds qds生物发光探针，等待电极表面干燥，适配体传感器制备完成，保存在4℃条件下备用。
附图说明
13.图1电化学发光传感器的基底材料表征。
14.图2电化学发光传感器的发光材料表征。
15.图3电化学发光传感器的电化学表征。
16.图4电化学发光传感器的适配体浓度优化。
17.图5电化学发光传感器孵育时间优化。
18.图6电化学发光传感器底液ph优化。
19.图7电化学发光传感器底液浓度优化。
20.图8电化学发光传感器测量不同浓度重金属镉和氨苄青霉素的标准曲线。
21.图9电化学发光传感器特异性研究。
22.图10电化学发光传感器重现性研究。
23.图11电化学发光传感器稳定性研究。
具体实施方式
24.实施例：(1)bi2s3@au的制备：将0.5gbi(no3)3·
5h2o和20ml乙二醇均匀混合。然后向溶液中添加0.4g硫脲，随后，将均匀混合物转移到油浴锅中，并在160℃下保持20小时，然后使用乙醇和超纯水通过几个离心循环收集产物，并在60℃的真空条件下干燥12小时，然后将产物bi2s3重新分散，加入配置好的aunps溶液，搅拌2小时，使得aunps颗粒在bi2s3表面生长，之后离心洗涤，最后把bi2s3@au重新分散备用；(2)au@luminol的制备：为了制备au@luminol，将4ml0.01m的鲁米诺和0.6ml的0.1mnabh4用冰冷却，然后加入20ml的2.5
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10-4
mhaucl4冰浴中搅拌10分钟，溶液颜色变为紫红色，表明aunps的生成，最后将产物在室温下搅拌6h，以促进胶体au@luminol的生长；(3)cdsqds的制备：将l-半胱氨酸(0.363g)，cdcl2.5h2o(0.275g)和na2s.9h2o(0.762g)溶解在15.0ml、45.0ml和45.0ml超纯水中，以制备相应的溶液，接下来，在搅拌下将新制备的l-半胱氨酸溶液注入cdcl2溶液，随后，将所得混合物注入na2s溶液中，在75℃下连续回流6小时，在12000rpm下离心15分钟分离所得cds量子点，并分别使用无水乙醇和超纯水洗涤；(4)au@luminol-dna2和cdsqds-dna3探针的制备：在制备的1mlau@luminol溶液中加入10μl的10μm适配体dna2溶液，将混合溶液在室温下搅拌6h，从而获得dna2功能正常的au@luminol探针，在1ml的cdsqds溶液中，加入40mmedc和10mmnhs的溶液，cdsqds表面的羧基被激活，然后将10μl适配体dna3(1μm)滴入溶液中，上述混合物在37℃下充分反应2h，生成的cdsqds-dna3在10000rpm下离心10分钟，以除去未结合的dna3，并用无水乙醇和超纯水洗涤两次；(5)玻碳电极的清洗：玻碳电极修饰前，用0.3μm的al2o3于麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复2次，无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；(6)玻碳电极的测试：在含有0.1mkcl和5mm[fe(cn)6]
3-/4-的0.01mpbs溶液中跑
循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度为50mv/s，扫描电位为-0.1～0.6 v，当所述循环伏安曲线中的氧化还原峰电位差在100mv以下时，则所述玻碳电极可进一步使用，否则要返回步骤(5)中继续处理所述玻碳电极，直至符合要求；(7)在玻碳电极(gce)上滴加6μl的纳米花bi2s3@au，在室温下将电极进行干燥，得到bi2s3@au/gce，接着在bi2s3@au/gce电极上滴加6μl 200nm的适配体dna1链，于室温下与bi2s3@au通过化学键au-s键结合，再滴加mch封闭非特异性结合位点，于室温下待电极自然晾干，最后再滴加6μl的au@luminol和cds qds生物发光探针，等待电极表面干燥，适配体传感器制备完成，保存在4℃条件下备用；(8)采用三电级体系，利用电化学发光法对测试底液ph、底液浓度、适配体浓度和孵育时间等实验因素进行优化，测试底液ph的范围为6.5～9.0，测试底液浓度的范围为4 nm～24nm，适配体浓度的范围为50nm～400nm,孵育时间的范围为20～70min；(9)在最佳测试条件下使用电化学发光法进行进行浓度梯度定量分析测试，适配体浓度为200nm，测试底液ph为7.5，测试用的靶标物质浓度区间为1pg/l～1mg/l，得到回归方程分别为y＝7574.57-1051.10lgx(r2＝0.998)，y＝5608.49-916.00lgx(r2＝0.996)；(10)在测试体系中分别加入铜、铁、银、锌、镍、汞、钴、镁、铅干扰离子，以及四环素、链霉素、土霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素等抗生素，通过电化学发光法进行测试，以检测其抗干扰性；选取制备好的电极重复测定六次，检测其稳定性；(11)将水产品研磨、过滤、离心后，加入镉重金属和氨苄青霉素溶液，进行实际样品检测分析。
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此种电化学发光适配体传感器不仅成本低廉，操作简单，检测时间短，抗干扰能力强，稳定性好，特异性强，而且同时检测水产品中的镉重金属和氨苄青霉素，符合我国水产品中镉重金属和氨苄青霉素快速检测技术发展和国际化要求。