蛇床眀素在杀灭松材线虫中的应用

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1.本发明属于林业病虫害防治技术领域，涉及一种蛇床眀素在杀灭松材线虫中的应用，其在500μg/ml浓度下在72小时对松材线虫的校正死亡率达97％。


背景技术：

2.松材线虫病，又称松萎蔫病，是当今全球森林生态系统中最具危险性、毁灭性的森林病害之一，具有极强的传染性，被称为“松树的癌症”。该病于1982年传入我国，呈跳跃式快速扩散，至2021年底，疫情已蔓延至19省份的742个县级发生区，发生面积约2574万亩，严重威胁我国森林资源、生态及生物安全，已成为国家重大生态灾害。松材线虫作为松材线虫病主要的病原也被认为是造成我国森林资源损失最为严重的重大外来有害生物，防控形势极其严峻。目前防控松材线虫采用的广谱合成杀线剂易使线虫产生耐药性，且具有高毒、高残留等缺陷，这使得生态友好的天然杀线剂的开发显得尤为迫切。
3.自然界植物蕴含着丰富的生物活性物资资源，目前，从植物中提取天然的杀线活性成分已得到了国内外的广泛关注。蛇床子伞是形科蛇床属植物蛇床的干燥成熟果实，为我国传统的中草药，广泛分布于华东、中南、西南、西北、华北、东北等地，取材便捷，其中含有丰富的植物活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗诱变、抗肿瘤、抗炎等生物活性。
4.目前，还没发现关于蛇床子植物中的蛇床明素在杀灭松材线虫方面的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛇床明素在杀灭松材线虫中的应用，蛇床明素存在于天然植物蛇床子中，具有强杀松材线虫活性，为开发环境友好的植物源杀线药剂或仿生合成活性更优越的植物源衍生杀线剂提供化学结构模型。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供一种蛇床明素在杀灭松材线虫中的应用，其在500μg/ml浓度下在72小时对松材线虫的校正死亡率达97％。
7.所述蛇床明素存在于天然植物蛇床子中。
8.所述蛇床明素的制备方法，具体步骤如下：
9.第一步，将蛇床子植物原料于粉碎机中粉碎，得蛇床子干粉，与无水乙醇混合后室温下通过超声波震荡辅助浸提8小时，蛇床子干粉与无水乙醇料液比为1g:5ml，浸提液真空抽滤得到蛇床子乙醇初提液，滤渣按上述方法重复浸提两次，合并蛇床子乙醇初提液；
10.第二步，将蛇床子乙醇初提液采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，得到蛇床子乙醇初提物；
11.第三步，乙醇初提物经体积比为1：1的乙酸乙酯-水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压蒸馏浓缩，获得蛇床子提取物；
12.第四步，将蛇床子提取物采用硅胶柱(200-300)层析进行分离，以正己烷-乙酸乙酯溶剂体系进行梯度洗脱，一共5个梯度，前4个梯度的正己烷与乙酸乙酯体积比依次为5:1、2:1、1:1、1:6，最后1个梯度为100％的乙酸乙酯，洗脱组分经硅胶(gf
254
)薄层层析方法检
测，合并相同组分并分别浓缩，最终共18个组分：按洗脱顺序为fr.1-fr.18，fr.2组分即为蛇床明素。
13.蛇床明素的化学结构式为：
[0014][0015]
将从蛇床子提取物中分离得到的香豆素类化合物蛇床明素采用含0.5％tritonx-100的5％的二甲基亚砜(dmso)溶液溶解，配制成浓度为1mg/ml的溶液，取50μl，加入到96孔板相应的孔中，再加入50μl线虫悬浮液，混匀，体系中蛇床明素终浓度为500μg/ml；以含0.5％tritonx-100的5％dmso溶液为对照，置于24℃的避光培养，在体式显微镜下每24h观察一次，记录松材线虫的总数和死亡数量，连续观察72h，计算校正死亡率；杀松材线虫活性实验结果表明，蛇床明素在72h时浓度为500μg/ml下对松材线虫的校正死亡率为97％。
[0016]
本发明与现有技术相比，开发了蛇床明素的新用途，也为杀灭松材线虫提供了天然植物提取物有效成分，天然植物蛇床的果实蛇床子来源便捷，提取方法简单，成本低廉，低毒环保，确立了蛇床明素是强杀松材线虫活性的成分，可应用于开发环境友好的植物源杀松材线虫药剂。
附图说明：
[0017]
图1为实施例1提取的蛇床明素的质谱图示意图。
具体实施方式：
[0018]
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述。
[0019]
实施例1
[0020]
本技术涉及蛇床明素的提取，从蛇床子植物中进行提取，具体步骤如下：
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(1)取蛇床子植物原料100g于粉碎机中粉碎，得到蛇床子干粉，加入500ml 95％的无水乙醇，于室温超声波振荡辅助浸提8h，浸提液真空抽滤得到澄清的蛇床子乙醇初提液，滤渣重复浸提两次，合并蛇床子乙醇初提液；将蛇床子乙醇初提液采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，得到蛇床子乙醇初提物12.46g。于上述蛇床子乙醇初提物中加入500ml蒸馏水，超声波振荡辅助悬混，加入等体积的乙酸乙酯，充分摇匀，静置4h，重复萃取2次，合并乙酸乙酯相，采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，得到蛇床子提取物5.83g；
[0022]
(2)将蛇床子提取物采用硅胶柱(200-300)层析进行分离，以正己烷-乙酸乙酯溶剂体系进行梯度洗脱(正己烷与乙酸乙酯体积比依次为5:1，2:1，1:1，1:6，100％乙酸乙酯)，洗脱组分经硅胶(gf
254
)薄层层析方法检测，合并相同组分并分别浓缩，最终共18个组
分：按洗脱顺序为fr.1-fr.18，fr.2组分即为蛇床明素。
[0023]
本实施例对18个组分进行杀松材线虫活性测试，其中fr.2具有最强杀松材线虫活性，500μg/ml浓度下在72小时校正死亡率》90％。
[0024]
本实施例采用gc-ms分析技术对经活性追踪分离得到的具有强杀松材线虫活性的物质fr.2进行分析鉴定，gc-ms测试条件为：色谱柱db-5，升温程序为：起始温度60℃，保持2min，然后以10℃/min的速率升温至300℃，保持5min；分流比2：1；进样量1μl；ei离子源温度230℃；所得结果与ei源质谱数据库nist 14相比对，确定蛇床子中分离得到的fr.2组分为香豆素类化合物蛇床明素，化学结构式如下所示。
[0025][0026]
实施例2：
[0027]
本实施例涉及实施例1提取的蛇床明素杀松材线虫活性测试实验，具体步骤如下：
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将从蛇床子提取物中分离得到的蛇床明素在超声波振荡辅助下溶于含0.5％tritonx-100的5％的dmso溶液，配制成浓度为1mg/ml的溶液，取50μl，加入到96孔板相应的孔中，再加入50μl线虫悬浮液，混匀，体系中蛇床眀素终浓度为500μg/ml；以含0.5％tritonx-100的5％dmso溶液为对照，按照上述方法培养并计算松材线虫的校正死亡率。结果显示，蛇床明素在浓度为500μg/ml下72小时内对松材线虫的校正死亡率为97％。根据如下公式计算松材线虫的校正死亡率：
[0029][0030]
实施例3：
[0031]
本实施例涉及实施例1的蛇床子提取物的杀松材线虫活性测定，具体为：
[0032]
将蛇床子提取物在超声波振荡辅助下溶于含0.5％tritonx-100的5％的dmso溶液中，配制成2mg/ml的蛇床子提取物溶液，取50μl加入到96孔板相应的孔中，再加入50μl线虫悬浮液(约2条/μl)，混匀，体系中蛇床子提取物终浓度为1mg/ml。以含0.5％tritonx-100的5％dmso溶液为对照，置于24℃的避光培养，分别于24小时、48小时、72小时在体式显微镜下观察线虫情况，线虫僵直并以解剖针触动无反应确定为死亡状态。根据如下公式计算松材线虫的校正死亡率：
[0033][0034]
结果显示，蛇床子提取物在1mg/ml浓度下24小时、48小时、72小时后对松材线虫的校正死亡率分别达78.30％，82.33％，96.00％，具有强杀松材线虫活性。
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实施例2和实施例3的测定结果说明蛇床明素能够在更低的浓度下对松材线虫进行更有效的杀灭。