一种介孔磁珠的制备方法及其在核酸提取中的应用与流程

1.本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种介孔磁珠的制备方法及其在核酸提取中的应用。


背景技术：

2.磁性材料一直是国民经济、国防工业的重要支柱和基础，广泛应用于电信、自动控制、通讯、家用电器等领域。而现代社会信息化发展的总趋势是向小、轻、薄以及多功能方向发展，因而要求磁性材料向高性能、新功能方向发展。纳米磁性材料的特性不同于常规的磁性材料是因为与磁相关的特征物理长度恰好处于纳米量级，当传统材料的尺寸被细化到纳米量级的时候，磁性材料就具有许多独特的性能，如量子尺寸效应、超顺磁性、宏观量子隧道效应、磁有序颗粒的小尺寸效应、特异的。但是在生物领域而言，具有介孔结构的纳米磁性材料具有磁饱磁强度高、比表面积大、孔道丰富等优势在溶液中具有良好的分散性与悬浮性，可以提供更多的吸附活性位点是特别重要的。
3.对于疾病的即时检测(pon)，样品制备和检测必须具有效率高、操作便携、并且成本低等优势。通过磁珠进行核酸纯化是一种从复杂混合物中分离核酸的技术。该方法通常在高盐下使生物分子变性，并允许带正电荷的离子在高盐浓度下与带负电荷的二氧化硅和核酸之间形成盐桥/电桥。通过在低盐条件下对核酸进行洗脱。然而现在普通硅基磁珠存在沉降速度比较快，单位质量硅羟基密度较低、对核酸的吸附载量低等问题，在操作过程中需要不停的搅拌，耗时且成本昂贵。因此，发明出一种沉降速度慢、比较面积大、硅羟基含量丰富的纳米介孔磁珠是非常必要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种介孔磁珠的制备方法及其在核酸提取中的应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种介孔磁珠的制备方法，包括以下步骤：
7.s1：单分散磁性纳米球的制备：首先制备出单分散磁性纳米球；
8.s2：磁性二氧化硅微球的制备：采用通用的溶胶-凝胶法合成磁性二氧化硅微球；
9.s3：介孔磁珠的制备：以表面活性剂为模板制备核壳结构介孔磁珠。
10.优选的，所述的单分散磁性纳米球的制备，包括以下步骤：
11.a：将乙二醇、六水合三氯化铁与聚乙二醇分别加入到圆底三口烧瓶中，各药品质量比为(85～95％)：(2～5％)：(2～5％)，在60～90℃下搅拌1.0～2.0h；
12.b：将无水乙酸钠加入到体系中，无水乙酸钠占溶液总质量为3～5％，将反应温度上升至180℃，持续搅拌24～72h，最后使用去离子水洗涤2～3遍，即可得到单分散的磁性纳米球。
13.优选的，所述的磁性二氧化硅微球的制备，包括以下步骤：
14.a.将单分散磁性纳米球分散至无水乙醇中，然后加入γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(kh570)与氨水，各药品质量比为(0.5～5.0％)：(80～90％)：(1～10％),75℃下搅拌12.0h，最后使用无水乙醇洗涤2～3遍，即可得到修饰后的单分散磁性纳米球；
15.b：将修饰后的单分散磁性纳米球、氨水分散于去离子水与无水乙醇中，各药品质量比为(0.5～5.0％)：(0.1～5％)：(25～35％)：100，常温下搅拌0.5h；
16.c：将硅酸四乙酯逐滴加入到反应体系中，硅酸四乙酯占溶液总质量比为1～5％，滴加完成后，升温至30～35℃下搅拌6.0～12.0h，最后使用去离子水洗涤2～3遍，即可得到磁性二氧化硅微球。
17.优选的，所述的介孔磁珠的制备，包括以下步骤：
18.a:将单分散磁性二氧化硅微球、氨水、致孔剂分散于去离子水与无水乙醇中，各药品质量比为(0.5～5.0％)：(0.5～5％)：(0.1～0.5％)：(25～35％)：100，35℃下搅拌0.5h；
19.b:将硅酸四乙酯逐滴加入到反应，硅酸四乙酯占溶液总质量比为1～5％，滴加完成后，持续搅拌6.0～12.0h，然后使用去离子水洗涤2～3遍，通过磁铁回收产物中的磁性物质，然后在60℃下干燥6.0h，最后在550℃下焙烧300min，即可得到介孔磁珠。
20.优选的，所述s3中，介孔磁珠的粒径为100～800nm。
21.优选的，所述致孔剂为十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮(k29-k32)和eo
20-po
50-eo
20
中的一种或多种。
22.介孔磁珠在核酸提取中的应用，根据上述所述的介孔磁珠的制备方法制得的介孔磁珠，包括以下步骤：
23.a:病毒核酸提取：将介孔磁珠充分混合均匀后，加入到磁珠法核酸提取预分装试剂盒中，然后加入200ul病毒疫苗样本，使用全自动核酸提取仪进行提取，完成后将纯净的核酸模板加入到rt-pcr试剂盒中进行扩增实验；
24.b:全血基因组提取：将介孔磁珠充分混合均匀后，加入到磁珠法核酸提取预分装试剂盒中，然后加入200ul的全血样本，使用全自动核酸提取仪进行提取，提取完成后使用微量紫外分光光度计对核酸浓度与纯度进行测试。
25.本发明的有益效果：
26.(1)本发明的介孔磁珠制备过程简单，使用前不需要后处理过程，具有良好的分散性，粒径均一可控，比表面积较大、孔道结构丰富等特点；
27.(2)本发明的介孔磁珠易工业化生产，且对核酸具有优异的提取性能，对体外诊断领域核酸的纯化提供了帮助。
28.本发明制备的介孔磁珠主要具有比表面积大、密度小、沉降慢、操作简便易于规模化生产、硅羟基含量丰富、具有良好的生物相容性、且能与核酸进行特异性结合等优势。
附图说明
29.图1为本发明所得到的单分散磁性纳米球的tem照片示意图；
30.图2为本发明所得到的介孔磁珠的sem照片示意图；
31.图3为本发明所得到的介孔磁珠的比表面积与孔径分布图；
32.图4为本发明所得到的介孔磁珠的磁滞回线图；
33.图5为介孔磁珠对病毒样本的提取性能数据示意图；
34.图6为介孔磁珠对基因组的提取性能数据图；
35.图7为介孔磁珠对基因组提取的胶图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
37.参照图1-7，一种介孔磁珠的制备方法，包括以下步骤：
38.s1：将100ml乙二醇、4.5g六水合三氯化铁和3.5g聚乙二醇4000搅拌均匀，当温度升至90℃时，加入45g无水乙酸钠，继续升温至180℃，持续搅拌24h，最后使用去离子水洗涤3遍，即可得到单分散的磁性纳米球(如图1所示)；
39.s2：将1.0g s1中得到的单分散磁性纳米球超声分散于100ml的无水乙醇与3ml氨水中，然后加入2.0gγ―甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，在80℃下反应12.0h，最后使用无水乙醇洗涤3遍，得到修饰后的单分散磁性纳米球；
40.将1.0g修饰后的单分散磁性纳米球超声分散于100ml无水乙醇与30ml去离子水中，然后加入2.5ml氨水，将1.0ml硅酸四乙酯逐滴加入到反应体系中，在35℃下搅拌6.0h，最后使用去离子水洗涤3遍，即可得到磁性二氧化硅微球；
41.s3：将1.0g单分散磁性二氧化硅微球、1.5ml氨水、0.5g十六烷基三甲基溴化铵超声分散于100ml无水乙醇与30ml去离子水中，35℃下搅拌0.5h，然后将1.5ml硅酸四乙酯逐滴加入到反应体系中，持续反应6.0h后使用去离子水洗涤3遍，然后在60℃下干燥6.0h，最后在550℃下焙烧300min，即可得到介孔磁珠(如图2、3、4所示)。
42.介孔磁珠在核酸提取中的应用，根据上述的介孔磁珠的制备方法制得的介孔磁珠，包括以下应用：
43.a:病毒核酸提取：将介孔磁珠充分混合均匀后，加入到磁珠法核酸提取预分装试剂盒中，然后加入200ul病毒疫苗样本，使用全自动核酸提取仪进行提取，完成后将纯净的核酸模板加入到rt-pcr试剂盒中进行扩增实验；
44.在病毒样本中，得到以下结论：随着磁珠用量增加介孔磁珠提取核酸的ct值先减小后增加，当磁珠用量为15ul时，提取效果最佳；
45.b:全血基因组提取：将介孔磁珠充分混合均匀后，加入到磁珠法核酸提取预分装试剂盒中，然后加入200ul的全血样本，使用全自动核酸提取仪进行提取，提取完成后使用微量紫外分光光度计对核酸浓度与纯度进行测试。
46.在全血样本中提取基因组，得到以下结论：随着介孔磁珠用量增加提取基因组纯度od260/230逐渐增高，且核酸浓度也随之增加。
47.本发明中，介孔磁珠的粒径为100～800nm，且表现出良好的单分散性与球形度。
48.本发明制备的介孔磁珠主要具有比表面积大、密度小、沉降慢、操作简便易于规模化生产、硅羟基含量丰富、具有良好的生物相容性、且能与核酸进行特异性结合等优势。
49.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说
明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
50.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。