治疗和预防乙型肝炎和丁型肝炎的组合物和方法与流程

治疗和预防乙型肝炎和丁型肝炎的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年1月28日提交的第62/966970号美国临时专利申请的优先权，其全文通过引用明确并入本文。
3.对序列列表的引用
4.本技术与电子格式的序列表一起提交。序列表以名为svf005seqlisting.txt的文件提供，于2021年1月26日创建文件并做最后修改，大小为141377字节。此处通过引用将电子序列表中的信息全文明确并入本文。
技术领域
5.本发明的方面总体上涉及工程化乙型肝炎(hbv)和丁型肝炎(hdv)核酸、基因、肽或蛋白质的免疫原性组合物或产品组合，其可用于抑制针对hbv和/或hdv感染的免疫应答。这种免疫反应包括产生中和抗体的活化免疫细胞和活化免疫细胞(如t细胞和b细胞)，或基本上由其或由其组成，以对抗hbv和/或hdv。本发明还总体上涉及在受试者中使用免疫原性组合物或产品组合以产生针对hbv和/或hdv的免疫应答的方法，通过使用同源或异源核酸和/或多肽引发(prime)和核酸和/或者多肽增强方法施用组合物或组合。


背景技术：

6.肝炎是一种导致肝脏肿胀和炎症的疾病。这种疾病通常由病毒引起，目前已知有五种类型(甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎)。乙型肝炎感染可以是急性的，也可以是慢性的，严重的慢性感染会导致慢性炎症、纤维化、肝硬化和肝细胞癌。乙型肝炎病毒具有部分双链环状dna基因组，该基因组进入宿主细胞核，并由宿主rna聚合酶转录成四个病毒mrna分子。它们用于翻译病毒蛋白质，如衣壳蛋白和表面抗原，以及使用逆转录酶产生更多的dna基因组。丁型肝炎是一种依赖乙型肝炎合并感染或超感染(superinfection)进行复制的类病毒。丁型肝炎的环状单链rna使用宿主rna聚合酶扩增，但也包括单个丁型肝炎抗原(hdag)基因。在乙型和丁型肝炎合并感染或超感染期间，完整的丁型肝炎病毒被包裹在一个包括乙型肝炎表面抗原的包膜中，该包膜围绕着包被有hdag蛋白的rna基因组。乙型肝炎表面抗原的掺入对于丁型肝炎的传染性至关重要，因为丁型肝炎并不编码自身的受体结合蛋白。与丁型肝炎合并感染或超感染会导致更严重的并发症，增加肝衰竭、肝硬化和癌症的风险。目前需要有效的免疫原性组合物和疫苗来建立针对乙型肝炎和丁型肝炎感染的预防性免疫。


技术实现要素：

7.本发明总体涉及包括hbv和/或hdv抗原的重组核酸、dna、rna、蛋白质、多肽或肽的用途，以诱导针对hbv或hdv感染的免疫应答、抗体产生、免疫保护或免疫。在一些实施方案中，包括hbv和/或hdv抗原的重组核酸、dna、rna、蛋白质、多肽或肽被用于dna引发/蛋白质增强组合物方法。在一些实施方案中，与仅dna、仅蛋白质或基于生物体的免疫原性组合物
相比，这种dna引发/蛋白质增强组合物方法导致针对hbv或hdv感染更强的免疫应答、抗体产生、免疫保护或免疫力。
8.慢性乙型肝炎和丁型肝炎病毒(hbv/hdv)感染可导致癌症。目前使用核苷类似物(na)的hbv治疗是终身的，可以降低但不能消除癌症风险。慢性乙型肝炎的一个标志是功能失调的hbv特异性t细胞反应。在一些实施方案中，是由hdv抗原(hdag)特异性的幼稚健康t细胞驱动的免疫治疗，以绕过对hbv特异性t细胞的需要，从而引发阻止hbv进入的pres1特异性t淋巴细胞和pres1抗体。在一些实施方案中，对pres1和/或hdag序列的组合在体外和体内对pres1抗体以及hbv特异性和hdv特异性t细胞进行的诱导评估。在一些实施方案中，在细胞培养物中对pres1特异性小鼠和兔抗体对hbv的中和作用进行评估，并在重新注入人类肝细胞的小鼠中对兔抗pres1对hbv的中和作用进行测试。在一些实施方案中，在人源化小鼠的后续攻毒后，过继转移pres1抗体预防或调节了hbv感染。
9.在一些实施方案中，核酸或多肽组合物包括hbv、hdv、pres1或hdag的序列、基因或多肽。在一些实施方案中，pres1是pres1 a或pres1 b。在一些实施方案中，hdag是hdag基因型1a株(1a)、hdag基因型1b株(1b)、hdag基因型2a株(2a)或hdag基因基因型2b株(2b)。在一些实施方案中，所述组合物还包括自催化肽裂解位点。在一些实施方案中，手术自催化肽裂解位点是p2a自催化肽裂解位点。在一些实施方案中，pres1和hdag组分在组合物中组合在一起。在一些实施方案中，pres1位于hdag序列的下游或直接下游。在一些实施方案中，pres1和hdag基团通过自催化肽裂解位点分离。在一些实施方案中，pres1和hdag基团由p2a自催化肽裂解位点分离。
10.在一些实施方案中，所述核酸组合物是质粒、病毒、噬菌体、粘粒、福斯粘粒(fosmid)、噬菌体抗体、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或人类人工染色体(hac)。在一些实施方案中，核酸组合物是圆形或线性的。在一些实施方案中，核酸组合物在生物系统中产生，包括但不限于哺乳动物细胞、人类细胞、细菌细胞、大肠杆菌(e.coli)、酵母、酿酒酵母(s.cerevisiae)或其他适当的生物系统。在一些实施方案中，hbv和/或hdv核酸或基因可在生物系统中包括转录和翻译所述核酸或基因所需元件的盒(cassette)中被找到。
11.在一些实施方案中，多肽组合物被适当折叠或变性。在一些实施方案中，多肽组合物在包括但不限于哺乳动物、细菌、酵母、昆虫或无细胞重组表达系统的生物系统中产生。在一些实施方案中，多肽组合物在哺乳动物细胞、人类细胞、原代细胞、永生化细胞、癌症细胞、干细胞、成纤维细胞、人胚胎肾(hek)293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、细菌细胞、大肠杆菌(escherichia coli)细胞、酵母细胞、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞、毕赤酵母(pichia pastoris)细胞、昆虫细胞、草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)sf9或草地贪夜蛾sf21细胞或无细胞系统中产生。在一些实施方案中，使用本领域已知的技术纯化多肽组合物，包括但不限于提取、冻融、均质、渗透、离心、密度梯度离心、超速离心、沉淀、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native page)、尺寸排阻色谱、液相色谱、气相色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱、金属结合色谱、镍柱色谱、表位标签纯化或冻干。
12.在一些实施方案中，将核酸或多肽组合物施用于动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、猫、狗、马、牛、猪、羊、猴子、灵长类动物或鸡。在一些实施方案中，核酸或多肽组合
物施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周，或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月，或在每个剂量之间的任何两个上述时间限定的范围内的任何时间。在一些实施方案中，在施用所述多肽组合物之前施用所述核酸组合物。在一些实施方案中，在所述核酸组合物之前施用所述多肽组合物。
13.在一些实施方案中，所述核酸或多肽组合物的施用量为1ng、10ng、100ng、1000ng或1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg或1mg、100mg、100mg或1000mg，或上述任何两种量限定的范围内的任何量。在一些实施方案中，核酸或多肽组合物与赋形剂一起施用。在一些实施方案中，核酸或多肽组合物与佐剂一起施用。在一些实施方案中，通过体内电穿孔施用所述核酸组合物。
14.在一些实施方案中，通过使用本领域已知的技术(包括酶联免疫斑点(elispot))测定产生干扰素γ(ifnγ)的免疫细胞、测定hbv、hdv、hbv蛋白、hbv核酸、hdv蛋白、hdv核酸、pres1或hdag的特异性igg抗体滴度、或在体外或体内测定来自免疫动物的血清或纯化抗体的中和活性，来评估核酸或多肽组合物的免疫原性。
15.在一些实施方案中，核酸或多肽组合物的施用提供了针对hbv或hdv感染的短暂、持久或永久保护。在一些实施方案中，针对hbv或hdv感染的短暂、持久或永久保护优于其他免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述核酸或多肽组合物的施用结合抗病毒治疗进行。在一些实施方案中，施用核酸或多肽组合物以提供针对hbv或hdv感染的短暂、持久或永久保护在人类中是有效的。在一些实施方案中，核酸或多肽组合物用作抗hbv或hdv的疫苗。
16.本发明的优选方面涉及以下编号的备选方案：
17.1.一种免疫原性组合物或产品组合，包括：
18.(a)一种核酸，其包括至少一个编码丁型肝炎抗原(hdag)的核酸序列和至少一个代码pres1的核酸序列；
19.(b)包括至少一个hdag多肽序列和至少一个pres1多肽序列的多肽。
20.2.备选方案1所述的免疫原性组合物或产品组合，其中编码hdag的至少一种核酸序列包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no：4或其任意组合。
21.3.备选方案1或2所述的免疫原性组合物或产品组合，其中编码pres1的至少一个核酸序列包括seq id no:9或seq id no:10或包括两者。
22.4.备选方案1-3中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸被配置为使得每个hdag核酸序列与pres1核酸序列组合，并且其中所述pres1核酸序列直接位于hdag核酸序列的下游。
23.5.备选方案4所述的免疫原性组合物或产品组合，进一步包括至少一个编码自催化肽裂解位点的核酸序列，其中所述分组的hdag和pres1核酸序列由编码自催化多肽裂解位点的至少一个核酸序列分离。
24.6.备选方案5所述的免疫原性组合物或产品组合，其中编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括选自猪捷申病毒-1 2a(porcine teschovirus-1 2a，p2a)、口蹄疫病毒2a(f2a)、猪传染性支气管炎病毒2a(p2b)、猪传染性非典型肺炎病毒2a(f2a)、猪传染性链球菌2a(f4a)、猪传染性口蹄疫(f2a)和猪传染性支原体2a(f5a)，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)和明脉扁刺蛾病毒2a(thosea asigna virus 2a，t2a)的核酸序列，其中每个编码
的自催化肽裂解位点可任选在其n末端包括gsg(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)基序。
25.7.备选方案5或6所述的免疫原性组合物或产品组合，其中编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括seq id no:13。
26.8.备选方案1-7中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸经过密码子优化以在人中表达。
27.9.备选方案1-8中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸包括与seq id no:15-24或35-36具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
28.10.备选方案1-9中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸包括与seq id no:18或seq id no:35-36具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
29.11.备选方案1-10中任何一种的免疫原性组合物或产品组合，其中所述至少一种hdag多肽包括seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8或其任意组合。
30.12.备选方案1-11中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述至少一个pres1多肽序列包括seq id no:11或seq id no:12或包括两者。
31.备选方案1-12中任何一种的免疫原性组合物或产品组合，其中所述至少一个pres1多肽序列位于所述至少1个hdag多肽序列的下游。
32.14.备选方案1-13中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽包括与seq id no:25-34或37的序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
33.15.备选方案1-14中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽包括与seq id no:29、31、32或37的序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
34.16.备选方案1-15中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽重组表达。
35.17.备选方案16的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽在哺乳动物、细菌、酵母、昆虫或无细胞系统中重组表达。
36.18.备选方案1-17中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其进一步包括佐剂。
37.19.备选方案18的免疫原性组合物或产品组合，其中所述佐剂是明矾、qs-21或mf59或其任意组合。
38.20.备选方案1-19中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸包括dna。
39.21.备选方案1-20中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸在重组载体中提供。
40.22.一种使用备选方案1-21中任一项所述的免疫原性组合物或产品组合在受试者中产生免疫应答的方法，包括：
41.向所述受试者施用包括所述核酸的至少一个引发剂量；以及
42.向受试者施用至少一种包括多肽的增强剂量。
43.23.根据备选方案22所述的方法，其中所述至少一种增强剂量还包括佐剂。
44.24.备选方案23的方法，其中所述佐剂为明矾、qs-21或mf59或其任意组合。
45.25.如备选方案22-24中任一项所述的方法，其中在施用所述至少一种基本剂量后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或周内，或在由上述任意两个时间点定义的时间范围内，例如在1-48天或1-48周内施用所述至少一种增强剂量。
46.26.如备选方案22-25中任一项所述的方法，其中所述施用通过肠内、口服、鼻内、肠外、皮下、肌肉内、皮内或静脉或其任意组合提供。
47.27.备选方案22-26中任一项所述的方法，其中所述施用与抗病毒治疗结合进行。
48.28.备选方案27的方法，其中抗病毒治疗包括施用恩替卡韦、替诺福韦、拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩曲他滨、干扰素-α、聚乙二醇干扰素-α或干扰素α-2b或其任意组合。
49.29.一种用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，包括：
50.(a)一种核酸，其包括至少一种编码丁型肝炎抗原(hdag)的核酸序列和至少一个编码pres1的核酸序列；和
51.(b)包括至少一个hdag多肽序列和至少一个pres1多肽序列的多肽。
52.30.备选方案29所述用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中编码hdag的至少一个核酸序列包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no：4，或其任意组合。
53.31.备选方案29或30所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中编码pres1的至少一个核酸序列包括seq id no:9或seq id no:10或包括两者。
54.32.备选方案29-31任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸被配置为使得每个hdag核酸序列与pres1核酸序列分组，并且其中所述pres1核酸序序序直接位于hdag核酸序的下游。
55.33.备选方案32所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述分组的hdag和pres1核酸序列由编码所述自催化肽裂解位点的所述至少一个核酸序列分离。
56.34.备选方案33所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括选自猪捷申病毒-1 2a(p2a)、口蹄疫病毒2a(f2a)、猪传染性支气管炎病毒-1(p2a)和猪传染性支原体病毒(f2a)的核酸序列，马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)和明脉扁刺蛾病毒2a(t2a)核酸，其中每个编码的自催化肽裂解位点可任选在其n末端包括gsg(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)基序。
57.35.备选方案33或34所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括seq id no:13。
58.36.备选方案29-35任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸经过密码子优化以在人中表达。
59.37.备选方案29-36任一项所述的用于治疗或抑制乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸包括与seq id no:15-24或35-36具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
60.38.备选方案29-37任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中核酸包括seq id no:18或seq id no:35-36。
61.39.备选方案29-38任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述至少一种hdag多肽包括seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8或其任意组合。
62.备选方案29-39任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中至少一个pres1多肽序列包括seq id no:11或seq id no:12或包括两者。
63.41.备选方案29-40任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中至少一个pres1多肽序列位于至少一个hdag多肽序列的下游。
64.42.备选方案29-41任一项所述的用于治疗或抑制乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽包括与seq id no:25-34或37的序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
65.43.替代品29-42中任一种用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽包括与seq id no:29、31、32或37的序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。
66.44.替代品29-43中任一种用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽重组表达。
67.45.备选方案44中用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述多肽在哺乳动物、细菌、酵母、昆虫或无细胞系统中重组表达。
68.46.替代品29-45中任一种用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，进一步包括佐剂。
69.47.备选方案46中用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述佐剂为明矾、qs-21或mf59或其任意组合。
70.48.备选方案29-47任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中核酸包括dna。
71.49.备选方案29-48任一项所述的用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合，其中所述核酸在重组载体中提供。
附图说明
72.除了上述特征外，从以下对附图和示例性实施方案的描述中，其他特征和变化将显而易见。应当理解的是，这些附图描述了典型实施方案，并不意在对范围进行限制。
73.图1a-b描述了本文使用的包括hbv和/或hdv抗原的核酸或多肽构建体。提供了十种结构，分别为δ-1(delta-1，d1)、δ-2(delta-2，d2)、δ-3(delta-3，d3)、δ-4(delta-4，d4)、δ-5(delta-5，d5)、δ-6(delta-6，d6)、δ-7(delta-7，d7)、δ-8(delta-8，d8)、δ-9(delta-9，d9)和δ-10(δ-10，d10)(图1a)。蛋白印记证实了十种多肽构建体正确表达(图1b)。gfp用作蛋白印迹的对照。
74.图2描述了用于dna引发/蛋白质增强组合物方法的构建体。dna组合物包括δ-4的核酸序列，蛋白质组合物包括δ-7或δ-8的多肽序列或δ-7和δ-8融合。
75.图3a-3e描述了对来自暴露于各种hbv或hdv抗原的免疫小鼠血清的纯化白细胞群的酶联免疫斑点分析中每106个细胞干扰素-γ(ifn-γ)形成斑点的定量，所述分析对应于t淋巴细胞活化。抗原包括纯化的多肽，所述多肽包括pres1 a(seq id no:11)、pres1 a
(seqid no:12)、hdag基因型1a(seq id no:5，“hdag gtp 1a混池1”和“hdag gtp1a混池2”)、hdag基因基因型1b(seq id no:6，“hdag gtp 1b混池3”和“hdag gtp 1b混池4”)，hdag基因型2a(seq id no:7，“hdag gtp 2c混池5”和“hdag gtp2c混池6”)和hdag基因类型2b(seq id no:8，“hdag gtp 2d混池7”和“hdag gtp 2d混池8”)。在第一次免疫后6周处死小鼠，并用对应于基因型1(混池1-4)和基因型2(混池5-8)的hdv肽混池1-8刺激每组汇集的脾细胞48小时。基因型1的混池1和2指的是序列/分离物a，而混池3和4对应于序列/分离物b。类似地，基因型2的混池5和6指的是序列/分离物c，基因型2中的混池7和8指的是序列/分离物d。每个混池包括20或221个(混池1和5)具有10个氨基酸重叠的15聚体(15-mer)肽。伴刀豆球蛋白a(“cona”)用作阳性对照，两种卵清蛋白肽(“ova-th”和“ova-ctl”)和生长培养基(“培养基”)用作阴性对照。每一个肽刺激组重复三次，条形图示出了每106个细胞中ifnγ斑点形成细胞(sfc)的平均数量，和标准误差。截止值设定为100个sfcs/106个脾细胞。提供了抗原的浓度。
76.图4a-4c描述了来自用hbv/hdv dna组合物免疫的小鼠的血清中抗pres1 igg抗体滴度的定量。在小鼠(每组5只小鼠)中测试构建体δ-1至δ-10产生针对pres1a和pres1b共有序列的igg抗体。图4a-4b示出了(cover)对pres1氨基酸2-48的反应性。图4c示出了对hbv(亚)基因型a1、a2、b、b2、c、d1、e1和f的交叉反应性。
77.图5a-5c描述了酶联免疫斑点分析纯化白细胞群时每106个细胞中干扰素γ(ifnγ)形成斑点的定量，该白细胞群来自于用δ-4dna组合物免疫的c57bl/6或hla-a2转基因hhd小鼠的血清，或暴露于各种hbv或hdv抗原或肽的初次受试c57bl/6小鼠。抗原包括包括pres1 a(seq id no:11)、pres1 a的纯化多肽(seq id no:12)、包括hdag基因型1a和1b的混池(seq id no:5和6、“gtp 1混池1”、“gtp 1混池2”、“gtp1混池3”、“gtp1混池4)、包括hdag基因型2a和2b的混池(“seq id no:7和8”、“gtp2混池b1”、“gtp 2混池b2”、“gtp2混池b3”，“gtp2混池b4”)，hdag肽片段库包括肽kleddnpwl、kleeenpwl和fpwdilfpa(“pep-3混池”)，以及单个hdag肽kleddnpwl、kleeenpwl和fpwdilfpa。伴刀豆球蛋白a(“cona”)用作阳性对照，两种卵清蛋白肽(“ova-th”和“ova-ctl”)和生长培养基(“培养基”)用作阴性对照。提供了抗原的浓度。
78.图6a-6c描述了用δ-3或δ-4dna组合物免疫的新西兰白兔中抗pres1 igg滴度的定量。收集来自兔子的血清，并通过elisa针对pres1a和pres1b共有肽进行测试(图6b)。接种的兔抗血清还测试了与hbv(亚)基因型a1、a2、b、b2、c、d1、e1和f的交叉反应性(图6c)。图的条形示出了作为最后一次血清稀释结束时测定的各组的平均末端抗pres1滴度，其在405nm处的od比相同稀释时未免疫血清的od高三倍。从1:60开始，用六倍稀释液连续滴定血清。
79.图6d示出了接种d-4的兔抗血清对不同hbv(亚)基因型的pres1的反应性百分比。通过elisa测试六周龄接种d-4的兔抗血清对hbv(亚)基因型d1、f、a1、c、a2、b、b2和e1的反应性(od 405nm)。使用具有10个氨基酸(aa)重叠的单个20mer pres1肽，对应于每个hbv类型的aa 2-21、12-31、22-41和32-48，中和表位主要定位于基因型d1的aa 22-41与32-48处，反应性百分比最高，其次是同一aa区域的(亚)c型、e1型和a1型。
80.图7a-7c描述了从c57bl/6小鼠血清中提取的纯化白细胞群的酶联免疫斑点分析中，每106个细胞中干扰素γ(ifnγ)形成斑点的定量，这些小鼠仅用δ-4dna、δ-7蛋白质
或δ-4脱氧核糖核酸/δ-8蛋白质引发剂/增强剂组合物免疫。抗原包括纯化的多肽，所述多肽包括pres1 a(seq id no:11)、前s2 a(seq idno:12)、包括hdag基因型1a和1b的混池(seq id no:5和6，“gtp 1混池1”、“gtp 1混池2”、“gtp1混池3”、“gtp1混池4”)，以及包括hdag基因型2a和2b的混池(seq id no:7和8，“gtp 2混池5”、“gtp 2混池6”、“gtp2混池7”，“gtp2混池8”)。伴刀豆球蛋白a(“cona”)用作阳性对照，两种卵清蛋白肽(“ova-th”和“ova-ctl”)、dmso和生长培养基(“培养基”)用作阴性对照。提供了抗原的浓度。
81.图8a-8c描述了仅用hbv/hdv dna、仅用蛋白质或dna引发/蛋白质增强组合物免疫的c57bl/6小鼠中抗pres1 igg滴度的定量。
82.图9描述了仅用hbv/hdv dna、仅用蛋白质或dna引发/蛋白质增强组合物免疫的兔子中抗pres1 igg滴度的定量。
83.图10a-10b描述了第一次接种后1、2、3、4、6和8周对hbv感染的保护作用，根据每个时间点的hbv滴度确定。每行表示一个单独的小鼠(图10a)。两只阴性对照小鼠(灰线)接受非免疫igg，三只小鼠(红线)接受d4 pres1 igg。pres1 igg处理组的一只小鼠在第4周死亡，因此该小鼠只能在第1、2和3周进行测定。在血清丙氨酸转移酶、天冬酰胺转移酶、碱性磷酸酶或胆红素水平方面，两组之间没有显著差异(图10b)。
84.图11a-d描述了使用不同佐剂对d-7和d-8肽混合物(小鼠施用各10μg)的评估。测试了qs-21、mf59和明矾佐剂。将通过电穿孔肌肉内施用的d-4dna组合物用作对照。图11a示出了受试佐剂的施用计划和示例性终滴定。图11b示出了通过elisa评估的每种情况下单个小鼠的％反应性。x轴(“1、3、10、30、0”)对应于单个小鼠的id号。图11c示出了通过酶联免疫斑点评估的hbv pres1和hdv抗原共有肽对脾细胞的ifnγ激活。图11d示出了针对pres1a和pres1b肽的终点pres1滴度。
85.图12a-d描述了与仅d-4dna和天然对照相比，仅d-7和d-8肽混合物、仅d-8 d-8融合肽以及d-4脱氧核糖核酸引发剂和d-7及d-8多肽混合物的增强作用的比较。图12a示出了通过酶联免疫斑点评估的hbv pres1和hdv抗原共有肽对脾细胞的ifnγ活化。图12b示出了在第一轮施用后2周评估的针对pres1a的抗体水平。图12c示出了第二轮施用后2周评估的针对pres1a的抗体水平。图12d示出了第二轮施用后2周评估的针对pres1b的抗体水平。图12b-d的图例对应于单个小鼠的id号。
具体实施方式
86.尽管有预防性疫苗和抗病毒治疗，但慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染目前影响着全球超过2.5亿人。每年有100万慢性携带者死于hbv引起的肝脏相关并发症，如肝硬化，最终导致肝细胞癌(hcc)。丁型肝炎病毒(hdv)是hbv的一种rna卫星病毒，可从hbv(hbsag)中“窃取”表面抗原，在全球范围内共感染1500-2500万hbv携带者，并使疾病恶化。到目前为止，还没有有效的功能性治疗慢性hbv或hdv感染。目前hbv护理治疗的标准包括抑制hbv聚合酶逆转录酶(rt)功能的核苷类似物(na)。这通过阻断衣壳内部分双链dna的合成来防止病毒成熟。因此，na仅在治疗期间抑制病毒复制。这是因为阻断rt既不影响蛋白质的产生(包括hbsag)和释放，也不影响共价闭合环状dna的合成，这是hbv持续存在的主要原因。终生na可降低但不能消除hcc的风险。至少一年的聚乙二醇干扰素(ifn)-α计划是目前推荐的慢性hdv治疗方案；然而，持续的反应率很低。聚乙二醇化ifn-α和na联合治疗对hdv和hbv的疗效
有限。
87.hbv使用多种策略来逃避宿主免疫反应。hbv蛋白的慢性存在诱导t细胞功能障碍。hbv感染的细胞过度产生亚病毒hbsag颗粒，其主要含有小hbsags(shbsag)，以阻断针对shbsag的中和抗体群。这确保了表面密度较高的病毒颗粒存活，这些颗粒含有中等hbsag(mhbsag；含有s和pres2)和大hbsags(lhbsag，含有s、pres2和pres1)蛋白质。重要的是，pres1结构域负责与肝细胞上hbv的钠-牛磺胆酸共转运多肽(ntcp)受体结合。因此，靶向感染性hbv颗粒并防止新肝细胞感染的一个明显方法是提高病毒pres1结构域的抗体。
88.如本文所述，为了构建针对hbv和hdv感染的免疫疗法，以诱导产生针对hbv与hdv的pres1抗体和t细胞，以不同的组合产生了含有pres1和大hdv抗原的嵌合基因(图1a)。将pres1与hdag连接的优势在于，hdag将作为hbv单感染患者的异源t细胞表位载体。因此，这些hdag特异性t细胞支持持续内源性产生pres1抗体，阻止病毒进入并绕过对hbv特异性t淋巴细胞的需要。事实上，超过90％的hbv携带者是单感染hbv的，在这些患者中，异源hdag将引发支持hbv特异性反应启动的健康幼稚t细胞。此外，hdag特异性t细胞和pres1抗体可能防止这些患者中的hdv超感染。为了诱导中和抗体和t细胞，使用了基因免疫，因为这一策略已经证明可以激活对hbv的免疫应答。总的来说，这种病毒进入阻断策略补充了目前正在开发的成熟抑制剂和衣壳组装抑制剂，以实现针对hbd和/或hdv感染的可持续非治疗反应。
89.本文提供的实施方案涉及工程化乙型肝炎(hbv)和丁型肝炎(hdv)核酸、基因、肽或蛋白质的免疫原性组合物或产品组合，其可用于抑制针对hbv或hdv感染的免疫应答。包括hbv和hdv核酸、基因、肽或蛋白质的嵌合基因和嵌合蛋白的使用已在例如wo 2017/132332中进行了表征，其全文通过引用明确并入本文。
90.在以下详细说明中，参考了构成本文件一部分的附图。在附图中，除非上下文另有规定，否则相似符号通常标识相似部件。在详细描述、附图和权利要求中描述的示例性实施方案并不意味着是限制性的。可以使用其他实施方案，并且可以进行其他改变，而不背离本文所呈现的主题的精神或范围。将容易理解的是，如本文一般描述和图中所示，本公开的各个方面可以以各种不同的配置进行布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确预期。
91.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，否则本文引用的所有专利、申请、已发表的申请和其他出版物均通过引用被全部明确纳入。如果本文中的一个术语有多种定义，则以本节中的定义为准，除非另有说明。
92.本文中的冠词“一个(a)”和“一个(an)”用于指该冠词的一个或多个语法宾语(例如，至少一个)。举例来说，“元素”指一个元素或多个元素。
93.本文中使用的术语“约(about)”或“大约(around)”指的是数量、水平、值、数、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，与参考数量、水平、值、数、频率、百分数、尺寸、大小、量、重量或长度相比变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
94.在本说明书中，除非上下文另有要求，否则“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为包括所述步骤或元素或步骤或元素组，但不排除任何其他步骤或元素，或步骤或元件组。
95.所说的“由...组成(consisting of)”是指包括并限于“由...组成”之后的任何内容。因此，“由...组成”表示所列要素是必需的或强制性的，不得存在其他要素。“基本上由...组成”是指包括该短语后面列出的任何元素，并限于不干扰或促进本公开中为列出的元素指定的活动或行为的其他元素。因此，短语“基本上由...组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其他要素是任选的，可能存在也可能不存在，这取决于它们是否对所列要素的活动或行为产生重大影响。
96.本发明的实践将采用本领域技术范围内的常规分子生物学方法和重组dna技术，除非有明确相反的指示，其中许多方法将在下文进行说明。这些技术在文献中有充分的解释。例如，见sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual(3rd edition,2000)；dna cloning:a practical approach,vol.1&ii(d.glover,ed.)；oligonucleotide synthesis(n.gait,ed.,1984)；oligonucleotide synthesis:methods and applications(p.herdewijn,ed.,2004)；nucleic acid hybridization(b.hames&s.higgins,eds.,1985)；nucleic acid hybridization:modern applications(buzdin and lukyanov,eds.,2009)；transcription and translation(b.hames&s.higgins,eds.,1984)；animal cell culture(r.freshney,ed.,1986)；freshney,r.i.(2005)culture of animal cells,a manual of basic technique,5th ed.hoboken nj,john wiley&sons；b.perbal,a practical guide to molecular cloning(3rd edition 2010)；farrell,r.,rna methodologies:a laboratory guide for isolation and characterization(3rd edition 2005)。
97.本文中使用的任何给定物质、化合物或材料的术语“纯度”是指相对于预期丰度的物质、化合物、或材料的实际丰度。例如，物质、化合物或材料的纯度可以至少为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数。纯度可能受到有害杂质的影响，包括但不限于副产物、异构体、对映体、降解产物、溶剂、载体、溶媒或污染物，或其任意组合。纯度可以通过包括但不限于色谱、液相色谱、气相色谱、光谱、紫外-可见光谱、红外光谱、质谱、核磁共振、重量分析或滴定或其任意组合的技术进行测定。
98.本文中使用的术语“功能”和“功能性”指的是生物、酶或治疗功能。
99.本文中使用的短语“有效量”或“有效剂量”是指足以达到预期结果的量，因此将取决于成分及其预期结果。然而，一旦已知期望的效果，确定有效量属于本领域技术人员的技能范围。
100.通常，图中提供的“误差棒”代表平均值的标准误差。
[0101]“配方”和“组合物”在本文中互换使用，是指给受试者施用的物质组合物的等效术语。
[0102]
本文中使用的术语“分离”是指基本上或基本上不含通常在其天然状态下伴随其而来的成分的材料。例如，本文中使用的“分离细胞”包括从自然状态的环境或生物体中纯化的细胞，从受试者或培养物中移除的细胞，例如，与体内或体外物质无显著相关性的细胞。
[0103]
本文中使用的术语“受试者”具有根据说明书理解的普通含义，是指作为治疗对象、抑制对象、或改善对象、观察对象或实验对象的动物。“动物”具有根据本说明书理解的
普通含义，包括冷血和温血脊椎动物和/或无脊椎动物，如鱼类、贝类或爬行动物，特别是哺乳动物。根据本说明书，“哺乳动物”具有其普通含义，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、狗、猫、羊、山羊、牛、马、灵长类动物，如人类、猴子、黑猩猩或类人猿。在一些实施方案中，受试者是人。
[0104]
本文公开的一些实施方案涉及选择需要的受试者或患者。在一些实施方案中，选择需要治疗病毒感染的患者。在一些实施方案中，选择先前接受过病毒感染治疗的患者。在一些实施方案中，选择先前因存在病毒感染风险而接受治疗的患者。在一些实施方案中，选择已发生病毒感染复发的患者。在一些实施方案中，选择对病毒感染的治疗产生耐药性的患者。在一些实施方案中，选择可以具有上述选择标准的任何组合的患者。
[0105]
本文中使用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“治疗(therapeutic)”或“治疗(therapy)”具有根据说明书理解的普通含义，并不一定意味着完全治愈或消除疾病或病症。本文使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”(以及本领域所熟知的)还意味着在受试者的状况下获得有益或期望结果的方法，包括临床结果。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病症、减轻疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病的状态、预防疾病的传播或扩散、延迟或减缓疾病的进展、改善或缓解疾病的状态，减少疾病的复发和缓解，无论是部分还是全部，无论是可检测的还是不可检测的。本文使用的“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还包括预防性治疗。治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的活性剂。施用步骤可以包括单个施用或可以包括一系列施用。以足以治疗患者的量和持续时间向受试者施用组合物。治疗期的长度取决于多种因素，如病情的严重程度、患者的年龄和遗传特征、活性剂的浓度、治疗中使用的组合物的活性或其组合。还应理解，用于治疗或预防的药剂的有效剂量可在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断分析，可能导致剂量变化并变得明显。在某些情况下，可能需要长期施用。施用步骤可以包括单个施用或可以包括一系列施用。
[0106]
本文中使用的术语“抑制”具有根据本说明书理解的普通含义，可指减少或预防病毒感染。减少量可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或在上述任何两个值定义的范围内。如本文所用，术语“延迟”具有根据本说明书所理解的普通含义，是指事件(如病毒感染)的减缓、延后或推迟至比预期时间晚的时间。延迟可以是0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的延迟，或者是由上述任意两个值定义的范围内的量。术语抑制和延迟不一定表示100％抑制或延迟。可以实现部分抑制或延迟。
[0107]
本文使用的术语“免疫原性组合物”是指一种物质或物质混合物，包括但不限于抗原、表位、核酸、肽、多肽、蛋白质、多糖、脂质、半抗原、类毒素、灭活生物体或减毒生物体，或其任意组合，旨在施用于宿主时引发免疫反应。免疫反应包括先天性和适应性免疫反应，后者通过记忆t细胞和记忆b细胞等细胞建立持久的免疫记忆。在对免疫原性组合物的初始免疫应答期间产生的抗体可以在随后挑战相同的抗原、表位、核酸、肽、多肽、蛋白质、多糖、脂质、半抗原、类毒素、灭活生物体或减毒生物体，或展示抗原、表位、核酸、多肽、多肽或抗原的活生物体或病原体时产生，多肽、蛋白质、多糖、脂质、半抗原或类毒素或其任意组合。以这种方式，免疫原性组合物可以用作针对特定病原体的疫苗。免疫原性组合物还可包括一种或多种佐剂，以刺激免疫应答并提高保护性免疫的效力。
[0108]
本文中使用的术语“产品组合”是指两种或两种以上单独的化合物、物质、材料或组合物的集合，可一起用于统一的功能。在一些实施方案中，产品组合包括至少一种核酸组合物和至少一种多肽组合物，它们一起使用以在施用到宿主时诱导免疫应答，任选地，其程度大于仅施用一种组合物类型时诱导的程度。
[0109]
本文中使用的术语“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)、寡核苷酸、聚合酶链反应(pcr)产生的片段以及任何连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以由天然核苷酸的单体(如dna和rna)或天然核苷酸的类似物(如天然核苷酸的对映体形式)或包括两者的组合组成。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱部分中发生改变。例如，糖修饰包括用卤素、烷基、胺和叠氮基取代一个或多个羟基，或者糖可以官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子相似的结构取代，如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或其他众所周知的杂环替代物。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，亚硒酸磷酯、二硒酸磷盐、硫代亚苯胺酸磷酯或磷酰胺酸磷酯。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包括附着在聚酰胺骨架上的天然存在或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链。“寡核苷酸”可与核酸互换使用，可指双链或单链dna或rna。一种或多种核酸可包括在核酸载体或核酸构建体(例如质粒、病毒、噬菌体、粘粒、福斯黏粒、噬菌体抗体、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或人类人工染色体(hac))中，其可用于在各种生物系统中扩增和/或表达核酸或核酸。通常，载体或构建体还将包括包括但不限于启动子、增强子、终止子、诱导子、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号、复制起源、克隆位点、多克隆位点、限制性酶位点、表位、报告基因、选择标记、抗生素选择标记、靶向序列、肽纯化标签或辅助基因，或其任意组合。
[0110]
核酸或核酸分子可包括一个或多个编码不同肽、多肽或蛋白质的序列。这些一个或多个序列可以相邻地连接在同一核酸或核酸分子中，或者在它们之间有额外的核酸，例如连接子、重复序列或限制性酶位点，或者任何其他序列，其长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基，或者由上述长度中的任意两个限定的范围内的任意长度。本文所用核酸上的术语“下游”是指在包括编码序列(正义链)的链(如果核酸是双链)上的前一序列的3
′
端之后的序列。如果核酸是双链的，本文所用核酸上的术语“上游”是指在包括编码序列(正义链)的链上的后续序列的5
′
端之前的序列。本文所用核酸上的术语“组合”是指直接或与中间的额外核酸相邻出现的两个或多个序列(例如连接子、重复序列或限制性内切酶位点)，或任何其他1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200个碱基长、或者由上述长度中的任意两个限定的范围内的任何长度的，但通常不具有编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列。
[0111]
本文所用核酸的术语“密码子优化”是指核酸密码子的替换，以增强或最大化特定物种宿主中的翻译，而无需基于物种特异性密码子使用偏好和靶细胞细胞质中每个氨基酰基trna的相对可用性改变多肽序列。密码子优化和执行这种优化的技术是本领域已知的。包括密码子优化算法的程序是本领域技术人员已知的。程序可以包括，例如optimumgene、
算法等。此外，合成的密码子优化序列可以从商业上获得，例如从integrated dnatechnologies和其他商业上可获得的dna测序服务。本领域技术人员将理解，基因表达水平取决于许多因素，例如启动子序列和调节元件。正如对大多数细菌所指出的，trna物种识别小的密码子子集，导致翻译选择，这可能是蛋白质表达的一个重要限制。在这方面，可以设计许多合成基因来提高其蛋白质表达水平。
[0112]
本文所述的核酸包括碱基。主要的、标准的、天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其他碱基包括但不限于嘌呤、嘧啶、修饰碱基、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、7-甲基鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤，5,6-二氢尿苷、5-羟甲基胞嘧啶，5-溴脲嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、氨基烯丙基碱基、染料标记碱基、荧光碱基或生物素标记碱基。
[0113]
本文中使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指由肽键连接的氨基酸组成的大分子。肽、多肽和蛋白质的多种功能是本领域已知的，包括但不限于酶、结构、运输、防御、激素或信号。肽、多肽和蛋白质通常(但并非总是)由核糖体复合物使用核酸模板在生物学上产生，尽管化学合成也可用。通过操纵核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，如一种以上肽、多肽或蛋白质的替换、删除、截断、添加、复制或融合。这些多个肽、多肽或蛋白质的融合可以在同一分子中相邻连接，或在它们之间加入额外的氨基酸，例如连接子、重复序列、表位或标签，或任何其他1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长、或者由上述长度中的任意两个限定的范围内的任意长度的序列。
[0114]
在一些实施方案中，本文提供并在实施方案中使用的核酸或肽序列在各种生物系统中具有功能，包括但不限于人类、小鼠、兔子、大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞。在其他实施方案中，核酸或肽序列共享0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似性，或者在由前述百分比中的任何两个定义的范围内的任何百分比，也可以在不影响序列在生物系统中的功能的情况下使用。如本文所用，术语“相似性”是指分别具有相同核苷酸或氨基酸总体顺序的核酸或肽序列，作为模板核酸或肽顺序，在序列中具有特定变化，如替换、删除、重复或插入。在一些实施方案中，共享低至0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的两个核酸序列可以通过包括在翻译期间编码相同氨基酸的不同密码子来编码相同多肽。
[0115]
本文使用的术语“重组表达”是指在优化或适应的生物系统中产生蛋白质。这些系统提供了超过天然宿主中蛋白质表达的优势，包括但不限于高表达(过表达)、易于纯化、易于转化、可诱导性、低成本或蛋白质稳定性。在一些实施方案中，蛋白质在哺乳动物、细菌、酵母、昆虫或无细胞重组表达系统中表达。每个系统都有自己的优点或缺点。例如，细菌表达系统针对过表达进行了高度优化，但可能会导致产生的蛋白质的错误折叠或聚集，酵母系统在需要翻译后修饰时非常有用，昆虫和哺乳动物系统对于高等生物中发生的正确rna剪接非常有用。在一些实施方案中，从哺乳动物细胞、人类细胞、原代细胞、永生化细胞、癌症细胞、干细胞、成纤维细胞、人胚肾(hek)293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、细菌细胞、大肠杆菌细胞、酵母细胞、酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞、昆虫细胞、草地贪夜蛾sf9或草地贪夜蛾sf21细胞或无细胞系统中生产并纯化δ-7、δ-8和其他重组多肽。在一些实施方案中，
表达基因、载体或构建体以质粒、噬菌体、病毒、腺相关病毒(aav)、杆状病毒、粘粒、福斯粘粒、噬粒(phagemid)、bac、yac或hac的形式递送至重组表达系统。有关重组表达系统的更多讨论，请参见gomes等人“an overview of heterologous expression host systems for the production of recombinant proteins”((2016)adv.anim.vet.sci.4(7):346-356)，通过引用将其全部内容明确并入本文。
[0116]
本文中使用的术语“hdag”指的是丁型肝炎抗原基因或蛋白质。hdag存在小的(24kda)和大的(27kda，213个氨基酸，不包括起始蛋氨酸)异构体，并从hdv基因组上的同一开放阅读框翻译。编码序列第196位密码子处的uag终止密码子中的腺苷脱氨基允许翻译继续并产生大的亚型。除非另有明确说明，否则本文描述的实施方案包括hdag的大亚型。在一些实施方案中，hdag序列包括四种不同的hdag株序列中的至少一种：“hdag基因型1a”、“hdag基因类型1b”、“hdag基因型2a”或“hdag基因基因型2b”。在一些实施方案中，编码至少一种hdag多肽的核酸序列包括hdag基因型1a(seq id no:1)、hdag基因类型1b(seq id no:2)、hdag基因型2a(seq id no:3)或hdag基因基因型2b(seq id no:4)的核酸序列。在一些实施方案中，包括至少一种hdag多肽的多肽包括hdag基因型1a(seq id no:5)、hdag基因类型1b(seq id no:6)、hdag基因型2a(seq id no:7)或hdag遗传基因型2b(seq idno:8)的多肽序列。
[0117]
本文中使用的术语“pres1”是指hbv大表面抗原(hbsag)上的n末端结构域的一段。在哺乳动物模型中，大hbsag的108-119氨基酸长n端结构域的47氨基酸长pres1片段在诱导免疫应答和产生高滴度的抗pres1/抗hbv抗体方面是有效的。在一些实施方案中，pres1序列包括两个不同的pres1共有序列中的至少一个：“pres1 a”和/或“pres1 b”。在一些实施方案中，编码至少一种pres1多肽的核酸序列包括pres1 a(seq id no:9)或pres1 b(seq id no:10)的核酸序列。在一些实施方案中，包括至少一种pres1多肽的多肽包括pres1 a(seq id no:11)或pres1 b(seq id no:12)的多肽序列。
[0118]
在一些实施方案中，hbv的pres1 a和pres1 b共有序列是从已知hbv基因型中的pres1的序列相似性获得或衍生的。有十种已知或流行的hbv基因型(基因型a、b、c、d、e、f、g、h、i和j)在基因组序列中表现出高达或约8％的核苷酸差异。其中，还有其他亚基因型在基因组序列中表现出高达或约4％-8％的核苷酸差异。hbv的亚基因型包括但不限于a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b9、c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、f1、f2a、f3或f4。有关hbv基因型的更多讨论，请参阅sunbul“hepatitis b virus genotypes:global distribution and clinical importance”((2014)world.j.gastroenterology.20(18):5427-5434，通过引用将其全部内容明确并入本文。
[0119]
本文中使用的术语“自催化肽裂解位点”或“2a肽”是指经过两个组成氨基酸之间肽键裂解的肽序列，导致序列两侧的两种蛋白质分离。这种裂解被认为是2a肽序列中c端脯氨酸和甘氨酸之间肽键形成的核糖体“跳过”的结果。迄今为止，已确定的四种自催化肽裂解位点序列在生物医学研究中有着重要的应用：口蹄疫病毒2a(f2a)；马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)；猪捷申病毒-1 2a(p2a)和明脉扁刺蛾病毒2a(t2a)。在一些实施方案中，使用p2a自催化肽裂解位点核酸(seq id no:13)和多肽(seq id no:14)序列。
[0120]
本文使用的术语“hbeag”是指在病毒的核衣壳核心和脂质包膜之间发现的hbv抗原蛋白。宿主产生的hbeag分泌到血清中，是活动性hbv感染的良好标志物。细胞培养模型中
体外hbeag分泌的定量可用于评估生物或药物化合物或组合物对hbv感染性的影响。
[0121]
术语“赋形剂”具有根据本说明书理解的普通含义，是指免疫原性组合物或疫苗中发现的其他物质、化合物或材料。具有理想性质的赋形剂包括但不限于防腐剂、佐剂、稳定剂、溶剂、缓冲剂、稀释剂、增溶剂、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、醇、酮、醛、乙二胺四乙酸(edta)、柠檬酸、盐、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨醇、纤维素、血清、氨基酸、聚山梨酯20、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠盐、硬脂酸镁、辛基酚乙氧基化物、苯乙氧基氯化铵、硫柳汞、明胶、酯、醚、2-苯氧基乙醇、尿素或维生素，或其任意组合。一些赋形剂可能是免疫原性组合物或疫苗制造过程中的残留量或污染物，包括但不限于血清、白蛋白、卵清蛋白、抗生素、灭活剂、甲醛、戊二醛、β-丙内酯、明胶、细胞碎片、核酸、肽、氨基酸或生长培养基成分或其任意组合。赋形剂的量可以在免疫原性组合物或疫苗中以0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％w/w的百分比存在，或在由上述任何两个数字限定的范围内的任何重量百分比存在。
[0122]
本文中使用的术语“佐剂”是指刺激免疫应答并提高保护性免疫功效的物质、化合物或材料，并与免疫原性抗原、表位或组合物一起施用。佐剂通过持续释放抗原、上调细胞因子和趋化因子、施用部位的细胞募集、增加抗原呈递细胞中的抗原摄取和呈递或激活抗原呈递的细胞和炎性体来改善免疫应答。常用佐剂包括但不限于明矾、铝盐、硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物、硫酸铝钾、油、矿物油、石蜡油、水包油乳液、洗涤剂、角鲨烯、as03、α-生育酚、聚山梨酯80、as04、单磷酰脂质a、病毒脂质体(virusome)、核酸、聚肌苷酸：聚胞苷酸、皂甙、qs-21、蛋白质、鞭毛蛋白、细胞因子、趋化因子、il-1、il-2、il-12、il-15、il-21、咪唑喹啉、cpg寡核苷酸、脂质、磷脂、二油基磷脂酰胆碱(dopc)、海藻糖二聚体、肽聚糖、细菌提取物、脂多糖或弗氏佐剂，或其任意组合。
[0123]
本文中使用的术语“引发”和“增强”涉及异源引发-增强免疫方法中使用的单独免疫原性组合物。免疫或疫苗通常需要多次施用免疫原性组合物，以诱导宿主对目标病原体的成功免疫。与为所有施用提供相同成分的同源方法相比，异源引发-增强施用可能更有效地建立强大的免疫，具有更高的抗体水平，并改善对某些病原体(如hbv或hdv)的清除或耐药性。在异源引发-增强施用中，首先提供包括一种免疫原性组合物的至少一种引发剂量。在提供至少一种引发剂量后，然后提供包括另一种类型的免疫原性组合物的至少一种增强剂量。所述至少一个增强剂量的施用在施用至少一个引发剂量后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或周内进行，或在由前述时间点中的任何两个限定的时间范围内进行，例如在1-48天或1-48周内。在一些实施方案中，引发剂量包括编码一种或多种抗原或表位的核酸(例如dna或rna)，增强剂量包括包括一种或几种抗原或表位数的多肽。在宿主中，核酸引发剂在体内翻译以引发免疫反应，并对随后的多肽增强产生更大的反应。在一些实施方案中，核酸引发剂包括编码至少一种hdag多肽、至少一种pres1肽和至少一种自催化肽裂解位点的序列。在一些实施方案中，多肽增强剂包括至少一种hdag多肽和至少一种pres1多肽。
[0124]
在一些实施方案中，与仅核酸或仅多肽免疫或未免疫的对照生物体相比，在实验生物体中施用包括hbv和hdv组分的核酸引发剂和多肽增强剂可导致更高的抗hdag、抗
pres1、抗hbv或抗hdv抗体滴度，其比率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000、100000，或1000000或者上述比率中任何两个所限定的范围内的任何比率，通过本领域已知的技术如elisa进行量化。在一些实施方案中，与来自仅核酸或仅多肽免疫或未免疫的对照生物体的血清相比，在实验生物体中施用包括hbv和hdv成分的核酸引发剂和多肽增强剂导致更有效地在体外中和hbv或hdv感染性的血清，并将感染发生率降低至0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0上述任何两个比率所定义范围内的任何比率。在一些实施方案中，与仅核酸或仅多肽免疫或未免疫的对照生物体相比，在实验生物体中施用包括hbv和hdv组分的核酸引发剂和多肽增强剂导致更多的干扰素-γ(ifn-γ)阳性细胞(例如t细胞)，其比率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750，800、850、900、950、1000、5000或10000，或者上述任何两个比率定义的范围内的任何比率。
[0125]
在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合与佐剂一起施用。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合经肠道、口服、鼻内、肠外、皮下、肌肉内、皮内或静脉或其任意组合施用。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合与已知具有抗hbv或hdv效果的抗病毒治疗化合物联合施用，包括但不限于恩替卡韦、替诺福韦、拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩曲他滨、干扰素-α、聚乙二醇化干扰素-α或干扰素α-2b或其任意组合。
[0126]
本文中使用的术语“体内电穿孔”、“电穿孔”和“ep”是指使用本领域已知的技术，通过电流将基因、核酸、dna、rna、蛋白质或载体输送到活组织或生物体的细胞中。电穿孔可作为其他基因转移方法的替代方法，例如病毒(转导)、脂质体转染、基因枪(生物弹道技术(biolistics))、微量注射、囊泡融合或化学转化。电穿孔限制了细胞基因组的免疫原性和有害整合或突变的风险。质粒等dna载体能够进入细胞核，实现组成基因的转录和翻译。在一些实施方案中，通过皮下、肌肉内或皮内注射将基因、核酸、dna、rna、蛋白质或载体添加到目标组织或生物体。然后，电穿孔器通过放置在注入样品内部或附近的电极传递短电脉冲。如本文所用，术语“im/ep”是指肌肉内递送样品的体内电穿孔(“im”)。
[0127]
本文使用的术语“upa
/ -scid”是指用于研究肝病(包括肝炎病毒感染)的免疫缺陷小鼠模型。这些小鼠是prkdc
scid
纯合小鼠，导致功能性t淋巴细胞和b淋巴细胞缺陷。尿激酶型纤溶酶原激活剂(upa)的过度表达也会在发育过程中导致严重的肝细胞毒性和肝功能不全。随后将人类肝组织移植和植入这些小鼠，产生了一种研究人类肝脏疾病的理想模型。有关upa
/ -scid小鼠的更多讨论，请参见meuleman等人，“the human liver-upa-scid mouse:a model for the evaluation of antiviral compounds against hbv and hcv”((2008)antiviral research 80(3):231-238)，其全部内容通过引用明确并入本文。
[0128]
本文中使用的术语“％w/w”或“％wt/wt”具有根据本说明书理解的普通含义，是指成分或试剂重量与组合物总重量的百分比乘以100。本文中使用的术语“％v/v”或“％vol/vol”具有根据说明书理解的普通含义，是指化合物、物质、成分或试剂的液体体积与组合物的总液体体积的百分比乘以100。
[0129]
本发明总体在本文中使用肯定语言来描述众多实施方案。本发明还包括全部或部分排除主题的实施方案，例如物质或材料、方法步骤和条件、协议或程序。
[0130]
免疫原性组合物和产品组合
[0131]
本文公开了免疫原性组合物或产品组合。在一些实施方案中，这些免疫原性组合物或产品组合旨在诱导针对特定抗原的免疫原性反应。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物或产品组合包括(a)核酸，所述核酸包括编码丁型肝炎抗原(hdag)的至少一个核酸序列和编码pres1的至少一种核酸序列；和(b)包括至少一个hdag多肽序列和至少一个pres1多肽序列的多肽。在一些实施方案中，编码hdag的至少一个核酸序列包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no：4或其任意组合。在一些实施方案中，编码pres1的至少一个核酸序列包括seq id no:9或seq id no:10或包括两者。在一些实施方案中，核酸被配置为使得每个hdag核酸序列与pres1核酸序列组合，并且其中pres1核酸序列直接位于hdag核酸序列的下游。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合进一步包括至少一个编码自催化肽裂解位点的核酸序列，其中分组的hdag和pres1核酸序列由编码自催化多肽裂解位点的至少一个核酸序列分离。在一些实施方案中，编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括选自猪捷申病毒-1 2a(p2a)、口蹄疫病毒2a(f2a)、马鼻炎病毒a(erav)2a(e2a)和明脉扁刺蛾病毒2a(t2a)核酸的核酸序列，并且其中每个编码的自催化肽裂解位点可以任选地在其n末端包括gsg(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)基序。在一些实施方案中，编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括seq id no:13。在一些实施方案中，核酸是优化用于在人中表达的密码子。在一些实施方案中，核酸包括与seq id no:15-24或35-36具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施方案中，核酸包括与seq id no:18或seq id no:35-36至少具有80％、85％或90％、95％、99％或100％相似性的序列。在一些实施方案中，所述至少一个hdag多肽序列包括seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8或其任意组合。在一些实施方案中，所述至少一个pres1多肽序列包括seq id no:11或seq id no:12或包括两者。在一些实施方案中，所述至少一个pres1多肽序列位于至少一个hdag多肽序列的下游。在一些实施方案中，多肽包括与seq id no:25-34或37的序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施方案中，多肽包括与seq id no:29、31、32或37的顺序具有至少80％，85％、90％，95％、99％，或100％相似性的序列。在一些实施方案中，多肽在哺乳动物、细菌、酵母、昆虫或无细胞系统中重组表达。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合进一步包括佐剂。在一些实施方案中，佐剂为明矾、qs-21或mf59或其任意组合。在一些实施方案中，核酸包括dna。在一些实施方案中，在重组载体中提供核酸。
[0132]
本文还公开了使用免疫原性组合物或产品组合在受试者中产生免疫应答的方法。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合是本文公开的免疫原性成分或产品组合中的任何一种。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用至少一种包括核酸的引发剂量；以及向受试者施用至少一种包括多肽的增强剂量。在一些实施方案中，所述至少一种增强剂量进一步包括佐剂。在一些实施方案中，佐剂为明矾、qs-21或mf59或其任意组合。在一些实施方案中，在施用至少一个引发剂量后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或周内，或在由前述时间点中的任何两个限定的时间范围内，例如在1-48天或1-48周内施用至少一种增强剂量。在一些实施方案中，所述施用通过肠内、口服、鼻内、肠外、皮下、肌肉内、皮内或静脉或其任意组合提供。在一些实施方案中，该施用与抗病毒治疗结合进行。在一些实施方案中，抗病毒治疗包括施用恩替卡韦、替诺福韦、拉米夫定、阿德福韦、替
比夫定、恩曲他滨、干扰素-α、聚乙二醇化干扰素-α或干扰素α-2b或其任意组合。
[0133]
本文还公开了用于治疗或抑制乙型肝炎或丁型肝炎的免疫原性组合物或产品组合。在一些实施方案中，免疫原性成分或产品组合是本文公开的免疫原组合物或产品组合物中的任何一种。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合包括(a)包括至少一个编码丁型肝炎抗原(hdag)的核酸序列和至少一个编码pres1的核酸序列的核酸；和(b)包括至少一个hdag多肽序列和至少一个pres1多肽序列的多肽。在一些实施方案中，编码hdag的至少一个核酸序列包括seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no：4。在一些实施方案中，编码pres1的至少一种核酸序列包括seqid no:9或seq id no:10或包括两者。在一些实施方案中，核酸被配置为使得每个hdag核酸序列与pres1核酸序列分组，并且其中pres1核酸序列直接位于hdag核酸序列的下游。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合进一步包括至少一个编码自催化肽裂解位点的核酸序列，其中组合的hdag和pres1核酸序列由编码自催化多肽裂解位点的至少一个核酸序列分离。在一些实施方案中，编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括选自猪捷申病毒-1 2a(p2a)、口蹄疫病毒2a(f2a)、马鼻炎病毒a(erav)2a(e2a)和明脉扁刺蛾病毒2a(t2a)核酸的核酸序列，并且其中每个编码的自催化肽裂解位点可以任选地在其n末端包括gsg(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)基序。在一些实施方案中，编码自催化肽裂解位点的至少一个核酸序列包括seq id no:13。在一些实施方案中，所述核酸经密码子优化以在人中表达。在一些实施方案中，所述核酸包括与seq id no:15-24或35-36具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施方案中，核酸包括与seq id no:18或seq id no:35-36具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施方案中，至少一种hdag多肽包括seq id no：5、seq id no：。在一些实施方案中，所述至少一个pres1多肽序列包括seq id no:11或seq id no:12或包括两者。在一些实施方案中，至少一个pres1多肽序列位于至少一个hdag多肽序列的下游。在一些实施方案中，多肽包括与seq id no:25-34或37的序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。在一些实施方案中，多肽包括与seq id no:29、31、32或37的顺序具有至少80％，85％、90％，95％、99％，或100％相似性的序列。在一些实施方案中，多肽在哺乳动物、细菌、酵母、昆虫或无细胞系统中重组表达。在一些实施方案中，免疫原性组合物或产品组合进一步包括佐剂。在一些实施方案中，佐剂为明矾、qs-21或mf59或其任意组合。在一些实施方案中，核酸包括dna。在一些实施方案中，核酸在重组载体中提供。
[0134]
实施例
[0135]
在以下实施例中进一步详细披露了上述实施方案的一些方面，这些实施例无意以任何方式对本公开的范围进行限制。本领域技术人员将理解，许多其他实施例也属于本发明的范围，如上文和权利要求中所述。
[0136]
实施例1：方法
[0137]
动物
[0138]
雌性c57bl/6(h-2b)小鼠从charles river laboratories获得。在室内培育人类白细胞抗原a2(hla-a2)转基因hhd小鼠。所有小鼠在实验开始时均为8-10周龄，并在标准条件下饲养。制造并维持具有人源化肝脏的upa
/ -scid小鼠。新西兰白兔从商业供应商处购买。
[0139]
dna质粒编码l-hdag基因型1和2以及hbsag pres1结构域(aa 2-48)的质粒在本研究中用作融合构建体，任选被p2a裂解，由hdag/pres1序列的不同组合组成。从四种不同临床分离株获得基因型1和2的hdag序列；分别为us-2和cb以及7/18/83和tw2476。使用限制性位点ecor i和hindiii将所有基因克隆到pvax1骨架(invitrogen，科尔斯巴德，加利福尼亚州)。质粒在top10大肠杆菌细胞(life technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中生长，并按照制造商的说明使用qiagen无内切酶dna纯化试剂盒(qiagen gmbh)进行纯化，用于体内注射。通过使用ecor i和hindiii(fast digest，thermo fisher scientific)的限制性内切酶消化来确认正确的基因大小。
[0140]
蛋白印记
[0141]
蛋白印记基本上是按照本领域公知的方法进行的。使用3000转染试剂(thermo fisher scientific)，用每个pvax1 d1-d10 dna质粒转染hela细胞，并用报告基因gfp转染pvax1作为对照。对于蛋白质检测，使用来自d4接种的兔的血清稀释1:1000(一级抗体)和山羊抗兔免疫球蛋白hrp 0.25g/l(dako)稀释1:4000(二级抗体)。对于化学发光检测，使用pierce tm ecl加蛋白印迹底物，并使用gel-doc xr 系统(biorad)收集图像。
[0142]
肽
[0143]
总共168种10个氨基酸重叠的hdag 15聚体肽购自sigma-aldrich(圣路易斯，密苏里州)。将168种肽分成8个混池，每个混池包括20或21种肽。对于序列a、b、c和d，四个混池对应于基因型1(混池1
1-21
、混池2
22-42
、混池3
43-63
和混池4
64-84
)，四个混池相应于基因型2(混池1
1-21
、混池2
21-42
，混池3
43-63
和混池4
6-84
)，每个序列涉及每个临床分离物。
[0144]
从sigma-aldrich(圣路易斯市，密苏里州)购买了pres1-hbsag(pres1a和pres1b)的两种共有序列，它们由47个氨基酸和与hbv(亚)基因型a1、a2、b、b2、c、d1、e1和f的10个氨基酸重叠的20聚体多肽组成。所有肽均已通过qc(sigma-aldrichdirectory)，纯度大于70％。ova 257-264ctl(siinfekl(seq id no:38))和ova323-339th(isqavhaahaeineagr(seq id no:39))卵清蛋白肽用作阴性肽对照，而从sigma-aldrich(圣路易斯，密苏里州)购买的伴刀豆球蛋白a(cona)用作阳性对照，终浓度为0.5μg/l。
[0145]
评估小鼠和家兔hbv/hdv质粒免疫原性的免疫方案
[0146]
为了评估体内构建体的免疫原性，对小鼠和兔子进行了基本上如上所述的免疫接种，每个月进行一次增强，并在两周后处死以收集脾脏和血液。简言之，用无菌pbs中的50μg质粒dna(体积为50μl)，通过常规针头(27g)注射，在胫骨颅骨前(ta)肌肉内(i.m.)免疫雌性c57bl/6小鼠(每组5只)，然后用cliniporator2装置(igea，carpi，意大利)在体内电穿孔(ep)。在体内电穿孔器件，用1ms 600v/cm脉冲，然后是400ms 60v/cm的脉冲模式，以促进dna更好地摄取。在注射疫苗之前，给小鼠注射止痛剂，并在接种期间保持异氟醚麻醉。对于兔子的研究，每组两只新西兰白兔用300μg d3和d4 dna疫苗免疫。通过在右侧ta肌肉中注射300μl无菌pbs中的i.m.疫苗，然后进行体内ep。
[0147]
通过酶联免疫斑点试验(酶联免疫斑点)检测产生ifnγ的t细胞
[0148]
最后一次接种后两周，汇集来自每一免疫组小鼠的脾细胞(五只小鼠/组)，并在肽刺激48小时后基于ifn-γ分泌测试其诱导hbv/hdv特异性t细胞的能力，如本领域所知，使
用商用酶联免疫斑点分析(mabtech，nacka strand，瑞典)。
[0149]
通过elisa进行抗体检测
[0150]
使用本领域已知的方案检测小鼠和兔对pres1共有和重叠的20聚体肽(10μg/ml)的igg。抗体滴度以终点血清稀释度确定，在该稀释度下405nm处的od值至少是阴性对照(未免疫或对照动物血清)在相同稀释度下的od值的两倍。
[0151]
人肝upa-scid小鼠模型中的hbv中和试验
[0152]
hepg2-ntcp-a3是一种选自表达人ntcp的hepg2s细胞的细胞克隆，如前所述。在补充有10％胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺、50u/ml青霉素和50μg/ml链霉素的dmem培养基中培养。在接种期间和接种后，向培养基中添加2.5％的dmso以增强hbv感染和复制。如上所述，通过peg沉淀从hepad38细胞制备用于感染的hbv病毒储备。收集感染后第3-6天之间的细胞培养基，并用pbs 1:5稀释，以使用商业抗体进行hbeag定量的elisa分析。
[0153]
统计分析
[0154]
数据使用graphpad prism v.5和v.8软件以及microsoft excel v.16.13.1进行分析。
[0155]
实施例2:hbv和hdv免疫原性构建体
[0156]
重组hbv和hdv多肽构建体的使用已被证明在诱导抗体形成和针对两种肝炎病毒的免疫保护方面是有效的，例如，在wo 2017/132332中，通过引用将其全文明确并入本文。这些重组多肽构建体通过组合选自四种不同hdv基因型(hdag基因型1a、hdag基因类型1b、hdag基因型2a和hdag基因类型2b)的hdag、选自两种基因型共有序列(pres1 a和pres1 b)的pres1和一个或多个p2a自催化肽裂解位点来组装。图1a和图2中示出了11种重组构建体的示意图，表1中提供了dna和多肽序列的相应seq id no(如适用)。蛋白印记证实了多肽从δ-1到δ-10重组构建体正确表达(图1b)。
[0157]
表1:hbv/hdv免疫原性构建体的seq id no
[0158]
[0159][0160]
实施例3:hbv/hdv dna组合物在小鼠中诱导免疫原性反应
[0161]
虽然免疫原性组合物和疫苗传统上是全生物体或抗原蛋白，但最近已表明，在活体组织中施用dna以及随后的抗原蛋白转录和翻译在触发免疫应答方面也是非常有效的。这些dna免疫原性组合物正被探索作为对抗各种疾病的潜在候选疫苗。
[0162]
在第二次施用dna构建体组合物后2周，评估小鼠对hbv和hdv抗原的免疫力。从小鼠全血样品中纯化白细胞，并与纯化多肽抗原(包括pres1 a、pres1 b、hdag基因型1a、1b、2a和2b)孵育。细胞还与作为阳性对照的伴刀豆球蛋白a(“cona”)，以及作为阴性对照的两种卵清蛋白肽(“ova-th”和“ova-ctl”)孵育。通过酶联免疫斑点法(elispot)评估产生干扰素-γ(ifn-γ)的细胞对抗原暴露的反应的群体频率。简而言之，将白细胞与抗原在涂有ifnγ抗体的孔中孵育。然后移除细胞，将生物素化ifnγ抗体、碱性磷酸酶交联链霉亲和素和碱性磷酸酶底物比色试剂依次加入孔中，其间进行彻底清洗。然后让平板干燥，并通过显微镜计数对应于ifnγ分泌细胞的剩余有色斑点。图3a(δ-1和δ-2)、3b(δ-3和δ-4)、3c(δ-5和δ-6)、3d(δ-7和δ-8)和3e(δ-9和δ-10)示出了每106个总细胞中响应于各种肽抗原的ifnγ斑点形成细胞的数量总数。
[0163]
使用20聚体pres1肽混池测试抗血清对pres1a和pres1b共有肽(aa 2-48)的反应性，以及对hbv(亚)a1、a2、b、b2、c、d1、e1和f型的交叉反应性。包括δ-1、δ-2、δ-3、δ-4、δ-7和δ-8的免疫原性组合物对两种hbvpres1抗原产生了强大的免疫原。δ-3和δ-4在小鼠中诱导抗体滴度》104，其次是构建体δ-1、δ-2、δ-7和δ-8。重要的是，来自δ-4和δ-7免疫小鼠的抗血清在所有测试hbv类型之间有效交叉反应(图4c)。对hdag肽的免疫反应更不稳定，可能是由于基因型序列的差异，但通常比卵清蛋白对照组更大。值得注意的是，在δ-3和δ-4处理组中，与仅含有hdag的构建体(δ-5、δ-6、δ-9、δ-10)相比，观察到hdv t
细胞反应略有降低，这可能归因于与pres1特异性t细胞同时启动的表位识别竞争。总的来说，这表明主动免疫能够诱导针对pres1和hdag抗原的功能性t细胞，并提示广泛功能性免疫治疗应同时包括hdv基因型1和2，以确保诱导特异性t细胞。
[0164]
对从hla-a2转基因hhd小鼠纯化的hla-a2限制性t细胞进行了类似的实验。对正常c57bl/6(图5a)和用包括δ-4的组合物电穿孔的hla-a2 hhd(图5b)小鼠的ifnγ酶联免疫斑点，与作为对照的初次受试hla-a2hhd小鼠(图5c)一起，证实了转基因小鼠的免疫原性，表明dna组合物治疗人类的有效性。
[0165]
实施例4:hbv/hdv dna组合物在兔子中诱导免疫原性反应
[0166]
在兔子(oryctolagus cuniculus)中也进行了实施例3中描述的相应实验。向新西兰白兔肌肉内注射含有900μg包括δ-3或δ-4的dna组合物的盐水溶液，并进行电穿孔。在第0周和第4周施用。免疫后，观察到包括δ-3或δ-4的两种dna组合物的兔血清中的抗pres1抗体滴度，δ-4更有效(》103)(图6a-b)。还使用20聚体pres1肽库测试了兔抗hbv(亚)a1、a2、b、b2、c、d1、e1和f型抗血清的交叉反应性(图6c)。使用hbv a1、a2、b、b2、c、d1、e1和f型的20聚体pres1肽分别测定兔d4抗血清的精准特异性(图6d)。这使得表位比对到了位于基因型d1的区域22-48aa的pres1，正如较高的反应性所示，其次是对基因型c、e1和a1，其反应性较低。这与ntcp结合位点重叠，部分与先前确定的中和抗体识别的表位重叠。
[0167]
表2总结了十种dna免疫原性组合物的免疫效果。包括δ-4的dna组合物在小鼠和家兔中产生了最大的抗pres1/抗hbv抗体滴度，并用作随后实施例的引发/增强免疫。δ-4也显示出对不同hbv基因型的最广泛反应性。“n.d”表示抗体活性水平低或不可检测。“n/a”表示未进行实验。
[0168]
表2:hbv/hdv dna疫苗筛选(50μg dna im/ep)
[0169][0170]
实施例5：用hbv/hdv构建体的dna引发/蛋白质增强方法改善小鼠的免疫原性反应
[0171]
将包括δ-4(seq id no:18)的dna组合物和包括δ-7(seq id no:31)或δ-8(seq id no:32)的多肽组合物用于dna引发/蛋白增强免疫方法，以建立适应性免疫并诱导体内抗hbv和/或hdv的抗体产生(图2)。
[0172]
c57bl/6小鼠用(1)包括δ-4的dna组合物(3次连续剂量的50μg dna)，(2)包括δ-7的多肽组合物(20μg蛋白质与明矾佐剂的3次连续作用)，或(3)包括δ-4的dna组合物，然后是包括δ-8的多肽组合物，(2剂量的50μgdna，然后是2剂量20μg蛋白与明矾)。施用化合物后，通过酶联免疫斑点(如实施例1和2中所述)测试纯化的白细胞对hbv和hdv抗原反应产生的ifnγ。用(1)处理的小鼠对实施例3和图3b中观察到的肝炎抗原表现出相称的反应(图7a)，但用(3)的dna引发/蛋白质增强组合物处理的小鼠总体上产生了相对更强的免疫细胞反应(图7c)。由于δ-8包括hdag基因型2多肽的序列，因此针对这些抗原的测定免疫应答尤其得到改善(图7c，gtp 2-5、6、7和8)。相反，使用δ-7多肽的(2)纯蛋白方法不能同时对hbv和hdv抗原产生同样有效的免疫应答(图7b)。这表明，这种dna引发/蛋白质增强方法可能有效地诱导对某些病原体(包括hbv和hdv)的强大免疫原性反应，比传统的蛋白质或基于生物体的组合物更大。
[0173]
在小鼠中还评估了其他dna引发/蛋白质增强组合。在用(1)包括δ-4(“d4”)的纯dna组合物、(2)包括δ-7(“d7-d7”)、δ-8(“d8-d8”)、δ-9(“d9-d9”)或δ-10(“d10-d10”)的纯蛋白质组合物或(3)包括δ-4 dna和δ-7蛋白(“d4-d7”)、δ-8蛋白(“d4-d8”)或δ-10蛋白(“d4-d10”)的dna-蛋白质组合物免疫小鼠后，测定小鼠中的抗pres1 igg滴度。在第0、
4和8周施用组合物三次，每次一起施用50μg dna im/ep或20μg蛋白质和明矾。对于dna-蛋白质组合物(3)，在第0周第一次施用时给予50μg dna im/ep，在第4周和第8周第二次和第三次施用后给予20μg蛋白质和明矾。在第一剂后2周(图8a)、6周(图8b)和10周(即每剂量后的2周)评估血清中的抗pres1 igg滴度。dna引发/蛋白质增强组合物d4-d7在完成剂量施用计划后产生优异的抗pres1滴度。
[0174]
实施例6:hbv/hdv构建体的dna引发/蛋白质增强方法改善了兔子的免疫原性反应
[0175]
用(1)包括δ-4的纯dna组合物、(2)包括δ-4的纯蛋白质组合物或(3)包括δ-4dna和δ-4蛋白的蛋白引发/蛋白质增强组合物免疫新西兰白兔。在第0、4、8和12周，施用组合物四次，每次施用900μg dna im/ep或300μg蛋白质和明矾。对于dna-蛋白质组合物(3)，在第0周第一次施用900μg dna im/ep，在第4、8和12周第二、第三和第四次施用300μg蛋白质明矾。在第0、2、10和14周(即每次施用后2周)评估血清中的抗pres1 igg滴度(图9)。与仅dna(1)和仅蛋白质(2)组合物相比，dna引发/蛋白质增强组合物(3)不仅导致更高的总滴度，而且在第2周时，相对于仅蛋白质组合物，诱导更快速的抗体产生。
[0176]
实施例7：过继转移来自免疫动物的血清或纯化igg可保护人源化小鼠免受hbv和hdv攻击
[0177]
如前所述，使用人肝嵌合upa
/ -scid小鼠模型测定了d4诱导抗体在体内中和hbv感染的能力。从d4免疫和非免疫兔中纯化总igg，并在hbv攻毒前三天将其注射到重新注入有人肝细胞的upa
/ -scid小鼠中。d4诱导的pres1 igg抗体在所有受攻毒的小鼠中都受到保护，或显著延迟了病毒血症峰值(图10a)。在三只攻毒小鼠中，一只受到保护(第1至3周)，而另两只在每月筛查前血清hbv水平低于104iu/ml，并且在8周随访后仍低于对照组。用来自初次受试兔的igg处理的对照小鼠的血清hbv dna水平均超过108iu/ml。在血清丙氨酸转移酶、天冬酰胺转移酶、碱性磷酸酶或胆红素水平方面，两组之间没有显著差异(图10b)。总之，单剂量给予d4特异性pres1 igg抗体的被动免疫能够预防或显著延迟体内重组人肝细胞小鼠的hbv感染(表3)。重要的是，接种物含有高水平的亚病毒颗粒shbsag，表明这些抗体确实没有被shbsag阻断。在接种时和第一周内存在的pres1抗体明显阻止感染或第一轮感染，并限制受感染肝细胞的数量。这限制了病毒传播并延迟了病毒血症峰值的发展。
[0178]
表3：dna/蛋白质过继转移免疫动物可预防hbv/hdv
[0179][0180]
实施例8：hbv/hdv肽构建体和不同佐剂的攻毒
[0181]
使用不同佐剂评估d-7和d-8肽的混合物。在第0周和第3周给c57bl/6j小鼠施用2轮20μg d-7和d-8肽混合物(d-7与d-8各10μg)(图11a)。在第2周(两轮之间)采集外周血样本，通过elisa测定hbv和hdv反应性的终滴度(图11a和11b)，并在第5周通过酶联免疫斑点分离脾细胞以检测hbv和hdv反应性(图11c-d)。用qs-21、mf59和明矾佐剂皮下注射肽组合物。将初次受试小鼠和通过肌内电穿孔给予d-4dna质粒的小鼠用作对照。如上所述，使用hdag肽混池、pres1a和pres1b肽，以ova肽和伴刀豆球蛋白a为对照进行ifnγ酶联免疫斑点(图11c-d)。与其他佐剂相比，施用qs-21佐剂的组合物表现出更高的hdag反应性。每组测试5只小鼠。
[0182]
实施例9：示例性hbv/hdv dna和/或肽构建体的比较
[0183]
测试了1)仅d-7和d-8肽的混合物、2)仅d-7 d-8融合肽、3)d-4dna引发剂以及d-7与d-8多肽增强剂的混合物的免疫原性比较，其中仅d-4脱氧核糖核酸和初次受试条件作为对照。小鼠在含有qs-21佐剂的混合条件下，在尾基皮下注射20μg d-7 d-8融合蛋白或10μg各d-7和d-8肽，体积为100μl。在第0周和第4周进行2轮施用。d-4dna对照在50μl pbs中以50μg肌肉内施用，并进行电穿孔。在第6周(两轮施用后)，通过ifnγ酶联免疫斑点测定t细胞对pres1和hdv抗原基因型1和2的反应(图12a)。此外，在第2周(一轮施用后)和第6周(两轮施用之后)，评估了pres1a(图12b-c)和pres1b(图12d)共有肽的抗体水平。hbv和hdv的最大反应性是在dna引发、肽增强条件下观察到的。
[0184]
实施例10：在人类临床试验中，带有dna或蛋白质的dna或蛋白质引发剂增强了对hbv和/或hdv的免疫
[0185]
以下实施例描述了使用免疫原性组合物或产品组合的实施方案，该组合物或产品组合物任选包括核酸组分和多肽组分，用于治疗或预防由hbv和hdv等病毒引起的病毒感染。
[0186]
实施例5中所述的dna引发/蛋白质增强组合物通过肠道、口服、鼻内、肠外、皮下、肌肉内、皮内或静脉内施用给人患者。这些人类患者可能当前感染了hbv和/或hdv，以前感染过hbv和(或)hdv，有感染hbv和/或hdv的风险，或未感染hbv或(或)hdv。
[0187]
首先给予dna引发剂量，剂量为1ng、10ng、100ng、1000ng，或1μg、10μg、50μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg，或1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg，或上述任何两种剂量范围内的任何剂量，或任何其他适合于人体最佳疗效的剂量。在第一次dna引发剂量后，可在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或周内，或在先前dna引发剂量施用后上述任意两次所限定的范围内的任何时间，例如1-48天或1-48周内施用。蛋白质增强剂量在dna引发剂量后给予，剂量为1ng、10ng、100ng、1000ng或1μg、10μg、50μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg或1mg、10mg、100mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg，或上述任何两种剂量定义的范围内的任何剂量，或适用于人体最佳疗效的任何其他剂量。第一蛋白质增强剂量在施用最终dna引发剂量后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或周内或在由上述任意两次限定的范围内的任何时间施用。在第一次蛋白质增强剂量之后，可以在施用先前蛋白质增强剂量后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或周内，或在由上述任意两次所限定的范围内的任何时间内，施用额外的蛋白质增强剂量。
[0188]
将对患者对hbv和/或hdv的成功反应进行监测，例如，血清中抗hbv、抗hdv、抗pres1或抗hdag抗体的产生，暴露于hbv和(或)hdv抗原时t细胞和其他免疫细胞的快速激活，以及对未来hbv和/或hdv感染的保护。
[0189]
对于当前感染、先前感染或有感染hbv和/或hdv风险的患者，可结合抗病毒治疗施用dna引发/蛋白质增强组合物。已证明对hbv或hdv有效的潜在抗病毒治疗药物包括但不限于恩替卡韦、替诺福韦、拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩曲他滨、干扰素-α、聚乙二醇化干扰素-α或干扰素α-2b或其任意组合。将对患者的副作用进行监测，如头晕、恶心、腹泻、抑郁、失眠、头痛、瘙痒、皮疹、发烧或所提供抗病毒治疗的其他已知副作用。
[0190]
在至少一些先前描述的实施方案中，一个实施方案中使用的一个或多个元素可以在另一实施方案中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有这些修改和改变都旨在落入所附权利要求书所定义的主题的范围内。
[0191]
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用情况将其从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，这里可以明确阐述各种单数/复数排列。
[0192]
本领域技术人员将理解，一般而言，本文使用的术语，尤其是在所附权利要求(例如，所附权利请求的主体)中，通常被理解为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释成“至少具有”，术语“包括(include)”应解释为”包括但不限于“等)。本领域的技术人员将进一步理解，如果引入的权利要求陈述的特定数量是有意的，则该意图将在权利要求中明确陈述，并且在没有此类陈述的情况下，不存在此类意图。例如，为帮助理解，以下所附权利要求可以包括介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的用法，以介绍权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示通过不定
冠词“一项(a)”或“一项(an)”引入权利要求陈述将包括此类引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制为仅包括一个此类陈述的实施例，即使同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”以及诸如“a”或“an”之类的不确定冠词(例如，“a”和/或“an”，应解释为“至少一项”或“一项或多项”)；这同样适用于用于介绍权利要求陈述的定冠词的使用。此外，即使明确列举了引入的权利要求陈述的特定数量，本领域技术人员也将认识到，此类陈述应被解释为至少指列举的数量(例如，在没有其他修饰语的情况下，“两次陈述”的单纯陈述指代至少两次陈述，或两次或更多次陈述)。此外，在使用类似于“a、b和c等中的至少一个”的约定的情况下，一般来说，这种构造的目的在于本领域技术人员理解该约定(例如，“具有a、b和c中至少一个的系统”将包括但不限于单独具有a、单独具有b、单独具有c、同时具有a和b、同时具有a和c、同时具有b和c、和/或同时具有a、a和c等的系统)。在使用类似于“a、b或c等中的至少一个”的约定的情况下，一般来说，这种结构的目的在于本领域技术人员理解该约定(例如，“具有a、b或c中至少一个的系统”将包括但不限于具有单独a、单独b、单独c、同时具有a和b、同时具有a和c、同时具有b和c、和/或同时具有a、b和c等的系统)。本领域的技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求书或附图中，呈现两个或多个替代术语的几乎任何析取词和/或短语都应理解为考虑包括术语之一、二者择一的术语或两个术语的可能性。例如，短语“a或b”将被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性
[0193]
此外，如果本发明的特征或方面是根据马库什分组描述的，本领域技术人员将认识到，本发明也因此是根据马库什分组的任何单个成员或成员子分组描述的。
[0194]
如本领域技术人员所理解的，对于任何和所有目的，如提供书面描述，本文公开的所有范围也包括任何和所有可能的子范围及其组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并允许将相同的范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等，都包括所背诵的数字，并指的是随后可以细分为子范围的范围，如上所述。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品。类似地，具有1-5篇文章的组是指具有1、2、3、4或5篇文章等的组。
[0195]
虽然本文已公开了各种方面和实施例，但本领域技术人员将清楚了解其他方面和实施方式。本文所公开的各种方面和执行例仅用于说明目的，并非旨在限制，其真实范围和精神由以下权利要求所示。
[0196]
本文引用的所有参考文献，包括但不限于已发表和未发表的申请、专利和文献参考，均纳入本文件.
[0197]
参考文献
[0198]
razavi-shearer d,gamkrelidze i,nguyen mh,chen d-s,van damme p,abbas z,et al.global prevalence,treatment,and prevention of hepatitis b virus infection in 2016:a modelling study.lancet gastroenterol hepatol 2018；3:383
–
403.
[0199]
tr
é
po c,chan hly,lok a.hepatitis b virus infection.lancet 2014；384:2053
–
2063.
first:6 january 2019.doi:10.1053/j.gastro.2018.12.023
[0225]
liang tj,block tm,mcmahon bj,ghany mg,urban s,guo j-t,et al.present and future therapies of hepatitis b:from discovery to cure.hepatology2015；62:1893
–
1908.
[0226]
meuleman p,vanlandschoot p,leroux-roels g.a simple and rapid method to determine the zygosity of upa-transgenic scid mice.doi:10.1016/s0006-291x(03)01388-3
[0227]
meuleman p,libbrecht l,de vos r,de hemptinne b,gevaert k,vandekerckhove j,et al.morphological and biochemical characterization of a human liver in a upa-scid mouse chimera.hepatology 2005；41:847
–
856.
[0228]
levander s,f,frelin l,ahl
é
n g,rupp d,long g,et al.immune-mediated effects targeting hepatitis c virus in a syngeneic replicon cell transplantation mouse model.gut 2018；67:1525
–
1535.
[0229]
ahl
é
n g,j,tjelle t,kjeken r,frelin l,u,et al.in vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis c virus nonstructural 3/4a dna by increased local dna uptake,protein expression,inflammation,and infiltration of cd3 t cells.j immunol 2007；179:4741
–
53.
[0230]
ni y,urban s.hepatitis b virus infection of heparg cells,heparg-hntcp cells,and primary human hepatocytes.in:methods in molecular biology(clifton,n.j.).；2017.pp.15
–
25.
[0231]
donkers jm,zehnder b,van westen gjp,kwakkenbos mj,ijzerman ap,oude elferink rpj,et al.reduced hepatitis b and d viral entry using clinically applied drugs as novel inhibitors of the bile acid transporter ntcp.sci rep 2017；7:15307.
[0232]
meuleman p,lerouxroels g.the human liver-upa-scid mouse:a model for the evaluation of antiviral compounds against hbv and hcv.antiviral res2008；80:231
–
238.
[0233]
wi j,jeong ms,hong hj.construction and characterization of an anti-hepatitis b virus pres1 humanized antibody that binds to the essential receptor binding site.j microbiol biotechnol 2017；27:1336
–
1344.
[0234]
lok asf,mcmahon bj,brown rs,wong jb,ahmed at,farah w,et al.antiviral therapy for chronic hepatitis b viral infection in adults:a systematic review and meta-analysis.hepatology 2016；63:284
–
306.
[0235]
revill pa,chisari f v,block jm,dandri m,gehring aj,guo h,et al.a global scientific strategy to cure hepatitis b.lancet gastroenterol hepatol published online first:10 april 2019.doi:10.1016/s2468-1253(19)30119-0
[0236]
neurath ar,kent sb,strick n,parker k.identification and chemical synthesis of a host cell receptor binding site on hepatitis b virus.cell 1986；46:429
–
36.
[0237]
gripon p,le seyec j,rumin s,guguen-guillouzo c.myristylation of the hepatitis b virus large surface protein is essential for viral infectivity.virology 1995；213:292
–
299.
[0238]
hong hj,ryu cj,hur h,kim s,oh hk,oh ms,et al.in vivo neutralization of hepatitis b virus infection by an anti-pres1 humanized antibody in chimpanzees.virology 2004；318:134
–
141.
[0239]
bogomolov p,alexandrov a,voronkova n,macievich m,kokina k,petrachenkova m,et al.treatment of chronic hepatitis d with the entry inhibitor myrcludex b:first results of a phase ib/iia study.j hepatol 2016；65:490
–
498.
[0240]
blank a,eidam a,haag m,hohmann n,burhenne j,schwab m,et al.the ntcp-inhibitor myrcludex b:effects on bile acid disposition and tenofovir pharmacokinetics.clin pharmacol ther 2018；103:341
–
348.
[0241]
passioura t,watashi k,fukano k,sureau c,suga h,correspondence tw.de novo macrocyclic peptide inhibitors of hepatitis b virus cellular entry.cell chem biol 2018；25:906
–
915.
[0242]
bian y,zhang z,sun z,zhao j,zhu d,wang y,et al.vaccines targeting pres1 domain overcome immune tolerance in hbv carrier mice hhs public access.2017；66:1067
–
1082.
[0243]
chen m,jagya n,bansal r,frelin l,m.prospects and progress of dna vaccines for treating hepatitis b.expert rev vaccines 2016；15:629
–
640.
[0244]
yalcin k,danis r,degertekin h,alp mn,tekes s,budak t.the lack of effect of therapeutic vaccination with a pre-s2/s hbv vaccine in the immune tolerant phase of chronic hbv infection.j clin gastroenterol 2003；37:330
–
5.
[0245]
zhao h-j,han q-j,wang g,lin a,xu d-q,wang y-q,et al.i:c-based rhbvvac therapeutic vaccine eliminates hbv via generatiopolyn of hbv-specific cd8 effector memory t cells.gut 2019；:gutjnl-2017-315588.suslov a,boldanova t,wang x,wieland s,heim mh.hepatitis b virus does not interfere with innate immune responses in the human liver.gastroenterology 2018；154:1778
–
1790.