用于恢复和再生组织的生物填充物
1.相关申请本技术要求2020年1月27日递交的美国临时申请号62/966,398和2020年4月27日递交的美国临时申请号63/015,946的权益。这两份文件的全部内容均通过参考结合至本文中，除非在来自本说明书的任何公开或定义不一致的情况下，否则应视为以本文的公开或定义为主。
技术领域
2.本讲授总体上涉及以用于恢复和再生组织的组织填充物治疗组织空隙和缺损的方法，以及涉及因此的组合物和试剂盒。
3.背景乳腺癌为女性中最常诊断出的癌症，全世界每年有超过200万新病例，且仅在美国每年就有约330,000例。据估计，这些病例中有60-70% (全球~130万)接受保乳手术(bcs；也称为肿块切除术)，这代表早期乳腺癌的护理标准。常规bcs涉及通过一个小的、位置美观的切口移除肿瘤以及健康组织的无癌切缘(阴性切缘)。对于符合条件的患者，伴随辅助放疗的bcs优于全乳房切除术(即移除整个乳房)，因为其在保留患者乳房的同时产生同等生存率并减少手术时间、恢复时间和并发症。由于乳腺癌的生存率相对较高(~90%)，因此长期预后和生存对于这种疾病的治疗尤其重要。特别是对于bcs，在一次手术中完全移除癌组织(获得阴性切缘)和保持乳房形状、外观和一致性(即令人愉的乳房美容)对于实现令人满意的预后和患者生活质量至关重要。
4.bcs的主要挑战之一为切除足够的组织以去除所有癌症，同时保持可接受的美容效果。bcs的标准实践指南涉及在肿瘤切除术后“尽可能美观地闭合层中的切除(手术)缺损”。随后复杂的手术伤口愈合，留下的组织空隙充满浆液和/或血液，最初形成血清肿或血肿，然后是瘢痕形成和收缩。对于外科医生来说，预测bcs的美容效果即使不是不可能的，也极具挑战性，尤其是鉴于患者在乳腺肿瘤大小、形状和位置方面的显著差异，以及组织修复过程的不可预测性，这由于辅助放射治疗的效果而加剧。正因为如此，与bcs相关的乳房畸形水平仍然相对较高，大约三分之一的女性经历了不令人满意的美容(例如凹痕、扭曲和乳房之间的不对称)。此类结果最终已表明会降低乳腺癌幸存者的总体生活质量，伴有由于瘢痕形成和收缩所致的乳房疼痛和不适增加，抑郁、不安全和焦虑的感觉，以及对自尊、身体形象和亲密性的负面影响。进一步地，bcs对二次手术程序(例如对遗留肿瘤的再切除和修整/重建程序以修复凹陷/畸形)的需求仍然较高，估计在20-40%的范围内。这包括由于阳性切缘所致的再切除以及修复乳房畸形的修整和重建程序。总而言之，由于这些不良结果和并发症，估计初始bcs之后的重复手术每次另外程序平均增加$16,000或更多的医疗保健成本。基于这些挑战和担忧，bcs可能不是所有女性的选择，尤其是具有与乳房大小相比较较大的肿瘤(直径》5 cm；肿瘤:乳房体积百分比大于1.5%)的那些或处于乳房较低象限内的那些。因此，乳腺外科医生需要新的治疗选项来进一步优化bcs的肿瘤学和美容结果，使得他们可自信地将这种保守疗法扩展至更多具有合乎期望的结果的患者。
5.目前，没有额外的组织产品使得外科医生能够可预测地恢复、重建或再生组织，比如乳房。此外，很明显外科医生正在积极地寻找解决这一问题的方案。具体地讲，许多外科医生已经尝试使用被称为biozorb的相对新的三维螺旋形瘤床生物可吸收标志物，其主要预期标记手术腔或肿块切除术缺损，以进行有针对性的术后辅助放射治疗。乳腺外科医生已经应用这种可植入装置，希望其不仅可充当标志物，而且可填充组织空隙并改善美容效果。然而，外科医生和患者两者均对biozorb不满意，尤其是因为其产生坚硬、可触知的植入物持续长达2.8年，并增加患者的疼痛和不适。另外，外科医生已表示，其相对于其他放疗标志物而言为昂贵的，并且不会显著改善结果。
6.另一方面，存在两种实验性手术重建选择，即自体脂肪移植(也称为脂肪填充或脂肪转移)和肿瘤整形手术，其旨在改善bcs美容效果并潜在地扩大符合bcs条件的患者群体。脂肪移植包括经吸脂从身体的一个区域收获脂肪(脂肪组织)，并将经最低限度处理的脂肪组织重新注射到另一个区域(例如组织空隙)。最初，脂肪移植被用于延迟的乳房重建程序，但是最近，其已被研究用于在bcs后立即使用。这种方法的问题包括快速重吸收导致体积显著减少(在25%-80%的范围内)、脂肪坏死、积油囊肿形成、微钙化以及围绕肿瘤学安全性的问题(即癌症复发)。另一方面，肿瘤整形手术结合外科肿瘤学和整形外科的技术以在肿块切除术时进行乳房重建。肿瘤整形程序包括体积移位(剩余健康乳房组织的重新排列)和体积替换(用各种自体组织瓣重建)技术两者。尽管两种手术重建程序均提供使用患者自身组织的优势并已得见一些成功，但它们需要专业培训，通常需要多名外科医生参与以及更长的手术程序，从而限制它们的可用性并增加成本。目前，这些技术尚未得到广泛采用，因为专业培训是必要的，并且仍然担忧为改善美容而牺牲肿瘤学安全性和有效性。
7.概述根据本讲授，描述了可在转变为具有组织一致性的纤维状胶原蛋白基质之前作为液体应用于任何类型的组织空隙或缺损的恢复性和再生性组织填充物，所述组织空隙或缺损包括但不限于由手术伤口导致的组织空隙(例如包括但不限于源于bcs的手术伤口)、物理缺损(例如瘢痕、凹陷、先天性缺损等)、损伤、疾病进展和/或类似情况。
8.如本文所述，本发明人已开发了可流动的组织填充物，其包含可原位聚合寡聚胶原蛋白和中和(自组装)缓冲液。在液体胶原蛋白和中和缓冲液混合之后，中和的胶原蛋白溶液可被用于填充组织空隙(例如手术伤口)或缺损，包括深的和/或难以接近的那些以及形状不规则的组织空隙。应用后，应用的溶液经分子自组装经历快速(在体温下~1分钟)原纤维形成。所得的组织填充物基质随着时间的推移恢复和保持组织形状和组织一致性，并引发组织植入反应，其特征在于细胞化、血管化和新组织形成而不引起一般对伤口愈合观察到的炎症反应或一般对常规组织植入反应观察到的异物反应。
9.在一些实施方案中，根据本讲授的组织填充物可提供以下优势中的一种或多种：(1) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有瘢痕组织形成；(2) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有缺损收缩；(3) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有炎症介质或炎症反应；(4) 与天然组织相似的组织一致性(例如与天然组织相似的压缩模量或压缩模量范围)；(5) 用脂肪组织、乳腺组织等恢复和生成乳房组织；(6) 骨骼肌的恢复和生成；(7) 不干扰包括再切除、超声检查或放射检查在内的常规临床程序的组织植入反应；和/或(8) 较少(即相对于常规程序)或不受辅助放疗负面影响的组织植入反应(例如减少或没有脂质囊
肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域，其中任何一个均可干扰成像)。
10.在一些实施方案中，根据本讲授用于填充组织空隙或缺损的方法包括(a) 将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中，和(b) 使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
11.在一些实施方案中，根据本讲授用于填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
12.在一些实施方案中，用于填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液与中和溶液的比率为约9:1。
13.在其他实施方案中，提供根据任何上述方法制备的胶原蛋白基质。在进一步的实施方案中，提供含有胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒。在进一步的实施方案中，提供含有冻干的i型寡聚胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。在进一步的实施方案中，提供可允许与胶原蛋白基质一起的一种或多种治疗剂，包括但不限于化学治疗剂、抗炎剂、抗生素剂、镇痛剂和/或类似物质，及其组合，使得一种或多种治疗剂被配置用于在组织空隙或缺损部位处的基质内的递送。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂被配置用于在组织空隙或缺损部位处的基质内的局部递送。
14.本讲授的另外特征和优势可通过在任何以下列举的条款中阐述的实施方案进行描述。应当理解，本文描述的任何实施方案可与本文描述的任何其他实施方案结合使用，至这些实施方案不相互矛盾的程度。因此，还考虑以下列举的条款的任何适用的组合。
15.1. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
16.2. 条款1的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合寡聚胶原蛋白。
17.3. 任何前述条款的方法，其中可原位聚合寡聚胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
18.4. 任何前述条款的方法，其中至少一部分胶原蛋白分子通过一个或多个分子间交联共价键合。
19.5. 任何前述条款的方法，其中患者为哺乳动物。
20.6. 任何前述条款的方法，其中患者为人类。
21.7. 任何前述条款的方法，其中引入为在无菌条件下实现的。
22.8. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合胶原蛋白，和其中保形基质包含胶原蛋白-原纤维基质。
23.9. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含液体i型胶原蛋白。
24.10. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
25.11. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原
蛋白和酸的溶液。
26.12. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
27.13. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中该溶液进一步包含缓冲溶液。
28.14. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
29.15. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
30.16. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，其中溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
31.17. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清。
32.18. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
33.19. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
34.20. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
35.21. 任何前述条款的方法，其中引入包括经注射器将自组装生物聚合物注射到组织空隙或缺损中。
36.22. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过肿块切除程序生成。
37.23. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过乳房切除程序生成。
38.24. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
39.25. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
40.26. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
41.27. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
42.28. 任何前述条款的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
43.29. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
44.30. 条款29的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
45.31. 条款29或条款30的方法，其中酸包含0.01 n盐酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
46.32. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸；其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml；和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
47.33. 条款32的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液已经使用超速离心进行澄清，通过无菌膜滤器进行过滤，用紫外辐射进行给予，或其组合。
48.34. 条款32-33中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
49.35. 条款32-34中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
50.36. 条款32-35中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
51.37. 条款32-36中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
52.38. 条款32-37中任何一项的方法，其中自组装生物聚合物包含组织填充物。
53.39. 条款32-38中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
54.40. 条款32-39中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
55.41. 条款32-40中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
56.42. 条款32-41中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
57.43. 条款32-42中任何一项的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
58.44. 用于填充伤口的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到伤口中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的寡聚胶原蛋白和酸。
59.45. 条款44的方法，其中冻干的寡聚胶原蛋白包含冻干的i型寡聚胶原蛋白。
60.46. 条款44或条款45的方法，其中伤口包含手术伤口。
61.47. 条款44-46中任何一项的方法，其中手术伤口由肿瘤移除引起。
62.48. 条款44-47中任何一项的方法，其中手术伤口由乳房肿瘤移除引起。
63.49. 条款44-48中任何一项的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液包含组织填充物。
64.50. 条款44-49中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致缺损收缩和瘢痕组织形成。
65.51. 条款44-50中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
66.52. 条款44-51中任何一项的方法，其中伤口的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
67.53. 条款44-52中任何一项的方法，其中伤口的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
68.54. 条款44-53中任何一项的方法，其中对伤口填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
69.55. 用于恢复和再生患者组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
70.56. 条款55的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
71.57. 条款55或条款56的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
72.58. 条款55-57中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
73.59. 条款55-58中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
74.60. 条款55-59中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
75.61. 条款55-60中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
76.62. 条款55-61中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
77.63. 条款55-62中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
78.64. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
79.65. 条款64的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
80.66. 条款64或条款65的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
81.67. 条款64-66中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
82.68. 条款64-67中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
83.69. 条款64-68中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
84.70. 条款64-69中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
85.71. 条款64-70中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
86.72. 条款64-71中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
87.73. 用于制备组织空隙或缺损中的基质的方法，该方法包括使用单一混合步骤使胶原蛋白聚合，该单一混合步骤包括混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合以形成基质。
88.74. 条款73的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
89.75. 条款73或条款74的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
90.76. 条款73-75中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
91.77. 条款73-76中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
92.78. 条款73-77中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
93.79. 条款73-78中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
94.80. 条款73-79中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
95.81. 条款73-80中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白(telocollagen)。
96.82. 条款73-81中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白(atelocollagen)。
97.83. 条款73-82中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
98.84. 条款73-83中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
99.85. 条款73-84中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
100.86. 条款73-85中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
101.87. 条款73-86中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
102.88. 条款73-87中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
103.89. 条款73-88中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
104.90. 条款73-89中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
105.91. 条款73-90中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
106.92. 条款73-91中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
107.93. 条款73-92中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
108.94. 条款73-93中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
109.95. 条款73-94中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
110.96. 条款73-95中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
111.97. 条款73-96中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
112.98. 条款73-97中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
113.99. 条款73-98中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
114.100. 条款73-99中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
115.101. 条款73-100中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
116.102. 条款73-101中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
117.103. 条款73-102中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
118.104. 条款73-103中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
119.105. 条款73-104中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
120.106. 条款73-105中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
121.107. 条款73-106中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
122.108. 条款73-107中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液中。
123.109. 条款73-108中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
124.110. 条款73-109中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
125.111. 条款73-110中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照进行灭菌。
126.112. 条款73-111中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
127.113. 条款73-112中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
128.114. 条款73-113中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
129.115. 条款73-114中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
130.116. 条款73-115中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
131.117. 条款73-116中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
132.118. 用于制备组织缺损或空隙部位中的基质的方法，所述方法包括通过混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液来使胶原蛋白聚合，和聚合胶原蛋白溶液中的胶原蛋白以形成基质，其中缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
133.119. 条款118的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
134.120. 条款118或条款119的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
135.121. 条款118-120中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
136.122. 条款118-121中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
137.123. 条款118-122中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
138.124. 条款118-123中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
139.125. 条款118-124中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
140.126. 条款118-125中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白。
141.127. 条款118-126中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白。
142.128. 条款118-127中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
143.129. 条款118-128中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
144.130. 条款118-129中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
145.131. 条款118-130中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
146.132. 条款118-131中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
147.133. 条款118-132中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
148.134. 条款118-133中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
149.135. 条款118-134中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
150.136. 条款118-135中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
151.137. 条款118-136中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
152.138. 条款118-137中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
153.139. 条款118-138中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶
原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
154.140. 条款118-139中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
155.141. 条款118-140中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
156.142. 141的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
157.143. 条款118-142中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
158.144. 条款118-143中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
159.145. 条款118-144中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
160.146. 条款118-145中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
161.147. 条款118-146中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
162.148. 条款118-147中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
163.149. 条款118-148中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
164.150. 条款118-149中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
165.151. 条款118-150中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
166.152. 条款118-151中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
167.153. 条款118-152中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液中。
168.154. 条款118-153中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
169.155. 条款118-154中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
170.156. 条款118-155中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
171.157. 条款118-156中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
172.158. 条款118-157中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
173.159. 条款118-158中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
174.160. 条款118-159中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
175.161. 条款118-160中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
176.162. 条款118-161中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
177.163. 按照条款1-162中任何一项的方法制备的胶原蛋白基质。
178.164. 条款163的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
179.165. 条款163或条款164的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
180.166. 条款163-165中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
181.167. 条款163-166中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
182.168. 条款163-167中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
183.169. 条款163-168中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
184.170. 条款163-169中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
185.171. 条款163-170中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
186.172. 条款163-171中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
187.173. 条款163-172中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
188.174. 条款163-173中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
189.175. 条款163-174中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
190.176. 通过将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中，并使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质而制备的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph在约5.5-约8.5的范围内，其中自组装生物聚合物的自组装时间在约0.2分钟-约1.5分钟的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)在约2.0 kpa-约4.0 kpa的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g
’’
)在约0.1 kpa-约0.7 kpa的范围内，和其中胶原蛋白基质的压缩模量在约5.0 kpa-约10.0 kpa的范围内。
191.177. 条款176的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph为约7.25
±
约0.25，其中自组装生物聚合物的自组装时间为约0.8分钟
±
约0.3分钟，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)为约3.1 kpa
±
约0.4 kpa，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g”)为约0.4 kpa
±
约0.1 kpa，和其中胶原蛋白基质的压缩模量为约7.7 kpa
±
约1.9 kpa。
192.178. 条款176或条款177的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
193.179. 条款176-178中任何一项的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
194.180. 条款176-179中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
195.181. 条款176-180中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
196.182. 条款176-181中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
197.183. 条款176-182中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
198.184. 条款176-183中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
199.185. 条款176-184中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
200.186. 条款176-185中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
201.187. 条款176-186中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
202.188. 条款176-187中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
203.189. 条款176-188中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
204.190. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的组织的试剂盒，该试剂盒包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液。
205.191. 条款190的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含液体i型胶原蛋白。
206.192. 条款190或条款191的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
207.193. 条款190-192中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
208.194. 条款190-193中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
209.195. 条款190-194中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
210.196. 条款190-195中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液的比率为约9:1。
211.197. 条款190-196中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
212.198. 条款190-197中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清。
213.199. 条款190-198中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
214.200. 条款190-199中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含
有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
215.201. 条款190-200中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
216.202. 条款190-201中任何一项的试剂盒，其进一步包含被配置用于将可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的混合物递送至组织空隙或缺损的注射器。
217.203. 条款190-202中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
218.204. 条款190-203中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.002 mm-约.02 mm mgcl2。
219.205. 条款190-204中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含少于约.02 mm mgcl2。
220.206. 条款190-205中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
221.207. 条款190-206中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.003 m-约.03 m kh2po4。
222.208. 条款190-207中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.01 m-约0.1 m na2hpo4。
223.209. 条款190-208中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.001 m-约.04 m kcl。
224.210. 条款190-209中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2 m-约3.0 m nacl。
225.211. 条款190-210中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.02 n-约0.2 n naoh。
226.212. 条款190-211中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
227.213. 条款190-212中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
228.214. 条款190-213中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
229.215. 条款190-214中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
230.216. 条款190-215中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
231.217. 条款190-216中任何一项的试剂盒，其中中和的胶原蛋白填充物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml，所述中和的胶原蛋白填充物为包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的中和的胶原蛋白填充物。
232.218. 条款190-217中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白溶液包含约.005 n盐酸-约0.1 n盐酸。
233.219. 条款190-218中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液被配置为在单一混合步骤中使可原位聚合胶原蛋白组合物聚合，所述单一混合步骤包括混合可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液。
234.220. 条款190-219中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液处于单独容器中。
235.221. 条款190-220中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含灭菌小瓶。
236.222. 条款190-221中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含双管注射器的单独隔室。
237.223. 条款190-222中任何一项的试剂盒，其中双管注射器包含混合元件。
238.224. 条款190-223中任何一项的试剂盒，其中双管注射器被灭菌。
239.225. 条款190-224中任何一项的试剂盒，其进一步包含用于使用试剂盒的组件的说明。
240.226. 条款190-225中任何一项的试剂盒，其进一步包含至少一种被配置用于局部递送至组织空隙或缺损的治疗剂。
241.227. 条款190-226中任何一项的试剂盒，其中至少一种治疗剂包括化学治疗剂、抗炎剂、抗生素剂、镇痛剂或其组合。
242.228. 条款190-227中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含伤口。
243.229. 条款190-228中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
244.230. 条款190-229中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
245.231. 条款190-230中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
246.232. 条款190-231中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于保乳手术后再生组织。
247.233. 条款190-232中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于制备组织空隙或缺损中的基质。
248.234. 条款190-233中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用紫外辐射进行灭菌。
249.235. 条款190-234中任何一项的试剂盒，其中由可原位聚合胶原蛋白组合物聚合产生的胶原蛋白基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
250.236. 条款190-235中任何一项的试剂盒，其中聚合特性为剪切储能模量。
251.237. 条款190-236中任何一项的试剂盒，其中所述辐射的剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
252.238. 条款190-237中任何一项的试剂盒，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
253.239.条款190-238中任何一项的试剂盒，其中灭菌使病毒失活。
254.240. 条款190-239中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照进行灭菌。
255.241. 条款190-240中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
256.附图简述图1显示在原位形成具有软组织样特性的粘弹性基质的液体组织填充物的概况。图1a显示包括了含有无菌i型寡聚胶原蛋白溶液的注射器、适当中和(自组装)缓冲液的注射器、鲁尔锁适配器和施药器尖端的试剂盒。图1b显示混合两种试剂，然后注射到保持在体温(37℃)下的塑料模具中，其中液体转变成稳定的、保形的纤维状胶原蛋白基质。图1c显示记录i型寡聚胶原蛋白的纯度和特征性条带模式的4-20%和6%的sds-page凝胶，其中泳道1对应于分子量标准物和泳道2对应于i型寡聚胶原蛋白。图1d显示概述由组织填充物形成的基质的组织填充物聚合动力学和性能规格(平均值
±
sd；n=4，n=6-8)的表格。
257.图2显示模拟肿块切除程序的概况。图2a显示概述代表大约四分之一总乳房组织体积的手术切除的乳腺组织体积的表格[数据(平均值
±
sd)编汇自纵向和放疗研究两者(1周：胶原蛋白填充物：n=12，无填充=6；4周：胶原蛋白填充物：n=18，无填充：n=9；16周：胶原蛋白填充物：n=18，无填充：n=9)]。图2b显示在应用组织填充物之前的手术空隙。图2c显示在应用组织填充物之后的手术空隙。图2d显示组织填充物的应用。图2e显示切除的猪乳腺组织。图2f显示紧接在包括绷扎在内的手术后的手术部位。图2g显示模拟肿块切除术伴随辐照后16周的手术部位。
[0258]
图3显示组织填充物如何持续存在并诱导支持乳房组织形成而不引起典型炎症反应或异物反应的组织植入反应的概况。图3a显示乳腺外科医生在模拟肿块切除术后的不同时间点为胶原蛋白组织填充物和无填充(阴性对照)处理的空隙分配的乳房均匀性/一致性评分(平均值
±
sd；胶原蛋白组织填充物：n=12；无填充：n=6)的图表。所有未手术的乳房均评分为0。图3b显示与正常乳房组织相比较，在用胶原蛋白组织填充物或无填充处理后的手术空隙的横截面。箭头表示被放置以标记手术空隙边界的手术夹。
[0259]
图4显示组织填充物如何支持乳房组织形成而不引起炎症反应或异物反应的概况。图4a显示在模拟肿块切除术后1周、4周和16周时胶原蛋白填充的空隙的组织学横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙内的组织填充物及其与周围宿主组织的界面(大箭头表示手术夹部位)。高放大率图像以组织填充物的中心区域和组织填充物-宿主组织界面为特征。基质植入物内的细胞浸润、血管化和乳房组织形成随着时间的推移发生，而没有一般见于未处理的组织空隙的愈合的炎症反应(即中性粒细胞和巨噬细胞的浸润)或一般对组织植入反应观察到的异物反应(即巨噬细胞活化、巨细胞形成、吞噬作用和纤维囊形成)的迹象。到16周时，组织填充物完全细胞化和血管化(小箭头表示血管)，伴随乳腺(rg)和脂肪组织(rf)形成的迹象。onc：没有细胞浸润的组织填充物基质；oc：具有细胞浸润的组织填充物基质。图4b显示模拟肿块切除术后1周、4周和16周时未处理(未填充)的手术空隙的横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙和周围宿主组织。高放大率图像以空隙的中心区域和空隙/宿主组织界面为特征。血肿(h)在1周时常见，然后是进行性缺损收缩和导致瘢痕组织形成(s)的愈合反应。
[0260]
图5显示组织填充物如何不干扰放射检查或超声检查程序的概况。图5a显示代表性的超声图像，而图5b显示在1周、4周和16周时间点时与正常乳房组织相比较用胶原蛋白组织填充物或无填充处理的手术空隙的代表性射线照片。射线照片内明显的不透射线标记夹表示手术空隙的边界，并且显示与无填充空隙相比较，用组织填充物处理的空隙有伤口收缩减少的迹象。
[0261]
图6显示放疗如何对组织填充物和相关的组织植入反应几乎没有影响的概况。图6a显示乳腺外科医生在模拟肿块切除术伴随放疗后的不同时间点为胶原蛋白组织填充物和无填充(阴性对照)处理的空隙分配的乳房均匀性/一致性评分(平均值
±
sd；胶原蛋白：n=6；无填充：n=3)的图表。所有未手术的乳房均评分为0。图6b显示与未手术的正常乳房组织相比较，用组织填充物或无填充以及放疗处理后的手术空隙横截面。箭头表示被放置以标记手术空隙边界的手术夹。图6c显示在模拟肿块切除术与辅助放疗后4周和16周时胶原蛋白填充的空隙的组织学横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙内的组织填充物及其与周围宿主组织的界面。高放大率图像以组织填充物的中心区域和组织填充物-宿主组织界面为特征。基质植入物内的细胞浸润、血管化和乳房组织形成随着时间的推移发生，尽管速率比非辐照动物的部位慢。到16周时，组织填充物完全细胞化和血管化(小箭头表示血管)，有脂肪组织(rf)形成的迹象。onc：没有细胞浸润的组织填充物基质；oc：具有细胞浸润的组织填充物基质。图6d显示模拟肿块切除术伴随放疗后4周和16周时未处理(无填充)的手术空隙的横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙和周围宿主组织，4周时瘢痕组织(s)和缝合相关肉芽肿(g)明显(大箭头表示手术夹部位)。高放大率图像以炎症反应的中心区域和空隙内形成的瘢痕组织，即瘢痕-宿主组织界面为特征。
[0262]
图7显示组织填充物如何即使在辅助放疗之后也不影响乳房组织诊断图像的解释的概况。图7a显示代表性的超声图像，而图7b显示在4周和16周时间点时与正常乳房相比较用组织填充物或无填充以及辐照处理的手术空隙的代表性射线照片。射线照片内明显的不透射线标记夹表示手术空隙的边界，并且显示与无填充空隙相比较，用组织填充物处理的空隙的伤口收缩减少。
[0263]
图8显示在猪模拟肿块切除模型中观察到的愈合反应的时间线和过程。图8a显示比较和对比与对无填充观察到的典型修复性愈合反应相关的阶段和过程的示意图。图8b显示比较和对比与对胶原蛋白组织填充物观察到的恢复性和再生性愈合反应相关的阶段和过程的示意图。
[0264]
图9显示正常乳房组织和上覆皮肤的多种组织类型组成以及辐照的效果。横截面(h&e)显示来自未接受辐照和肿块切除术后伴随放疗4周和16周的猪的正常乳房组织和相关皮肤。乳腺组织由胶原结缔组织(c)、乳腺小叶(m)、乳腺导管(d)和脂肪(adipose)(脂肪(fatty))组织(f)组成。皮肤含有多细胞表皮层(e)与位于下方的胶原真皮(c)。
[0265]
图10显示用于猪乳房术后评价的半定量评分。基于总体外观评价乳房和手术部位，所述总体外观包括红斑和焦痂以及水肿的迹象。触诊用于评价乳房均匀性和一致性。
[0266]
图11显示在无填充处理的空隙中腺体坏死明显的情况下胶原组织填充物如何支持乳腺形成的概况。相应的h＆e (图11a和11c)和广谱细胞角蛋白染色(图11b和11d)的横截面显示用胶原蛋白组织填充物(图11a和11b)或无填充(图11c和11d)处理后16周的手术空隙，所选区域分别代表胶原蛋白组织填充物的外围和形成的瘢痕组织。广谱细胞角蛋白突出胶原蛋白组织填充物和无填充组内乳腺小叶和导管内衬的上皮细胞。无填充组也显示坏死腺体的迹象(黑色和白色箭头)。免疫荧光图像显示广谱细胞角蛋白(绿色)，和细胞核用dapi (蓝色)复染。
[0267]
图12显示在猪背颈部内创建骨骼肌和脂肪组织缺损的概况。缺损处充满符合空隙几何形状的液体胶原蛋白。应用之后约1分钟内，液体胶原蛋白原位聚合，形成恢复组织形
态和连续性的胶原蛋白基质。
[0268]
图13显示植入后11周胶原蛋白基质内新形成的骨骼肌和脂肪(adipose) (脂肪(fat))组织的概况，其中没有一般见于未处理的组织空隙的愈合的炎症反应(即中性粒细胞和巨噬细胞的浸润)或一般对组织植入反应观察到的异物反应(即巨噬细胞活化、巨细胞形成、吞噬作用和纤维囊形成)的迹象。c：胶原组织填充物基质；f：脂肪；m：骨骼肌；箭头：相关的微脉管系统。
[0269]
图14显示胶原蛋白组织填充物试剂盒的代表性组件的示意图。
[0270]
详述根据本讲授，描述了在转变为具有组织一致性的纤维状胶原蛋白基质之前可作为液体应用于任何类型的组织空隙或缺损的恢复性和再生性组织填充物，所述组织空隙或缺损包括但不限于由手术伤口导致的组织空隙(例如包括但不限于源于bcs的手术伤口)、物理缺损(例如瘢痕、凹陷、先天性缺损等)、损伤、疾病进展和/或类似情况。使用猪模拟bcs模型，根据本讲授的胶原蛋白填充物已经显示诱导再生性愈合反应，其特征为快速细胞化、血管化和进行性乳房组织新生，包括脂肪组织和乳腺和导管。与常规生物材料形成对比，对于根据本讲授的胶原蛋白填充物未观察到异物反应或炎症介导的“活跃”生物降解。此外，根据本讲授的胶原蛋白填充物也不影响模拟手术再切除、放射检查或超声检查程序，其为对于临床转化重要的特征。此外，在应用术后放疗后，对根据本讲授胶原蛋白填充物的组织反应与非辐照条件下的反应非常相似(尽管正如预期的那样愈合稍慢)。根据本讲授的形成原位基质的胶原蛋白易于应用，符合患者特异性的缺损，并且在不存在炎症的情况下生成复杂组织。因此，根据本讲授的胶原蛋白填充物作为用于bcs以及其他软组织恢复和重建需求的第一种再生性组织填充物具有显著的转化潜力。
[0271]
在一些实施方案中，根据本讲授的再生性组织填充物可提供以下优势中的一种或多种：(1) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有瘢痕组织形成；(2) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有缺损收缩；(3) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有炎症介质或炎症反应；(4) 与天然组织相似的组织一致性(例如与天然组织相似的压缩模量或压缩模量范围)；(5) 用脂肪组织、乳腺组织等恢复和生成乳房组织；(6) 骨骼肌的恢复和生成；(7) 不干扰包括再切除、超声检查或放射检查在内的常规临床程序的组织植入反应；和/或(8) 较少(即相对于常规程序)或不受辅助放疗负面影响的组织植入反应(例如没有脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域，其中任何一个均可干扰成像)。
[0272]
根据本讲授，本发明人已经寻求这样一种组织填充物，其应当(i) 可预测地恢复和再生损伤的组织和组织空隙，(ii) 易于应用，(iii) 符合在尺寸和几何形状上广泛变化的患者特异性的缺损，以及(iv) 不干扰或影响常规临床过程和程序。在一些实施方案中，将组织填充物在无菌条件下引入到组织空隙或缺损中。在一些实施方案中，可经注射(例如使用一个或多个单管注射器、双管注射器和/或类似物及其组合)将组织填充物引入到组织空隙或缺损中。在其他实施方案中，组织填充物可最初应用于外部模具(例如在手术环境下)以形成模制部件，所述部件然后可从模具中被取出并植入到患者体内。再生医学方法，包括可调谐的原位形成生物材料，具有解决许多的这些设计考虑的潜力。特别是，i型寡聚胶原蛋白(寡聚体)为易溶于稀酸的胶原蛋白的高度纯化的分子形式，其代表具有解决许多的这些设计考虑的潜力的可调式原位形成生物材料。与常规单体胶原蛋白制剂(即端胶原
蛋白和去端胶原蛋白)不同，寡聚体代表全长三螺旋胶原蛋白分子(即原胶原蛋白)的小聚集体，其羧基-和氨基-末端端肽完整，通过天然存在的分子间交联保持在一起。保持这些关键分子特征，包括羧基-和氨基-末端端肽区域和相关的分子间交联，为这种天然聚合物及其形成的胶原蛋白材料提供合乎期望但不常见的特性。更具体地讲，寡聚体保持其纤维状胶原蛋白固有的原纤维形成(自组装)能力。在将寡聚体中和至生理条件(例如ph和离子强度)后，这种液体形式可非常易于注射以完全填充复杂的轮廓和几何形状。在体温下，液体快速转变为纤维状胶原蛋白基质，再创建在组织的胞外基质(ecm)成分中发现的胶原蛋白基质的结构和生物信号传导特征。在体内植入后，这些基质持续存在，显示出缓慢的代谢更新和重塑、对蛋白水解降解的抗性以及没有活跃的生物降解或异物反应。这种天然聚合物支持创建具有广泛可调谐物理特性的材料，所述物理特性包括几何形状、架构(随机或排列的原纤维、连续的原纤维密度梯度)和机械完整性，使其成为个性化再生医学的致能平台。原位形成的胶原蛋白基质显示出作为保乳手术和其他软组织恢复需求的再生性组织填充物的前景。
[0273]
在一些实施方案中，提供在转变为具有组织一致性的纤维状胶原蛋白基质之前可作为液体应用于伤口的再生性组织填充物，所述伤口包括但不限于bcs期间的缺损或轮廓。使用猪模拟bcs模型，如以下进一步描述的那样，胶原蛋白填充物显示出诱导再生性愈合反应，其特征为快速细胞化、血管化和进行性乳房组织新生，包括脂肪组织和乳腺和导管。与常规生物材料不同，未观察到异物反应或炎症介导的“活跃”生物降解。胶原蛋白填充物也不影响模拟的手术再切除、放射检查或超声检查程序，其为对于临床转化重要的特征。当应用bcs后放疗时，胶原蛋白填充及其相关的组织反应与非辐照条件非常相似。然而，正如预期的那样，愈合速率稍慢。这种原位基质形成胶原蛋白易于应用，符合患者特异性缺损/轮廓，并且在不存在炎症的情况下生成复杂组织。其作为用于bcs以及其他软组织和骨骼肌组织恢复和重建需求的第一种再生性组织填充物具有显著的转化潜力。
[0274]
本文所述的胶原蛋白填充物与常规可流动和可注射的胶原蛋白产品根本不同，这些胶原蛋白产品用于或先前已经用于软组织增强(例如美容程序)、皮肤伤口(例如溃疡)的处理和组织膨胀(例如尿失禁)。包括zyderm
®
、zyplast
®
、integra flowable
®
和contigen
®
在内的此类产品由源于牛、猪或人体组织来源的重构的酶处理的胶原蛋白(去端胶原蛋白)或者粒状组织颗粒制成。为使这些材料可注射，使不溶性纤维胶原蛋白或组织颗粒悬浮于生理盐水溶液中以产生分散体或悬浮液。所有的这些可植入的胶原蛋白均为暂时的，并表现出快速生物降解(重吸收；1-6个月)，其中它们经炎症介导的过程活跃降解，所述过程包括巨噬细胞/巨细胞的吞噬作用和分泌的基质金属蛋白酶的蛋白水解降解。为减缓降解和提高持久性，这些产品中的许多均用戊二醛或其他外源性交联工艺处理。
[0275]
相比之下，寡聚胶原蛋白代表在天然组织胶原纤维(例如猪真皮)内发现的分子亚结构域，可对其进行提取和纯化，使得其不含细胞和其他免疫原性组织成分。包含该亚结构域的i型胶原蛋白和交联化学在物种间高度保守，证明体内该主要结构元件的重要性。生理条件诱导原纤维形成，其中寡聚体分子组装成交错阵列，产生相互连接的网络或原纤维基质。公开的研究表明，形成的基质与在胞外基质中天然发现的那些非常相似，包括易于参与生物信号传导的具有规则d-条带模式的原纤维。寡聚体中存在但在可聚合单体胶原蛋白中未发现的天然交联化学为快速基质形成反应以及寡聚体基质表现出的改善机械完整性、缓
慢代谢更新和对蛋白水解降解的抗性的主要贡献者。总的来说，当与常规可生物降解胶原蛋白材料相比较，这些显著特征助于寡聚体基质显示出罕见作用机制和再生性组织反应。
[0276]
恢复和再生患病、损伤或功能失调的组织的能力一直为医学中最大的挑战之一。事实上，研究人员一直在努力鉴定生物材料和/或抗炎剂，以实现更合乎期望的愈合结果(即再生)或生物材料/装置植入物反应。对于乳房来说，这种挑战特别困难，因为其由具有不同功能的多种组织类型组成，包括分泌(即产乳)腺体和导管、支撑性胶原结缔组织和体积填充脂肪组织。目前，用于软组织和乳房重建的组织工程和再生医学策略仍处于其起步阶段，迄今只有少数策略在大型动物模型中进行评估。大多数方法均集中于从生物或合成支架工程化脂肪组织，结合脂肪填充、患者来源的细胞群和生长因子以促进脂肪生成和血管化。常规合成支架方法的一个主要缺点为材料无法向细胞发出信号，从而导致异物反应及缓慢的细胞化和血管化。
[0277]
在一些实施方案中，组织填充物可包含纯化的、形成原纤维的液体i型胶原蛋白，比如源于猪真皮的胶原蛋白。在一些实施方案中，这种原位形成胶原蛋白装置可作为含有以下的一次性使用试剂盒提供：含有在稀(0.01 n)盐酸中的胶原蛋白溶液(10 ml)的无菌玻璃小瓶、含有专有中和(自组装)试剂(2 ml)的无菌玻璃小瓶、两个无菌10-ml注射器、无菌鲁尔锁连接器和无菌施药器尖端。在一个注射器中吸取9 ml液体胶原蛋白和在另一个注射器中吸取1 ml中和缓冲液之后，用户将两个注射器用鲁尔锁连接器连接起来并混合两种试剂。混合之后，可注射中和的胶原蛋白溶液以填充组织空隙或缺损，包括较深且难以接近和形状不规则的那些组织空隙或缺损。应用后，其会经分子自组装经历快速(在体温下~1分钟)的原纤维形成。所得的组织填充物基质随着时间的推移恢复和保持组织形状和软组织一致性，并引发组织植入反应，其特征在于细胞化、血管化和新组织形成而不引起一般对伤口愈合观察到的炎症反应或一般对常规组织植入反应观察到的异物反应。
[0278]
特殊配制的胶原蛋白的液体形式易于填充并符合患者特异性的缺损的几何形状和轮廓，且适用于微创程序。一旦应用于该部位，则胶原蛋白溶液经历聚合(分子自组装反应)以形成物理上稳定的纤维状胶原蛋白基质，该基质会持续存在并保持其体积。该基质在不存在炎症反应或异物反应的情况下提供给细胞关键的生化和生物力学信号传导，支持细胞化、血管化和部位适合的组织形成。这包括具有不同功能的复杂组织组成，比如在乳房中发现的那些。该材料与许多的标准临床程序相容，包括辐照、放射检查、超声检查和手术再切除。
[0279]
贯穿本说明书和所附权利要求，应理解以下定义：短语“寡聚胶原蛋白”是指包含交联胶原蛋白分子的胶原蛋白。胶原蛋白分子由3个单独的多肽链组成，它们共同产生其三螺旋四级结构，其侧翼为非螺旋端肽末端。如本文使用的，短语“寡聚胶原蛋白”应被理解为是指至少一部分通过分子间交联共价保持在一起的胶原蛋白分子。例如，如本文所述，寡聚胶原蛋白可以聚合。可聚合寡聚胶原蛋白为能够聚合的寡聚胶原蛋白。可在寡聚胶原蛋白中发现的交联胶原蛋白分子的一个实例为原胶原蛋白。
[0280]
术语“灭菌”是指去除污染物，包括但不限于传染物。例如，污染物(例如细菌、病毒)可通过灭活、减少数量或量或者通过抑制污染物质(无论是否具有传染性)的活性来去除。
[0281]
术语“纯化的”是指去除污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和内毒素。
[0282]
短语“异物反应”是指由任何通常不会在体内发现的物质引发的局部炎症反应。这种反应的特征可为蛋白吸附和以巨噬细胞活化、巨细胞形成和纤维囊形成和/或外来物质的降解或吞噬作用为标志的炎症过程。
[0283]
短语“组织植入反应”是指“异物反应”的子集，其具体是由将材料植入患者体内而产生的。
[0284]
术语“患者”是指待治疗组织空隙或缺损的任何动物，包括但不限于脊椎动物。如本文使用的，术语“患者”包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物、鸟和鱼。在一些实施方案中，患者是指哺乳动物(例如人类、狗、猫、马、兔、猪等)。在说明性实施方案中，患者为人。
[0285]
术语“空隙”和“缺损”是指所有形式的组织异常，包括但不限于伤口、手术伤口(例如包括但不限于源于bcs的手术伤口)、物理缺损(例如瘢痕、凹陷、先天性缺损等)、损伤、疾病进展(肌肉萎缩等)和/或类似情况及其组合。如本文使用的，术语“组织”包括硬组织(例如骨骼)和软组织两者。因此，短语“组织异常”包括硬和软组织两者中所有形式的异常。
[0286]
如关于组织而使用的，术语“恢复”和“再生”分别是指在先前已表征为组织空隙或缺损的患者区域中组织存在的重建以及在该相同区域中的组织再生长。在一些实施方案中，恢复和/或再生的组织可反映被替换的初始组织的一种或多种外观、结构和功能。
[0287]
如关于组织而使用的，术语“收缩”是指一类以组织面积减少为特征并且一般由身体的愈合反应引起的瘢痕形成。
[0288]
术语“基质”是指胶原蛋白-原纤维支架样结构，该结构被配置为提供组织可以起源、发育和/或生长于其上、周围和内部的平台。
[0289]
在一些实施方案中，用于根据本讲授填充组织空隙或缺损的方法包括(a) 将自组装生物聚合物引入到组织缺损或空隙中，和(b) 使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
[0290]
在一些实施方案中，用于根据本讲授填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到手术伤口部位；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。该寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0291]
在一些实施方案中，用于填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到手术伤口部位；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液与中和溶液的比率为约9:1。
[0292]
在其他实施方案中，提供根据任何上述方法制备的胶原蛋白基质。在另外的实施方案中，提供含有胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒。在进一步的实施方案中，提供含有冻干的i型寡聚胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。
[0293]
通过以下列举的条款描述几个另外的实施方案。还考虑这些实施方案的任何适用
的组合，并且还考虑这些实施方案与本技术的该详述部分中描述的实施方案的任何适用的组合。
[0294]
1. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
[0295]
2. 条款1的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合寡聚胶原蛋白。
[0296]
3. 任何前述条款的方法，其中可原位聚合寡聚胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
[0297]
4. 任何前述条款的方法，其中至少一部分胶原蛋白分子通过一个或多个分子间交联共价键合。
[0298]
5. 任何前述条款的方法，其中患者为哺乳动物。
[0299]
6. 任何前述条款的方法，其中患者为人类。
[0300]
7. 任何前述条款的方法，其中引入为在无菌条件下实现的。
[0301]
8. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合胶原蛋白，和其中保形基质包含胶原蛋白-原纤维基质。
[0302]
9. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含液体i型胶原蛋白。
[0303]
10. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
[0304]
11. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
[0305]
12. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
[0306]
13. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中该溶液进一步包含缓冲溶液。
[0307]
14. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0308]
15. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0309]
16. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，其中溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
[0310]
17. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清。
[0311]
18. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0312]
19. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0313]
20. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原
蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0314]
21. 任何前述条款的方法，其中引入包括经注射器将自组装生物聚合物注射到组织空隙或缺损中。
[0315]
22. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过肿块切除程序生成。
[0316]
23. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过乳房切除程序生成。
[0317]
24. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0318]
25. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0319]
26. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0320]
27. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
[0321]
28. 任何前述条款的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0322]
29. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0323]
30. 条款29的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0324]
31. 条款29或条款30的方法，其中酸包含0.01 n盐酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
[0325]
32. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸；其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml；和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0326]
33. 条款32的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液已经使用超速离心进行澄清，通过无菌膜滤器进行过滤，用紫外辐射进行给予，或其组合。
[0327]
34. 条款32-33中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0328]
35. 条款32-34中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0329]
36. 条款32-35中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0330]
37. 条款32-36中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
[0331]
38. 条款32-37中任何一项的方法，其中自组装生物聚合物包含组织填充物。
[0332]
39. 条款32-38中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0333]
40. 条款32-39中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0334]
41. 条款32-40中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0335]
42. 条款32-41中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
[0336]
43. 条款32-42中任何一项的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0337]
44. 用于填充伤口的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到伤口中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的寡聚胶原蛋白和酸。
[0338]
45. 条款44的方法，其中冻干型寡聚胶原蛋白包含冻干的i型寡聚胶原蛋白。
[0339]
46. 条款44或条款45的方法，其中伤口包含手术伤口。
[0340]
47. 条款44-46中任何一项的方法，其中手术伤口由肿瘤移除引起。
[0341]
48. 条款44-47中任何一项的方法，其中手术伤口由乳房肿瘤移除引起。
[0342]
49. 条款44-48中任何一项的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液包含组织填充物。
[0343]
50. 条款44-49中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致缺损收缩和瘢痕组织形成。
[0344]
51. 条款44-50中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0345]
52. 条款44-51中任何一项的方法，其中伤口的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0346]
53. 条款44-52中任何一项的方法，其中伤口的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
[0347]
54. 条款44-53中任何一项的方法，其中对伤口填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0348]
55. 用于恢复和再生患者组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
[0349]
56. 条款55的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0350]
57. 条款55或条款56的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0351]
58. 条款55-57中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0352]
59. 条款55-58中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0353]
60. 条款55-59中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0354]
61. 条款55-60中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和
再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0355]
62. 条款55-61中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
[0356]
63. 条款55-62中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0357]
64. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0358]
65. 条款64的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0359]
66. 条款64或条款65的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0360]
67. 条款64-66中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0361]
68. 条款64-67中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0362]
69. 条款64-68中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0363]
70. 条款64-69中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0364]
71. 条款64-70中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
[0365]
72. 条款64-71中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0366]
73. 用于制备组织空隙或缺损中的基质的方法，该方法包括使用单一混合步骤使胶原蛋白聚合，该单一混合步骤包括混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合以形成基质。
[0367]
74. 条款73的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0368]
75. 条款73或条款74的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0369]
76. 条款73-75中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
[0370]
77. 条款73-76中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
[0371]
78. 条款73-77中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
[0372]
79. 条款73-78中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0373]
80. 条款73-79中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0374]
81. 条款73-80中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白。
[0375]
82. 条款73-81中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白。
[0376]
83. 条款73-82中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
[0377]
84. 条款73-83中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
[0378]
85. 条款73-84中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
[0379]
86. 条款73-85中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
[0380]
87. 条款73-86中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
[0381]
88. 条款73-87中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
[0382]
89. 条款73-88中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
[0383]
90. 条款73-89中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
[0384]
91. 条款73-90中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
[0385]
92. 条款73-91中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
[0386]
93. 条款73-92中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
[0387]
94. 条款73-93中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
[0388]
95. 条款73-94中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
[0389]
96. 条款73-95中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
[0390]
97. 条款73-96中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
[0391]
98. 条款73-97中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
[0392]
99. 条款73-98中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
[0393]
100. 条款73-99中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
[0394]
101. 条款73-100中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
[0395]
102. 条款73-101中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
[0396]
103. 条款73-102中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
[0397]
104. 条款73-103中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
[0398]
105. 条款73-104中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分
比-约5重量百分比的葡萄糖。
[0399]
106. 条款73-105中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
[0400]
107. 条款73-106中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
[0401]
108. 条款73-107中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液中。
[0402]
109. 条款73-108中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
[0403]
110. 条款73-109中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
[0404]
111. 条款73-110中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照进行灭菌。
[0405]
112. 条款73-111中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0406]
113. 条款73-112中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
[0407]
114. 条款73-113中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0408]
115. 条款73-114中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0409]
116. 条款73-115中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0410]
117. 条款73-116中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
[0411]
118. 用于制备组织缺损或空隙部位中的基质的方法，所述方法包括通过混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液来使胶原蛋白聚合，和聚合胶原蛋白溶液中的胶原蛋白以形成基质，其中缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
[0412]
119. 条款118的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0413]
120. 条款118或条款119的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0414]
121. 条款118-120中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
[0415]
122. 条款118-121中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
[0416]
123. 条款118-122中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
[0417]
124. 条款118-123中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0418]
125. 条款118-124中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0419]
126. 条款118-125中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白。
[0420]
127. 条款118-126中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白。
[0421]
128. 条款118-127中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
[0422]
129. 条款118-128中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
[0423]
130. 条款118-129中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
[0424]
131. 条款118-130中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
[0425]
132. 条款118-131中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
[0426]
133. 条款118-132中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
[0427]
134. 条款118-133中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
[0428]
135. 条款118-134中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
[0429]
136. 条款118-135中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
[0430]
137. 条款118-136中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
[0431]
138. 条款118-137中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
[0432]
139. 条款118-138中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
[0433]
140. 条款118-139中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
[0434]
141. 条款118-140中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
[0435]
142. 141的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
[0436]
143. 条款118-142中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
[0437]
144. 条款118-143中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
[0438]
145. 条款118-144中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
[0439]
146. 条款118-145中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
[0440]
147. 条款118-146中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
[0441]
148. 条款118-147中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
[0442]
149. 条款118-148中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
[0443]
150. 条款118-149中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
[0444]
151. 条款118-150中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
[0445]
152. 条款118-151中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
[0446]
153. 条款118-152中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液
中。
[0447]
154. 条款118-153中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
[0448]
155. 条款118-154中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
[0449]
156. 条款118-155中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
[0450]
157. 条款118-156中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0451]
158. 条款118-157中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
[0452]
159. 条款118-158中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0453]
160. 条款118-159中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0454]
161. 条款118-160中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0455]
162. 条款118-161中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
[0456]
163. 按照条款1-162中任何一项的方法制备的胶原蛋白基质。
[0457]
164. 条款163的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
[0458]
165. 条款163或条款164的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
[0459]
166. 条款163-165中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
[0460]
167. 条款163-166中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
[0461]
168. 条款163-167中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
[0462]
169. 条款163-168中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
[0463]
170. 条款163-169中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0464]
171. 条款163-170中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0465]
172. 条款163-171中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0466]
173. 条款163-172中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
[0467]
174. 条款163-173中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
[0468]
175. 条款163-174中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0469]
176. 通过将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中，并使自组装生物聚合
物聚合以形成保形基质而制备的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph在约5.5-约8.5的范围内，其中自组装生物聚合物的自组装时间在约0.2分钟-约1.5分钟的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)在约2.0 kpa-约4.0 kpa的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g
’’
)在约0.1 kpa-约0.7 kpa的范围内，和其中胶原蛋白基质的压缩模量在约5.0 kpa-约10.0 kpa的范围内。
[0470]
177. 条款176的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph为约7.25
±
约0.25，其中自组装生物聚合物的自组装时间为约0.8分钟
±
约0.3分钟，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)为约3.1 kpa
±
约0.4 kpa，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g”)为约0.4 kpa
±
约0.1 kpa，和其中胶原蛋白基质的压缩模量为约7.7 kpa
±
约1.9 kpa。
[0471]
178. 条款176或条款177的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
[0472]
179. 条款176-178中任何一项的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
[0473]
180. 条款176-179中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
[0474]
181. 条款176-180中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
[0475]
182. 条款176-181中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
[0476]
183. 条款176-182中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
[0477]
184. 条款176-183中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0478]
185. 条款176-184中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0479]
186. 条款176-185中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0480]
187. 条款176-186中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
[0481]
188. 条款176-187中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
[0482]
189. 条款176-188中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0483]
190. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的组织的试剂盒，该试剂盒包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液。
[0484]
191. 条款190的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含液体i型胶原蛋白。
[0485]
192. 条款190或条款191的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
[0486]
193. 条款190-192中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
[0487]
194. 条款190-193中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含
有冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
[0488]
195. 条款190-194中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
[0489]
196. 条款190-195中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0490]
197. 条款190-196中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
[0491]
198. 条款190-197中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清。
[0492]
199. 条款190-198中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0493]
200. 条款190-199中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0494]
201. 条款190-200中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0495]
202. 条款190-201中任何一项的试剂盒，其进一步包含被配置用于将可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的混合物递送至组织空隙或缺损的注射器。
[0496]
203. 条款190-202中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
[0497]
204. 条款190-203中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.002 mm-约.02 mm mgcl2。
[0498]
205. 条款190-204中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含少于约.02 mm mgcl2。
[0499]
206. 条款190-205中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
[0500]
207. 条款190-206中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.003 m-约.03 m kh2po4。
[0501]
208. 条款190-207中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.01 m-约0.1 m na2hpo4。
[0502]
209. 条款190-208中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.001 m-约.04 m kcl。
[0503]
210. 条款190-209中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2 m-约3.0 m nacl。
[0504]
211. 条款190-210中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.02 n-约
0.2 n naoh。
[0505]
212. 条款190-211中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
[0506]
213. 条款190-212中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
[0507]
214. 条款190-213中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
[0508]
215. 条款190-214中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
[0509]
216. 条款190-215中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
[0510]
217. 条款190-216中任何一项的试剂盒，其中中和的胶原蛋白填充物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml，所述中和的胶原蛋白填充物为包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的中和的胶原蛋白填充物。
[0511]
218. 条款190-217中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白溶液包含约.005 n盐酸-约0.1 n盐酸。
[0512]
219. 条款190-218中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液被配置为在单一混合步骤中使可原位聚合胶原蛋白组合物聚合，所述单一混合步骤包括混合可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液。
[0513]
220. 条款190-219中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液处于单独容器中。
[0514]
221. 条款190-220中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含灭菌小瓶。
[0515]
222. 条款190-221中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含双管注射器的单独隔室。
[0516]
223. 条款190-222中任何一项的试剂盒，其中双管注射器包含混合元件。
[0517]
224. 条款190-223中任何一项的试剂盒，其中双管注射器被灭菌。
[0518]
225. 条款190-224中任何一项的试剂盒，其进一步包含用于使用试剂盒的组件的说明。
[0519]
226. 条款190-225中任何一项的试剂盒，其进一步包含至少一种被配置用于局部递送至组织空隙或缺损的治疗剂。
[0520]
227. 条款190-226中任何一项的试剂盒，其中至少一种治疗剂包括化学治疗剂、抗炎剂、抗生素剂、镇痛剂或其组合。
[0521]
228. 条款190-227中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0522]
229. 条款190-228中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0523]
230. 条款190-229中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0524]
231. 条款190-230中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
[0525]
232. 条款190-231中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于保乳手术后再生组织。
[0526]
233. 条款190-232中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于制备组织空隙或缺损中的基质。
[0527]
234. 条款190-233中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用紫外辐射进行灭菌。
[0528]
235. 条款190-234中任何一项的试剂盒，其中由可原位聚合胶原蛋白组合物聚合产生的胶原蛋白基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
[0529]
236. 条款190-235中任何一项的试剂盒，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0530]
237. 条款190-236中任何一项的试剂盒，其中所述辐射的剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0531]
238. 条款190-237中任何一项的试剂盒，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0532]
239.条款190-238中任何一项的试剂盒，其中灭菌使病毒失活。
[0533]
240. 条款190-239中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照进行灭菌。
[0534]
241. 条款190-240中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0535]
用于根据本讲授使用的源于猪真皮的纯化的形成原纤维的液体i型胶原蛋白描述于申请者的共同未决的于2019年7月31日递交的美国专利申请序列号16/482,465和国际公开号wo 2018/144496 a1中。两份文件的全部内容均通过参考以其全部结合至本文中。
[0536]
为制备用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白，可使用本领域已知用于制备胶原蛋白的任何方法。在说明性的实施方案中，胶原蛋白可通过在bailey jl, critser pj, whittington c, kuske jl, yoder mc, voytik-harbin sl; collagen oligomers modulate physical and biological properties of three-dimensional self-assembled matrices, biopolymers (2011) 95(2):77-93，kreger st, bell bj, bailey j, stites e, kuske j, waisner b, voytik-harbin sl; polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations, biopolymers (2010) 93(8):690-707，美国专利申请公开号20080268052或美国专利申请公开号20120027732中描述的方法制备，所述文件的每一个均通过参考结合至本文中。
[0537]
在各种说明性实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可从本领域已知的任何合适的胶原蛋白来源获得，条件是至少一部分胶原蛋白包括可聚合寡聚胶原蛋白。示例性的胶原蛋白来源包括粘膜下层组织(美国专利号4,902,508、5,281,422和5,275,826)、心包组织、膀胱黏膜下层组织、胃黏膜下层组织、肝基底膜组织、胎盘组织、卵巢组织、动物尾部组织、皮肤组织(例如gallop等人, preparation and properties of soluble collagens, meth. enzymol. 6: 635-641 (1963)，通过参考结合至本文中)以及通常含有胞外基质的组织。在各种实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白类型可为任何合适的胶原蛋白类型，包括但不限于i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白、iii型胶原蛋白或iv型胶原蛋白或其组合。
[0538]
在一些实施方案中，富含胶原蛋白寡聚体的组织(例如猪皮肤组织)也可被用于获得用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白，或者胶原蛋白可得自产生胶原蛋白寡聚体的细
胞(例如通过重组技术进行改变以表达胶原蛋白寡聚体的细胞)或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体(例如使用本领域已知的交联剂)来获得。在一些实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可包含寡聚体或者可由寡聚体组成。在一些实施方案中，胶原蛋白可包含寡聚体和其他形式的胶原蛋白，比如单体、端胶原蛋白和/或去端胶原蛋白。
[0539]
在另一个实施方案中，胶原蛋白可为可溶性胶原蛋白或增溶性胶原蛋白。在其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白或增溶性胶原蛋白的实施方案中，胶原蛋白基本上不含不溶性胶原蛋白，但可含有一些不溶性胶原蛋白。在另一个实施方案中，胶原蛋白由可溶性胶原蛋白或增溶性胶原蛋白组成。
[0540]
在各种说明性实施方案中，胶原蛋白、胶原蛋白组合物、胶原蛋白基质、胶原蛋白溶液、冻干的胶原蛋白和/或缓冲溶液(本文中也被称为中和缓冲液或自组装试剂)可使用本领域已知的灭菌技术进行灭菌，所述灭菌技术包括但不限于环氧丙烷或环氧乙烷处理、气体等离子体灭菌、γ-辐射(例如0.1-10 mrad)、紫外辐射(例如uvc辐照)、电子束、病毒过滤、无菌过滤(例如用0.22
ꢀµ
m过滤器)、氯仿暴露和/或过氧乙酸灭菌及其组合。在该实施方案中，灭菌程序不应当不利地影响胶原蛋白的结构、胶原蛋白的聚合特性或灭菌的胶原蛋白的生物学特性。在各种实施方案中，胶原蛋白可在冻干之前或之后进行灭菌(以下描述冻干程序)。
[0541]
在包括紫外辐射(例如uvc辐照)的实施方案中，由胶原蛋白聚合产生的胶原蛋白基质可分别相对于未辐照的胶原蛋白、未辐照的胶原蛋白组合物、未辐照的胶原蛋白基质、未辐照的胶原蛋白溶液或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。在此类实施方案中，聚合特性可选自剪切储能模量、弹性模量(杨氏模量)、拉伸模量、压缩模量、原纤维结构、蛋白水解降解、细胞信号传导及其组合。在各种实施方案中，紫外辐射剂量(例如uvc辐照)可在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约700 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约600 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约500 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约400 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约300 mj/cm2、5 mj/cm
2-约200 mj/cm2、5 mj/cm
2-约100 mj/cm2、5 mj/cm
2-约50 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约700 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约600 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约500 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约400 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约200 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约100 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约50 mj/cm2、约200 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约300 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约400 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约500 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约600 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约50 mj/cm
2-约300 mj/cm2、约100 mj/cm
2-约300 mj/cm2或约200 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。在本文所述的所有紫外辐射实施方案(例如uvc辐照)中，灭菌使病毒失活。在该实施方案中，“使病毒失活”意指使所有病毒失活，无论是否具有感染性，减少感染性病毒的数量，或者抑制病毒的活性，无论是否具有传染性。
[0542]
在一方面，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可通过本领域已知用于纯化胶原蛋白的方法来纯化。如本文使用的“纯化”意指去除污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和内毒素。在各种实施方案中，胶原蛋白可通过去除污染物来纯化，使得其为至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%纯度。在其他实施方案中，胶原蛋白可被分离。如本文使用的“分离的”意指基本上不含污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和
内毒素。
[0543]
在一些实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可被冻干，并且然后重构以形成用于与如本文所述的缓冲溶液混合的胶原蛋白组合物。在此类实施方案中，冻干胶原蛋白的重构不是用于胶原蛋白聚合的混合步骤。如本文使用的术语“冻干的”意指通过例如真空下冷冻干燥从蛋白、化合物或组合物中去除水。可使用技术人员已知的任何冻干方法。在一些实施方案中，胶原蛋白可在酸中冻干，所述酸例如乙酸、盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸。在其他实施方案中，胶原蛋白可在水中冻干。在进一步的实施方案中，可在冻干期间使用低温保护剂或冻干保护剂或其组合。
[0544]
在一些实施方案中，冻干的胶原蛋白可以重构以形成本文所述的用于与缓冲溶液混合以使胶原蛋白聚合的胶原蛋白组合物。在一些实施方案中，胶原蛋白可在酸性溶液或水中重构。在一些实施方案中，酸性溶液可包含乙酸、盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸。在一些实施方案中，用于重构的酸性溶液可具有约.005 n-约0.1 n、约0.005 n-约0.08 n、约0.005 n-约0.06 n、约0.005 n至约0.04 n、约0.005 n-约0.02 n、约0.005 n-约0.01 n或约0.01 n的酸浓度。在一些实施方案中，酸可为盐酸，并且盐酸可为约0.005 n-约0.1 n盐酸。在其他实施方案中，酸可为盐酸，并且盐酸可为约.01 n盐酸。
[0545]
在一些实施方案中，胶原蛋白组合物或胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度可为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml、约0.1 mg/ml-约5 mg/ml或约0.5 mg/ml-约4 mg/ml。在其他实施方案中，胶原蛋白组合物或胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度可为约0.05-约5.0 mg/ml、约1.0 mg/ml-约3.0 mg/ml、约0.05 mg/ml-约10 mg/ml、约0.05-约20 mg/ml、约0.05-约30 mg/ml、约0.05-约40 mg/ml、约0.05-约50 mg/ml、约0.05-约60 mg/ml、约0.05-约80 mg/ml、约5 mg/ml-10 mg/ml、约5 mg/ml-20 mg/ml、约5 mg/ml-约40 mg/ml、约5 mg/ml-60 mg/ml、约5 mg/ml-约100 mg/ml、约20 mg/ml-约40 mg/ml、约20 mg/ml-60 mg/ml或约20 mg/ml-约100 mg/ml。
[0546]
在一些实施方案中，胶原蛋白组合物与缓冲溶液在单一步骤中混合以使胶原蛋白聚合。在其他实施方案中，使胶原蛋白组合物与缓冲溶液在不存在镁或锰离子的情况下混合以使胶原蛋白聚合。在一些实施方案中，使胶原蛋白组合物与缓冲溶液混合形成胶原蛋白溶液，并将胶原蛋白溶液在大于约25℃的温度下温育以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。在其他实施方案中，胶原蛋白溶液可在约37℃下温育以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。在一些实施方案中，胶原蛋白溶液可在约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、39℃或40℃下温育以促进胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合。在其他实施方案中，胶原蛋白溶液可在约25℃-约40℃下温育以促进胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合。在其他实施方案中，聚合可在高于20℃的温度下，或在选自约20℃-约40℃的范围的温度下进行。在此类实施方案中，胶原蛋白可聚合以形成与体内发现的那些相似的原纤维。
[0547]
在一些实施方案中，待与胶原蛋白组合物混合以形成胶原蛋白溶液的缓冲溶液可包含约.03 mm-约0.2 mm mgcl2、约.002 mm-约.02 mm mgcl2、小于约.02 mm mgcl2或不含mgcl2。在其他实施方案中，待与胶原蛋白组合物混合以形成胶原蛋白溶液的缓冲溶液可包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4、约1 mm-约10 m na2hpo4、约0.1 mm-约4 mm kcl、约.02 m-约0.3 m nacl和约.002 n-约.02 n naoh。在其他实施方案中，待与胶原蛋白组合物混合以形
成胶原蛋白溶液的缓冲溶液可包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖、约0.5重量百分比的葡萄糖或更少或者不含葡萄糖。
[0548]
在一些实施方案中，缓冲溶液可稀释自10x、5x、2x或任何合适的起始浓度，以制备具有任何前述段落中的成分浓度的1x缓冲溶液。在一些实施方案中，根据本讲授的试剂盒可含有用于稀释以制备1x缓冲溶液的、浓度为10x、5x或2x或任何合适的起始浓度的缓冲溶液。在一些实施方案中，10x缓冲溶液可包含呈以下浓度的以下成分：1.37 m nacl0.027 m kcl0.081 m na2hpo40.015 m kh2po40.1 n naoh和，任选地，55.5 mm葡萄糖。
[0549]
在其他实施方案中，1x缓冲溶液可包含呈以下浓度的以下成分：0.137 m nacl0.0027 m kcl0.0081 m na2hpo40.0015 m kh2po40.01 n naoh和，任选地，55.5 mm葡萄糖。
[0550]
在这些实施方案中，naoh存在于缓冲溶液中。在先前已知用于使胶原蛋白聚合的常规方法中，作为胶原蛋白聚合方法中的另外混合步骤单独添加naoh。在一些实施方案中，氯化钙可以约0.4 mm-约2.0 mm的浓度存在于缓冲溶液中。
[0551]
在一些实施方案中，缓冲溶液中的缓冲剂可选自磷酸盐缓冲盐水(pbs)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、哌嗪-n,n
’‑
双(2-乙磺酸) (pipes)、[n-(2-乙酰氨基)]-2-氨基乙磺酸(aces)、n-[2-羟乙基]哌嗪-n
’‑
[2-乙磺酸] (hepes)和1,3-双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷(bis-tris丙烷)。在一些实施方案中，缓冲液为pbs。
[0552]
在一些实施方案中，用于胶原蛋白聚合的胶原蛋白溶液的ph选自约5.0-约11、约6.0-约9.0、约6.5-约8.5的范围，并且在一些实施方案中，ph为约7.3-约7.4。
[0553]
在一些实施方案中，可在胶原蛋白聚合完成之前或之后或者在胶原蛋白聚合期间将以下加入到胶原蛋白溶液中：营养素，包括矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白、维生素；或促进细胞增殖的糖蛋白，比如层粘连蛋白和纤连蛋白；透明质酸；或生长因子，比如表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子β或成纤维细胞生长因子；和糖皮质激素，比如地塞米松，。在其他实施方案中，可将细胞在胶原蛋白聚合完成之前或之后或者在胶原蛋白聚合期间加入到胶原蛋白溶液中。在一些实施方案中，细胞可选自上皮细胞、内皮细胞、中胚层衍生细胞、间皮细胞、滑膜细胞、神经细胞、神经胶质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、肌腱细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多潜能祖细胞(例如干细胞，包括骨髓祖细胞、诱导性多能干细胞)、脂肪细胞、骨原细胞和来自多能干细胞的特定细胞衍生物。
[0554]
在一些实施方案中，提供根据本文所述的任何方法制备的胶原蛋白基质。在一些
实施方案中，胶原蛋白基质可为医用移植物。在一些实施方案中，医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。在其他实施方案中，本文所述的方法可被用于制备用于打印组织或器官的生物墨水配方。在其他实施方案中，胶原蛋白基质被用于研究目的，比如药物毒性测试或药物开发。在一些实施方案中，通过本文所述方法制备的基质可充当植入部位处内源性组织再生长(例如重塑)的基质，并且该基质可具有其在植入或注射部位处替换的损伤或患病组织的特征。
[0555]
在一些实施方案中，本文所述的基质可含有原纤维面积分数(被定义为基质横截面中原纤维占据的总面积的面积百分比)或原纤维体积分数(三维中原纤维占据的总面积的面积百分比)为约0.1%-约100%、约0.5%-约100%、约0.5%-约26%、约1%-约100%、约1%-约26%、约1%-约7%、约1%-约15%、约7%-约26%、约20%-约30%、约20%-约50%、约20%-约70%、约20%-约100%、约30%-约50%、约30%-约70%或约30%-约100%的原纤维，和/或约0.5 kpa-约40 kpa、约30 kpa-100 kpa、约30 kpa-约1000 kpa、约30 kpa-约10000 kpa、约30 kpa-约70000 kpa、约100 kpa-约1000 kpa、约100 kpa-约10000 kpa或约100 kpa-70000 kpa的模量(例如由使用常规力学测试方案获得的应力-应变曲线的线性区域斜率所定义的弹性或线性模量；即刚度)、压缩模量或剪切储能模量。
[0556]
在一些实施方案中，提供包含冻干的胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。在其他实施方案中，提供包含胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒。在这些试剂盒的实施方案中，缓冲溶液可包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2、约0.002 mm-约0.02 mm mgcl2、小于约0.02 mm mgcl2，或者缓冲溶液不包含mgcl2。在各种实施方案中，缓冲溶液进一步包含约0.003 m-约0.03 m kh2po4、约0.01 m-约0.1 m na2hpo4、约0.001 m-约0.04 m kcl、约0.2 m-约3.0 m nacl和约0.02 n-约0.2 n naoh。在其他实施方案中，缓冲溶液可包含约0.2重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖、约0.5重量百分比的葡萄糖或更少或者不含葡萄糖。
[0557]
在含有盐酸溶液的试剂盒的一些实施方案中，盐酸溶液可包含约0.005 n盐酸-约0.1 n盐酸。在含有冻干的胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒的实施方案中，冻干的胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液可在单独的容器中提供。在含有胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒的实施方案中，胶原蛋白组合物中的胶原蛋白的浓度可为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml或约0.1 mg/ml-约10 mg/ml。在一些实施方案中，胶原蛋白组合物的浓度在约7 mg/ml-约8 mg/ml之间。在一些实施方案中，胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。在一些实施方案中，中和后，配方产生具有一个或多个以下特征的可聚合胶原蛋白：最终胶原蛋白浓度：6.3-7.2 mg/ml；聚合时间：0.5-1.1分钟；剪切储能模量：2.7-3.5 kpa；剪切损耗模量：0.3-0.5 kpa；和/或压缩模量：5.8-9.6 kpa。在此类实施方案中，胶原蛋白组合物和缓冲溶液可在单独的容器中提供，所述容器比如灭菌小瓶或包含混合元件的双注射器单独隔室。在本文所述的任何试剂盒的实施方案中，试剂盒可进一步包含用于使用试剂盒的组件的说明。在本文所述的任何试剂盒的实施方案中，缓冲溶液可以能够使用单一混合步骤使胶原蛋白聚合，该步骤包括使缓冲溶液与在盐酸溶液中重构的冻干的胶原蛋白或与胶原蛋白组合物混合。
[0558]
在一些实施方案中，提供具有呈冻干形式的胶原蛋白的试剂盒，并且该试剂盒进一步包含如本文所述的缓冲溶液和用于重构冻干的胶原蛋白的酸溶液，所述酸比如乙酸或
另一种稀酸，包括例如盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸。
[0559]
以下实施例更详细地说明具体实施方案。提供这些实施例仅用于说明目的，并且不应解释为以任何方式限制本发明。
实施例
[0560]
实施例1-方法和材料由geniphys制备并评估了两种胶原蛋白组织填充物配方，它们在单一的专有制造步骤中有所不同；然而，由于没有观察到性能差异，因此将结果合并并作为单一配方呈现。对于两种配方，均使冻干的i型寡聚胶原蛋白溶解于0.01 n盐酸中，以获得估计为8 mg/ml的溶液(基于冻干材料的干重)。溶解之后，将溶液使用超速离心(142,400 x g)进行澄清。然后使配方1通过无菌0.2 μm膜滤器(sterlitech, kent, wa)进行过滤，并经受下述质量控制测试。在通过相同类型的膜滤器的过滤和质量控制测试之前，将配方2使用254-nm波长的准直束以500 mj/cm2紫外(uv)辐射进行给予。根据geniphys标准程序制备专有中和溶液并通过0.2
ꢀµ
m过滤器进行无菌过滤。为制备手术中使用的试剂盒，将注射器用配方1、配方2和中和溶液无菌地进行填充。所用寡聚胶原蛋白溶液与中和溶液的体积比为9:1。
[0561]
基于对分子纯度、自组装动力学和粘弹性力学特性的评价，定义胶原蛋白配方的材料特性并控制其质量。对于4个独立的胶原蛋白原型批次(n=4)，以6-8个重复(n=6-8)测量自组装动力学和粘弹性特性。为评估胶原蛋白纯度，根据已建立的方法，使用4-20%和6%凝胶(invitrogen)对胶原蛋白样品和分子量标准品(novex seeblue plus2, invitrogen, carlsbad, ca)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)并用考马斯蓝(sigma-aldrich, st. louis, mo)染色。使用天狼星红(直接红80, sigma-aldrich)测定法确定胶原蛋白浓度。进行时间依赖性振荡剪切流变测定以确定自组装动力学和剪切储能(g’)和损耗(g
’’
)模量。简言之，在具有40-mm平行板几何形状和溶剂捕集器的ar2000流变仪(ta instruments, new castle, de)上测试中和的寡聚胶原蛋白样品。在样品加载之前和测试的前2分钟期间，将珀耳帖板保持在4℃下。在此初始的2分钟以1%应变进行振荡剪切测量，并在温度升至37℃之后继续测量10分钟。在振荡剪切测试后，使样品在20
ꢀµ
m/s的应变速率下经受无侧限压缩测试。为定义基质形成的动力学，创建剪切储能模量随着时间推移的图表，并将胶原蛋白达到其最大刚度(g’)的时间定义为聚合时间。该点也被用于定义基质g’和g
’’
值。为获得压缩模量，从无侧限压缩数据创建应力-应变曲线，并在指定的低应变区域(20-40%应变)计算斜率，对应于文献中报道的关于软组织(例如人类乳房)的低应力/应变模量。测试4批独立的原型胶原蛋白，每批重复6-8次(n=4批；每批n=6-8个重复)。
[0562]
实施例2-猪模拟肿块切除模型小型猪的乳腺通常被用于测试新策略，以改善乳房手术程序(包括肿块切除术和乳房切除术)后的功能和美容结果。使用普渡动物管理和使用委员会(purdue animal care and use committee)批准的方案，对体重在45-65 kg之间的雌性尤卡坦小型猪进行模拟肿块切除术。在两项研究中总共使用8头猪，6头用于纵向研究和2头用于辐射研究。对于两个研究，乳房均被随机分配到实验组和对照组，无填充和无手术分别充当阴性和阳性对照。纵向研究的术后评价在1、4和16周的时间点(每个时间点2只动物)进行，以实现对于胶原蛋白填充物组的12个重复(n=12；对于每种胶原蛋白填充配方n=6)及对于每个无填充和无手术
组的6个重复(n = 6)。对于辐射研究，术后评价在手术后4和16周进行，对于胶原蛋白填充物组重复6次(n = 6)，对于无填充组重复3次(n = 3)，和对于无手术组重复1次(n = 1)。最尾部的一对乳腺充当未辐照的未手术对照。将来自辐照的动物的结果与来自纵向研究的非辐照动物进行比较。每个时间点的术后评价包括：乳房/手术部位的总体外观和均匀性/一致性的半定量评分、超声检查、放射检查、总体外植体评估和组织病理学分析。半定量评分和组织病理学分析两者均以盲法进行。
[0563]
将动物麻醉、插管并置于背卧位。对于每个模拟肿块切除术，使用手术刀造成3-cm的皮肤切口，切口横向取向并置于紧邻每个乳房的乳头-乳晕复合体的外侧。使用电烙术切除大约四分之一的乳腺组织，并使用标准体积移位法测量其体积。切除的正常乳腺组织的子集经受无侧限压缩测试(应变速率：1 mm/min，压缩模量在20-40%应变的线性区域中确定)以表征力学特性。将钛标记夹(ethicon small ligaclips, west cmr, clearwater, fl)置于动物子集中以促进胶原蛋白和无填充处理的手术部位的切缘识别。对于胶原蛋白填充物处理的部位，使用中和的液体胶原蛋白来填充手术空隙。阴性对照部位没有接受填充(未处理)。未经受手术的猪乳房子集充当阳性对照。使用可吸收缝线闭合所有手术部位，并用非粘附垫(mckesson, san francisco, ca)和tegaderm (3m, st. paul, mn)敷料绷扎。每天基于食欲、态度、运动和排泄情况监测动物的健康状况。
[0564]
实施例3-辅助性肿块切除术后辐射为解决放射治疗如何影响对胶原蛋白组织填充物的组织反应的问题，将两只动物在模拟肿块切除术和治疗后用放疗处理。猪乳房被再次随机分配到治疗组，无填充治疗和其上没有进行手术的乳房分别充当阴性和阳性对照。手术后两周，使用基于ct的3d-crt技术，使用具有120叶多叶准直器的6 mv varian ex临床直线加速器(varian, palo alto, california)在连续5天时段中向近颅侧的5对乳腺输送20 gy的总剂量。近尾部的一对乳腺作为非辐照的对照排除在外。
[0565]
实施例4-术后程序和评价在指定时间点，将动物麻醉，并使用半定量评分系统评估每个乳房的总体乳房/手术部位外观，包括红斑/焦痂形成和水肿形成以及乳房均匀性/一致性评分，如图10中所示。另外，用mindray m7超声仪(mindray north america, mahwah, nj)和线性4-7 mhz换能器对每个乳腺进行超声成像。安乐死后，对每个乳房进行乳房切除术，保持所有手术部位、任何植入物和周围组织。进行组织病理学分析前，将每个乳房置于10%缓冲福尔马林中，并使用innovet select radiograph装置(summit, niles, il)进行射线拍照，所述装置具有使用genesis vxvue采集软件(genesis digital imaging, los angeles, ca)的安装的genesis vet dr板。
[0566]
实施例5-组织病理学在石蜡包埋和切片之前，将福尔马林固定的外植组织一分为二并成像。将切片用苏木精-伊红(h&e)染色。为检测上皮细胞，将切片以1:100的稀释度对广谱细胞角蛋白(ab9377, abcam, cambridge, ma)进行染色并然后以6 g/ml用二级dylight 488山羊抗兔(di-1488, vector labs, burlingame, ca)处理。将细胞核用dapi (4’,6-二脒基-2
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苯基吲哚,二盐酸盐; en62248, pierce biotechnology, rockford, il)进行复染。使用aperio versa 8全玻片扫描仪(leica biosystems, buffalo grove, il)获得图像。
[0567]
实施例6-液体胶原蛋白符合几何形状并转变为具有类似于软组织特性的稳定的纤维状基质评估了专门设计以充当用于损伤或缺损性组织(比如通过bcs创建的组织空隙)的恢复性和再生性填充物的胶原蛋白组织填充物配方。胶原蛋白组织填充物配方的定义基于其材料组成上和力学上的特性，包括分子纯度、胶原蛋白含量、聚合(自组装)时间以及在经受振荡剪切和无侧限压缩加载时的粘弹性特性。为评估组织填充物的生物相容性和有效性，由受过专门培训的乳腺外科医生对猪的乳房(乳腺)进行模拟肿块切除术。然后使用原型配方填充一部分乳房空隙，并将手术结果与未处理的缺损(无填充；阴性对照)进行比较，后者代表bcs的护理标准。其上未进行手术的正常乳房充当阳性对照。为定义组织反应时间线并了解组织填充物的作用机制(组织植入反应)，在1、4和16周的时间点进行了纵向研究。在1周的时间点，使用少量部位来确定材料是否影响或干扰手术再切除程序。然后进行第二项研究，以评价组织填充物及其相关组织反应如何受到辐照的影响，辐照通常被用作术后疗法以预防局部癌症复发。结果测量包括对所有乳房和手术部位的目视检查和触诊，以及对红斑、焦痂、水肿和乳房均匀性/一致性的半定量评价。另外，使用超声检查和放射检查对整个乳房进行成像。最后，在安乐死后，收集乳房外植体进行总体和组织学分析。综合起来，这些数据为在保乳手术期间使用组织填充物后改善愈合结果提供支持。
[0568]
自geniphys (zionsville, indiana)作为试剂盒获得胶原组织蛋白填充配方。如图1a所示，该试剂盒包括含有在稀酸(0.01 n盐酸)中的无菌i型寡聚胶原蛋白的注射器、含有无菌中和溶液(缓冲液)的注射器、无菌鲁尔锁适配器和无菌施药器尖端。这些试剂盒的寡聚胶原蛋白成分根据astm f3089-14的可聚合胶原蛋白指南从封闭式猪群的皮制造并进行质量控制。在紧接使用之前，将两个注射器与鲁尔锁适配器(图1b)连接，并且胶原蛋白和中和试剂以 9:1的比率混合，使胶原蛋白溶液达到生理ph和离子强度。混合之后，粘性液体可被注射到各种几何形状中，在所述几何形状中粘性液体在转变成物理稳定的纤维状胶原蛋白基质之前符合该形状(图1b)。为证明胶原蛋白纯度，使用4-20%和6%凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。凝胶揭示了寡聚胶原的蛋白条带模式特征为没有可检测到的污染非胶原性蛋白或其他类型的胶原蛋白(图1c)。测量其他功能性能参数，包括中和胶原蛋白组织填充物溶液的聚合时间和由组织填充物形成的基质的粘弹性特性，概述提供于图1d中。具体地讲，中和之前寡聚胶原蛋白的浓度为约7.7 mg/ml。中和后，基质形成反应平均仅花费不到1分钟，如在37℃下流变测量的。当在振荡剪切和无侧限压缩中分析时，所形成的基质表现出固体样行为，剪切储能(g)和损耗(g”)模量分别为3.16
±
0.16 kpa和0.40
±
0.02 kpa，和压缩模量为7.67
±
0.42 kpa。尽管可使用寡聚胶原蛋白以创建广泛种类的具有组成上和力学上的特性(即弹性模量和强度值)的可调谐组合的聚合物材料，但此处开发和测试的特定组织填充物配方被设计为具有材料特性的特定组合，以表现出类似于软组织的粘弹性力学特性。
[0569]
实施例7-胶原蛋白组织填充物基质保持体积并诱导血管化和乳房组织形成而不引起一般在愈合期间观察到的炎症反应或一般对组织植入反应观察到的异物反应。
[0570]
为评估组织填充物改善软组织缺损的外观、结构和功能恢复的有效性，进行了纵向研究，涉及对正常、健康的尤卡坦小型猪的乳房进行模拟乳房切除程序(图2)。雌性小型猪基于其大小以及与人类的解剖学和生理学相似性而代表用于此类转化研究的优选大型
动物模型。另外，猪通常具有12个乳腺(乳房)，这减少了该研究所需的动物总数，因为每个乳房均可充当实验或对照组。手术之前，猪乳房被随机分配到治疗组，其中无填充和没有接受手术的乳房分别充当阴性和阳性对照。所有手术程序和乳房评估均由受过专门培训的乳腺外科医生进行。切除大约四分之一的乳房组织体积(图2e)，其范围为2-5.5 ml的组织(平均~3 ml)，具体取决于单个乳房大小(图2a)。对于组织填充物处理的乳房，将液体胶原蛋白混合并立即注射到组织空隙中，在所述空隙中液体胶原蛋白符合复杂的几何形状，随后在这些情况下于不到5分钟内转变为纤维状胶原蛋白基质(图2b-d)。乳腺外科医生在填充每个缺损时运用她的判断力，所应用的胶原蛋白体积随着缺损大小和几何形状而变化。手术空隙用至少与移除组织相同体积的胶原蛋白进行填充，其中大多数接受1-2 ml更多的胶原蛋白体积。阴性对照部位未进行处理(无填充)，这与bcs程序的护理标准一致。所有切口均使用可吸收缝线闭合并绷扎(图2f)。在整个研究期间，所有动物均保持体重(
±
5 kg)，手术部位保持闭合，并且未发生有关程序的并发症(图2g)。
[0571]
与在女性和男性中观察到的情况一致，发现在单个动物内和单个动物之间两者中，猪乳房在体积、一致性和组成方面均有所不同。在微观水平上(图9)，乳腺包括多个叶，这些叶由组织为簇的较小的分泌小叶和最终经乳头离开皮肤的导管系统(通道)组成。小叶和导管由主要由纤维i型胶原组成的小叶内基质支撑。另外，在叶之间发现了胶原结缔组织(小叶间基质)，为乳房提供支撑并确定其形状。主要决定乳房大小的脂肪组织填充腺体和纤维结缔组织之间的空间。当在无侧限压缩中进行评估时，位于近颅侧(朝向头部)的乳房相对僵硬，平均压缩模量为19.0
±
12.9 kpa。随着向尾部(朝向尾部)进展，乳房的脂肪组成增加并且更柔软，大多数近尾部乳房的平均压缩模量为6.56
±
2.51 kpa。
[0572]
为评价胶原蛋白填充物的生物相容性和组织反应，在指定的1、4和16周时间点麻醉动物。根据图10中的标准，所有乳房进行目视检查、触诊和半定量评分。胶原蛋白处理的乳房和无填充对照乳房在任何时间点均未显示出红斑(发红)或焦痂(脱落、死亡组织)的迹象。其上进行手术的乳房在1周时有明显的轻度水肿；然而，胶原蛋白和无填充组两者的肿胀程度相似，并且之后不久消退。在所有3个时间点，胶原蛋白处理的乳房的均匀性/一致性评分均与无填充对照相似，从1周时的大约1.2下降至16周时的0.25 (图3a)。此类发现是重要的，因为其表明胶原蛋白填充物不会创建可在临床上被解释为残留疾病或患者不适来源的乳房不一致。所有正常乳房均收到零的评分。另外，当乳腺外科医生对胶原蛋白处理的乳房进行模拟手术再切除时，填充材料不会影响或干扰程序。
[0573]
胶原蛋白填充物的生物相容性和组织反应基于乳房外植体横切面的总体和组织学检查进一步确定，并与无填充和正常乳房对照进行比较。从这些分析中，显然胶原蛋白填充物保持其体积(最小化缺损收缩)，具有高度生物相容性，并且在不存在一般见于未治疗的组织空隙愈合的炎症反应或一般对组织植入反应观察到的异物反应的情况下表现出组织反应。随着细胞浸润组织填充物基质并产生新的乳房组织，其呈现出难以从周围正常组织中大体辨别的组织样外观(图3b)。在这种情况下，手术夹可用作初始缺损切缘的标记(图3b、4)。在第1周的组织学分析时，胶原蛋白填充物在组织空隙内很明显，在所述组织空隙中其呈现为均匀的浅粉色(嗜酸性)染色材料(图4)。填充物周围通常为出血带、纤维蛋白和少量白细胞，这可归因于组织的手术操作(图4a)。在填充物-宿主组织界面处，有局灶性大面积的增殖性成纤维细胞(间充质细胞)，很少有小口径血管浸润基质边缘。周围的乳房组织
看起来基本正常，邻近手术部位具有重塑区域。这些区域含有重塑上皮细胞的聚集体，其中一些似乎为小管，而另一些则形状更不规则，提示有发育不全的小叶(图4a)。值得注意的是，没有作为常规可植入材料的特征的炎症介导的异物反应或活跃生物降解的迹象。在4周时间点时，成纤维细胞与新形成的脉管系统一起延伸到胶原蛋白填充基质的更深部分中，浸润细胞在外围最丰富并向中心进一步减少(图4a)。观察到上皮细胞的多灶性聚集体，这再次与腺体结构的前体一致(图4a)。到16周时，基质完全细胞化，呈现为成熟、重塑的胶原纤维和束，一些部位显示出小的可辨别的无细胞嗜酸性填充材料区域。小口径血管在整个基质中弥散存在且均匀分布(图4a)。在血管化的胶原蛋白基质内，存在对细胞角蛋白染色呈阳性的新形成的小叶和导管，以及脂肪组织，尤其是在外围处(图11a、b、4a)。腺体形态发育良好且成熟，无明显病理学。
[0574]
相比之下，在1周时，血肿形成在无填充乳房外植体的总体和组织学评估两者时均很明显(图3b、4b)。出血、纤维蛋白凝块和白细胞(包括中性粒细胞和巨噬细胞)在肿块切除部位内明显。出血区域内混杂着增殖性成纤维细胞和很少的小口径血管，与修复性伤口愈合相关的维管瘢痕组织一致。在缺损区域周围还有明显的具有活跃炎症的散在坏死区域。到4周时，这些组织缺损收缩，如大体上明显的夹移位和组织学上呈星状的收缩的外观所证明的(图4b)。维管瘢痕组织在缺损区域内显著，在整个缺损边界中和其附近注意到多个小的坏死和炎症区域(图4b)。在缺损周围的组织区域中观察到腺体和脂肪组织的活跃重塑(图4b)。到16周时，纤维瘢痕组织的密度增加，呈现为由肌成纤维细胞密集组成的平行排列的纤维组织的不同取向的漩涡。尽管在缺损周围鉴定了小叶、导管和脂肪组织，但在瘢痕组织周围发现了多个具有发育不良的形态学特征的坏死腺体，如通过炎症介质的存在和残留的低水平弥散性细胞角蛋白染色所证明的(图4b、11c、11d)。
[0575]
实施例8-组织填充物基质不会影响对声谱图和射线照片的解读乳腺摄影检查和超声检查通常被用作bcs的后续诊断程序，以监测癌症复发情况。为确保胶原蛋白填充物不会影响或干扰图像解读，在安乐死之前对所有猪乳房进行超声，并在乳房切除术后对每个个体的整个乳房拍摄射线照片。在16周研究期间获得的声谱图显示，组织填充物基质不会模糊或阻止对乳房组织的询查，也不会产生任何意外的回声区域(图5a)。在1周时，在胶原蛋白处理的乳房内观察到一个大的、形状不规则的低回声区域，含有不同程度的不均匀回声(图5a)。此类信号并不令人意外，因为填充物微观结构代表随机取向的胶原蛋白原纤维网状结构，测量到直径为约400 μm。尽管这些区域似乎随着时间的推移保持其体积，但它们逐渐呈现出正常组织的外观，这确证了在总体外植体内和组织学上观察到的细胞化和血管化(图5a)。无填充处理的空隙在1周时也显示出与血清肿和出血一致的不规则形状的低回声区域(图5a)。到4周和16周时间点，这些区域的大小减小，产生与收缩和瘢痕形成一致的不均匀信号(图5a)。
[0576]
组织填充物基质也不干扰射线照片的解读，而是在整个研究期间显示出与正常组织一致的不透明度(图5b)。另外，射线照片提供胶原蛋白基质随着时间的推移保持空隙体积且夹移位有限的进一步证据(图5b)。大多数未处理(无填充)的手术空隙在1周时也产生似乎与正常组织一致的射线照片，少数部位显示与气囊、血清肿或血肿一致的明显变暗区域(图5b)。在4周和16周时间点观察到的手术夹的进行性移位提供了随着时间推移的缺损收缩和瘢痕形成的进一步证据(图5b)。
[0577]
实施例9-辐照并不对胶原蛋白填充物或组织植入反应产生不利影响为确定胶原蛋白填充物是否与放射治疗相容，一队动物在模拟肿块切除程序后两周经受腹侧辐照。为每只动物产生基于计算机断层扫描(ct)的三维适形治疗(3d-crt)计划，以使用来自varian ex临床直线加速器的6 mv x-射线在连续5天时段中向近颅侧的5对乳腺输送20 gy的总剂量。近尾部的一对乳腺作为非辐照的对照排除在外。经辐照的动物随着时间的推移显示出皮肤色素沉着增加，如通过皮肤颜色变暗所证明的(图2g)，这在经历治疗性辐照的人类也是可预期的。在微观水平上，表皮的中度增生或增厚明显，其中黑色素沉积增加，尤其是在基底表皮内(图9)。在16周时，乳房组织明显更僵硬，这也是对放射治疗观察到的常见变化。另外，脂肪坏死及导管和腺体非典型增生的迹象明显(图9)。
[0578]
除皮肤色素沉着的差异外，所有的乳房和手术部位均愈合良好，看起来与非辐照动物的那些相似。在相应的时间点，相对于非辐照动物，胶原蛋白填充物处理组和无填充组的平均乳房均匀性/一致性评分在辐照动物中稍微更高，唯一的例外为16周胶原蛋白填充物处理组，其中评分相似(图6a、3a)。对总体外植体和组织学横截面的检查显示，辐照对组织填充物基质或其相关组织反应没有明显的不利影响；然而，主观上，辐照部位的总体愈合时间线似乎略有延迟(图6b、6c)。在为期16周的研究期间，胶原蛋白填充物在手术部位内持续存在，支持从填充物-宿主组织界面向内进行的进行性细胞化、血管化和乳房组织生成。如所预期的，无填充组显示出收缩和纤维瘢痕组织的发展(图6b、6d)。辐照和非辐照动物的声谱图(图7a)和射线照片(图7b)非常相似，再次证实胶原蛋白填充物没有受到辐照的负面影响并且没有产生任何可疑的成像异常。
[0579]
实施例10-结果讨论在目前的工作中，猪乳房的大小和组织组成各不相同，从而产生在质量和数量两者上均很明显的一致性差异。所测量的压缩模量范围(约6-19 kpa)包括在女性中观察到的乳房一致性，据报道其范围为0.7-66 kpa，具体取决于乳房组成(例如纤维腺体相对于脂肪)和测试参数(例如应变速率、预处理)。未经处理的乳房缺损的愈合反应与在bcs后的女性中观察到的相似，产生的瘢痕组织在结构和功能上与正常乳房组织不同。16周的纵向研究显示出在整个导致瘢痕形成的修复性伤口愈合的经典重叠阶段中的进展，包括止血和炎症、增殖和重塑，如图8a中所示。，机械强度相较于正常乳房ecm较弱的初始纤维蛋白凝块和临时基质促进缺损的显著收缩，如通过夹移位和星状瘢痕组织形态所证明的。随着时间推移的瘢痕形成和重塑过程可能为bcs最不可预测和令人不安的方面，因为已知其会促进疼痛、乳房轮廓和一致性扭曲以及感觉丧失，所有这些均会对女性在情感和心理上产生负面影响。
[0580]
用长效纤维状胶原蛋白基质填充缺损体积，该基质自然代谢和重塑而不是活跃降解，导致其中免疫介质基本上不存在的愈合反应，并且结果更具再生性而不是修复性(图8b)。基于这些结果，在图8b中描绘所提出的胶原蛋白填充物的再生性愈合反应。由于可注射的原位形成基质填充并符合缺损且与周围宿主组织有效整合，因此其重建跨组织的结构和力学连续体，已知这对于无瘢痕愈合和组织形态发生是重要的。值得注意的是，胶原蛋白填充物的压缩模量(7.67
±
0.42 kpa)落入猪和人类两者的乳房力学特性的范围内。胶原蛋白填充物的致密微观结构和压缩特性有效地抵抗由周围正常组织以及浸润细胞所施加的收缩力。另外，由于基质的力学特性与软组织相似，因此其不会产生任何令人担忧的可触知
的乳房不一致。从转化的角度来看，这对于患者的满意度和舒适度以及对于保持通过触诊检测复发性癌症的能力是重要的。
[0581]
因为由组织填充物形成的胶原蛋白原纤维含有多个功能性细胞和分子结合结构域，所以基质可有效地参与生化和力学化学信号传导两者，正如组织ecm所进行的那样。与常规可植入材料不同，基质最初由成纤维细胞样间充质细胞以及血管形成细胞而不是炎症介质填入。快速和稳健的新血管化反应与其他体内研究一致，其中寡聚体已被植入到其他微环境中并被用于体外研究血管形成的潜在机制。当这些前线细胞随着时间向基质中心更深入地推进，组织新生随之而来，伴随形成脂肪组织和乳腺，包括分泌小叶和导管。有趣的是，新形成的小叶在4和16周的时间点尤为明显，让人想起在未产(孕前)乳房中发现的那些，因为它们非常缺乏巨噬细胞浸润。总的来说，对胶原蛋白填充观察到的再生性组织反应与同组织发育和形态发生(包括乳腺)相关的过程有许多相似性，突出了保持基质胶原蛋白及其相关的力学生物学连续体的重要性。
[0582]
作为该项研究的一部分，还证明了胶原蛋白填充物不会受到放射治疗的负面影响，并且不会影响诊断成像程序的解读。在本研究中，在模拟肿块切除术后2周应用辐照，这处于bcs后的辅助放疗施用范围内。具有快速细胞更新的肿瘤和组织，比如皮肤的表皮层，对辐照效应最敏感，其损伤程度取决于总辐射剂量和输送辐射的时间。辐照导致皮肤色素沉着过度，这是类似于人类显示的晒伤或晒黑反应的预期副作用，以及中等水平的脂肪坏死及腺体和导管增生。对于胶原蛋白填充物组和无填充处理组两者，愈合进展与相应的非辐照组类似；然而，基于乳房一致性评分和组织病理学分析，愈合速率似乎稍慢。此类结果并不令人意外，因为已知辐照会导致伤口愈合延迟。基于联合的组织病理学、x-射线和超声分析，确定胶原蛋白填充物及其相关的信号传导能力基本上不受辐照的影响。射线照片和超声波图还表明，胶原蛋白填充物没有产生可疑的伪影。这已为脂肪移植的主要缺点，其中经这些诊断成像技术已检测到乳房组织的广谱的变化，从看起来良性的脂质囊肿到疑似为恶性的发现，比如微钙化、局灶性肿块和推测不透明度增加的区域。
[0583]
鉴于该项工作代表早期的原理验证评估，这些研究并非没有限制。首先，由于猪和人类之间的乳房大小不同，进行象限切除术，移除大约25%的猪乳房体积。缺损体积范围为2-5.5 ml，平均缺损体积为约3 ml。尽管很少(如果有的话)对女性进行象限切除术，但这些绝对缺损体积落入人类临床程序的范围内。具体地讲，已公开的人类临床报告表明，67%和82%的乳腺肿瘤直径(体积)分别为≤1.9 cm (≤3.6 ml)和2.9 cm (≤12.8 ml)。尽管需要另外的研究来确定缺损大小如何影响材料性能，但基于观察到的材料作用模式和组织植入反应，预计不会产生有害结果。然而，预计完成细胞化和愈合的时间将直接随缺损体积而变化。其次，由于评估的最长时间点为16周，因此需要另外的动物和人类临床研究来确定长期(即6个月或更长时间)的胶原蛋白填充物结果。这些大型动物研究的第三个限制为猪没有癌症。由于该项大型动物研究中使用的猪不患有癌症，因此无法充分评估胶原蛋白填充物对肿瘤促进和复发的影响。由于多种原因，预计胶原蛋白填充物不会对肿瘤学安全性造成风险。首先，由于乳腺外科医生将能够更可预测地保持乳房轮廓和一致性，因此他们将更具有有关于切除更多组织以实现负切缘的信心。另外，本发明人已经显示，胶原蛋白填充物不诱导炎症或异物反应，这尤其重要，因为与炎症相关的巨噬细胞浸润和其他过程(例如细胞因子释放)已牵涉肿瘤促进。另外，当在体外用各种癌细胞类型测试时，发现寡聚胶原蛋白
基质的高原纤维密度/刚度可限制肿瘤细胞的增殖和迁移。最后，为进一步对抗肿瘤复发，可易于将化学治疗或其他抗癌剂添加到基质形成反应中，以实现靶向和局部递送。这将大幅减少施用的药物量并最小化与全身施用相关的副作用。
[0584]
总而言之，描述了原位形成并由胶原蛋白聚合物形成的恢复性和再生性组织填充物，其似乎满足外科医生的需求并克服与常规可植入材料相关的主要限制。这是关于持续存在、保持其体积并诱导进行性乳房组织(包括乳腺、导管和脂肪组织)生成的乳房填充物的第一份报告。另外，研究的发现对再生医学具有重要意义，表明炎症减少以及胶原蛋白结构和力学连续体的维持使愈合平衡从修复(瘢痕形成)转向再生。这项工作为未来的临床前和临床研究奠定基础，在所述研究中可进一步验证这种组织填充物的转化潜力，用于bcs及其他组织恢复和重建需求。
[0585]
实施例11-骨骼肌恢复和再生将尤卡坦小型猪置于全身麻醉下。如图12中所示，在背颈部的骨骼肌和脂肪区域内创建缺损(约2 cm x 2 cm)。组织空隙用符合空隙几何形状的液体胶原蛋白填充物进行填充。在应用之后约1分钟内，液体胶原蛋白原位自组装(聚合)，形成纤维状胶原蛋白基质，其恢复组织连续性和形态。然后缝合闭合该部位。在创建组织缺损后11周，收获缺损部位以及周围正常组织，并将其置于10%缓冲福尔马林中。将福尔马林固定的外植组织一分为二，包埋于石蜡中并切片。将切片用苏木精-伊红(h&e)和马森三色染色法进行染色。图13显示植入后11周胶原蛋白基质内新形成的骨骼肌和脂肪(adipose) (脂肪(fat))组织。在图13中，c表示胶原蛋白基质，f表示脂肪，m表示骨骼肌，和箭头表示相关的微脉管系统。
[0586]
实施例12-组织填充物试剂盒和相关的性能特征组织填充物包含源于猪真皮的寡聚胶原蛋白和中和缓冲液。在一些实施方案中，这种原位形成胶原蛋白装置可作为含有以下的一次性使用试剂盒提供，如图14中所示：含有在稀(0.01 n)盐酸中的胶原蛋白溶液(10 ml)的无菌玻璃小瓶、含有中和缓冲液(自组装试剂；2 ml)的无菌玻璃小瓶、两个无菌10-ml注射器、两个无菌无针小瓶适配器、无菌鲁尔锁连接器和无菌施药器尖端。在其他实施方案中，可提供具有静态混合尖端的预填充双管注射器。这种双管产品形式可被用于支持在施用期间混合胶原蛋白溶液和中和缓冲液。
[0587]
表1提供中和缓冲液成分及其在使胶原蛋白溶液达到生理ph、离子强度和渗透压以诱导基质形成反应中的作用的概述。
[0588]
表1. 中和缓冲液(自组装试剂)成分的概述。
[0589]
如表1所示，中和缓冲液代表10x磷酸盐缓冲盐水，当与胶原蛋白溶液混合时，使胶原蛋白溶液达到生理条件，包括ph、渗透压和离子强度。在使用无针小瓶适配器在一个注射器中吸取9 ml胶原蛋白溶液并在另一个注射器中吸取1 ml中和缓冲液之后，用户将两个注射器用鲁尔锁连接器连接起来，并彻底混合两种试剂。混合之后，可注射中和的胶原蛋白溶液以填充和适应组织空隙和缺损，包括难以接近和/或形状不规则的那些。应用后，胶原蛋白经历经分子自组装的原位基质形成反应。组织填充物装置通过提供适合于细胞化和血管化的固体纤维状胶原蛋白基质(图15a)实现其预期用途，保持用于组织恢复的支持性环境。在一些实施方案中，中和缓冲剂成分包括葡萄糖，如表1中所示。在其他实施方案中，中和缓冲液成分不含葡萄糖。
[0590]
表2概述根据本讲授的中和缓冲液(自组装试剂)成分的技术和性能特征。
[0591]
上述详述和附图已通过解释和说明的方式提供，并且并不预期限制所附权利要求的范围。本文所示的目前优选的实施方案的许多变化对于本领域的普通技术人员为显而易见的，并且仍处于所附权利要求及其等效物的范围内。
[0592]
应当理解，所附权利要求中叙述的元件和特征可以不同方式组合以产生同样落入
本发明范围内的新权利要求。因此，鉴于以下所附的从属权利要求仅从属于单个独立或从属权利要求，应当理解，可备选地使这些从属权利要求从属于来自任何前述权利要求(无论独立权利要求还是从属权利要求)的备选方案，并且此类新的组合应被理解为形成本说明书的一部分。
1.相关申请本技术要求2020年1月27日递交的美国临时申请号62/966,398和2020年4月27日递交的美国临时申请号63/015,946的权益。这两份文件的全部内容均通过参考结合至本文中，除非在来自本说明书的任何公开或定义不一致的情况下，否则应视为以本文的公开或定义为主。
技术领域
2.本讲授总体上涉及以用于恢复和再生组织的组织填充物治疗组织空隙和缺损的方法，以及涉及因此的组合物和试剂盒。
3.背景乳腺癌为女性中最常诊断出的癌症，全世界每年有超过200万新病例，且仅在美国每年就有约330,000例。据估计，这些病例中有60-70% (全球~130万)接受保乳手术(bcs；也称为肿块切除术)，这代表早期乳腺癌的护理标准。常规bcs涉及通过一个小的、位置美观的切口移除肿瘤以及健康组织的无癌切缘(阴性切缘)。对于符合条件的患者，伴随辅助放疗的bcs优于全乳房切除术(即移除整个乳房)，因为其在保留患者乳房的同时产生同等生存率并减少手术时间、恢复时间和并发症。由于乳腺癌的生存率相对较高(~90%)，因此长期预后和生存对于这种疾病的治疗尤其重要。特别是对于bcs，在一次手术中完全移除癌组织(获得阴性切缘)和保持乳房形状、外观和一致性(即令人愉的乳房美容)对于实现令人满意的预后和患者生活质量至关重要。
4.bcs的主要挑战之一为切除足够的组织以去除所有癌症，同时保持可接受的美容效果。bcs的标准实践指南涉及在肿瘤切除术后“尽可能美观地闭合层中的切除(手术)缺损”。随后复杂的手术伤口愈合，留下的组织空隙充满浆液和/或血液，最初形成血清肿或血肿，然后是瘢痕形成和收缩。对于外科医生来说，预测bcs的美容效果即使不是不可能的，也极具挑战性，尤其是鉴于患者在乳腺肿瘤大小、形状和位置方面的显著差异，以及组织修复过程的不可预测性，这由于辅助放射治疗的效果而加剧。正因为如此，与bcs相关的乳房畸形水平仍然相对较高，大约三分之一的女性经历了不令人满意的美容(例如凹痕、扭曲和乳房之间的不对称)。此类结果最终已表明会降低乳腺癌幸存者的总体生活质量，伴有由于瘢痕形成和收缩所致的乳房疼痛和不适增加，抑郁、不安全和焦虑的感觉，以及对自尊、身体形象和亲密性的负面影响。进一步地，bcs对二次手术程序(例如对遗留肿瘤的再切除和修整/重建程序以修复凹陷/畸形)的需求仍然较高，估计在20-40%的范围内。这包括由于阳性切缘所致的再切除以及修复乳房畸形的修整和重建程序。总而言之，由于这些不良结果和并发症，估计初始bcs之后的重复手术每次另外程序平均增加$16,000或更多的医疗保健成本。基于这些挑战和担忧，bcs可能不是所有女性的选择，尤其是具有与乳房大小相比较较大的肿瘤(直径》5 cm；肿瘤:乳房体积百分比大于1.5%)的那些或处于乳房较低象限内的那些。因此，乳腺外科医生需要新的治疗选项来进一步优化bcs的肿瘤学和美容结果，使得他们可自信地将这种保守疗法扩展至更多具有合乎期望的结果的患者。
5.目前，没有额外的组织产品使得外科医生能够可预测地恢复、重建或再生组织，比如乳房。此外，很明显外科医生正在积极地寻找解决这一问题的方案。具体地讲，许多外科医生已经尝试使用被称为biozorb的相对新的三维螺旋形瘤床生物可吸收标志物，其主要预期标记手术腔或肿块切除术缺损，以进行有针对性的术后辅助放射治疗。乳腺外科医生已经应用这种可植入装置，希望其不仅可充当标志物，而且可填充组织空隙并改善美容效果。然而，外科医生和患者两者均对biozorb不满意，尤其是因为其产生坚硬、可触知的植入物持续长达2.8年，并增加患者的疼痛和不适。另外，外科医生已表示，其相对于其他放疗标志物而言为昂贵的，并且不会显著改善结果。
6.另一方面，存在两种实验性手术重建选择，即自体脂肪移植(也称为脂肪填充或脂肪转移)和肿瘤整形手术，其旨在改善bcs美容效果并潜在地扩大符合bcs条件的患者群体。脂肪移植包括经吸脂从身体的一个区域收获脂肪(脂肪组织)，并将经最低限度处理的脂肪组织重新注射到另一个区域(例如组织空隙)。最初，脂肪移植被用于延迟的乳房重建程序，但是最近，其已被研究用于在bcs后立即使用。这种方法的问题包括快速重吸收导致体积显著减少(在25%-80%的范围内)、脂肪坏死、积油囊肿形成、微钙化以及围绕肿瘤学安全性的问题(即癌症复发)。另一方面，肿瘤整形手术结合外科肿瘤学和整形外科的技术以在肿块切除术时进行乳房重建。肿瘤整形程序包括体积移位(剩余健康乳房组织的重新排列)和体积替换(用各种自体组织瓣重建)技术两者。尽管两种手术重建程序均提供使用患者自身组织的优势并已得见一些成功，但它们需要专业培训，通常需要多名外科医生参与以及更长的手术程序，从而限制它们的可用性并增加成本。目前，这些技术尚未得到广泛采用，因为专业培训是必要的，并且仍然担忧为改善美容而牺牲肿瘤学安全性和有效性。
7.概述根据本讲授，描述了可在转变为具有组织一致性的纤维状胶原蛋白基质之前作为液体应用于任何类型的组织空隙或缺损的恢复性和再生性组织填充物，所述组织空隙或缺损包括但不限于由手术伤口导致的组织空隙(例如包括但不限于源于bcs的手术伤口)、物理缺损(例如瘢痕、凹陷、先天性缺损等)、损伤、疾病进展和/或类似情况。
8.如本文所述，本发明人已开发了可流动的组织填充物，其包含可原位聚合寡聚胶原蛋白和中和(自组装)缓冲液。在液体胶原蛋白和中和缓冲液混合之后，中和的胶原蛋白溶液可被用于填充组织空隙(例如手术伤口)或缺损，包括深的和/或难以接近的那些以及形状不规则的组织空隙。应用后，应用的溶液经分子自组装经历快速(在体温下~1分钟)原纤维形成。所得的组织填充物基质随着时间的推移恢复和保持组织形状和组织一致性，并引发组织植入反应，其特征在于细胞化、血管化和新组织形成而不引起一般对伤口愈合观察到的炎症反应或一般对常规组织植入反应观察到的异物反应。
9.在一些实施方案中，根据本讲授的组织填充物可提供以下优势中的一种或多种：(1) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有瘢痕组织形成；(2) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有缺损收缩；(3) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有炎症介质或炎症反应；(4) 与天然组织相似的组织一致性(例如与天然组织相似的压缩模量或压缩模量范围)；(5) 用脂肪组织、乳腺组织等恢复和生成乳房组织；(6) 骨骼肌的恢复和生成；(7) 不干扰包括再切除、超声检查或放射检查在内的常规临床程序的组织植入反应；和/或(8) 较少(即相对于常规程序)或不受辅助放疗负面影响的组织植入反应(例如减少或没有脂质囊
肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域，其中任何一个均可干扰成像)。
10.在一些实施方案中，根据本讲授用于填充组织空隙或缺损的方法包括(a) 将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中，和(b) 使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
11.在一些实施方案中，根据本讲授用于填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
12.在一些实施方案中，用于填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液与中和溶液的比率为约9:1。
13.在其他实施方案中，提供根据任何上述方法制备的胶原蛋白基质。在进一步的实施方案中，提供含有胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒。在进一步的实施方案中，提供含有冻干的i型寡聚胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。在进一步的实施方案中，提供可允许与胶原蛋白基质一起的一种或多种治疗剂，包括但不限于化学治疗剂、抗炎剂、抗生素剂、镇痛剂和/或类似物质，及其组合，使得一种或多种治疗剂被配置用于在组织空隙或缺损部位处的基质内的递送。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂被配置用于在组织空隙或缺损部位处的基质内的局部递送。
14.本讲授的另外特征和优势可通过在任何以下列举的条款中阐述的实施方案进行描述。应当理解，本文描述的任何实施方案可与本文描述的任何其他实施方案结合使用，至这些实施方案不相互矛盾的程度。因此，还考虑以下列举的条款的任何适用的组合。
15.1. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
16.2. 条款1的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合寡聚胶原蛋白。
17.3. 任何前述条款的方法，其中可原位聚合寡聚胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
18.4. 任何前述条款的方法，其中至少一部分胶原蛋白分子通过一个或多个分子间交联共价键合。
19.5. 任何前述条款的方法，其中患者为哺乳动物。
20.6. 任何前述条款的方法，其中患者为人类。
21.7. 任何前述条款的方法，其中引入为在无菌条件下实现的。
22.8. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合胶原蛋白，和其中保形基质包含胶原蛋白-原纤维基质。
23.9. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含液体i型胶原蛋白。
24.10. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
25.11. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原
蛋白和酸的溶液。
26.12. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
27.13. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中该溶液进一步包含缓冲溶液。
28.14. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
29.15. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
30.16. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，其中溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
31.17. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清。
32.18. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
33.19. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
34.20. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
35.21. 任何前述条款的方法，其中引入包括经注射器将自组装生物聚合物注射到组织空隙或缺损中。
36.22. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过肿块切除程序生成。
37.23. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过乳房切除程序生成。
38.24. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
39.25. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
40.26. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
41.27. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
42.28. 任何前述条款的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
43.29. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
44.30. 条款29的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
45.31. 条款29或条款30的方法，其中酸包含0.01 n盐酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
46.32. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸；其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml；和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
47.33. 条款32的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液已经使用超速离心进行澄清，通过无菌膜滤器进行过滤，用紫外辐射进行给予，或其组合。
48.34. 条款32-33中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
49.35. 条款32-34中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
50.36. 条款32-35中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
51.37. 条款32-36中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
52.38. 条款32-37中任何一项的方法，其中自组装生物聚合物包含组织填充物。
53.39. 条款32-38中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
54.40. 条款32-39中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
55.41. 条款32-40中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
56.42. 条款32-41中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
57.43. 条款32-42中任何一项的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
58.44. 用于填充伤口的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到伤口中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的寡聚胶原蛋白和酸。
59.45. 条款44的方法，其中冻干的寡聚胶原蛋白包含冻干的i型寡聚胶原蛋白。
60.46. 条款44或条款45的方法，其中伤口包含手术伤口。
61.47. 条款44-46中任何一项的方法，其中手术伤口由肿瘤移除引起。
62.48. 条款44-47中任何一项的方法，其中手术伤口由乳房肿瘤移除引起。
63.49. 条款44-48中任何一项的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液包含组织填充物。
64.50. 条款44-49中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致缺损收缩和瘢痕组织形成。
65.51. 条款44-50中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
66.52. 条款44-51中任何一项的方法，其中伤口的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
67.53. 条款44-52中任何一项的方法，其中伤口的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
68.54. 条款44-53中任何一项的方法，其中对伤口填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
69.55. 用于恢复和再生患者组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
70.56. 条款55的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
71.57. 条款55或条款56的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
72.58. 条款55-57中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
73.59. 条款55-58中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
74.60. 条款55-59中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
75.61. 条款55-60中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
76.62. 条款55-61中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
77.63. 条款55-62中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
78.64. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
79.65. 条款64的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
80.66. 条款64或条款65的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
81.67. 条款64-66中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
82.68. 条款64-67中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
83.69. 条款64-68中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
84.70. 条款64-69中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
85.71. 条款64-70中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
86.72. 条款64-71中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
87.73. 用于制备组织空隙或缺损中的基质的方法，该方法包括使用单一混合步骤使胶原蛋白聚合，该单一混合步骤包括混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合以形成基质。
88.74. 条款73的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
89.75. 条款73或条款74的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
90.76. 条款73-75中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
91.77. 条款73-76中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
92.78. 条款73-77中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
93.79. 条款73-78中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
94.80. 条款73-79中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
95.81. 条款73-80中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白(telocollagen)。
96.82. 条款73-81中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白(atelocollagen)。
97.83. 条款73-82中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
98.84. 条款73-83中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
99.85. 条款73-84中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
100.86. 条款73-85中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
101.87. 条款73-86中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
102.88. 条款73-87中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
103.89. 条款73-88中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
104.90. 条款73-89中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
105.91. 条款73-90中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
106.92. 条款73-91中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
107.93. 条款73-92中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
108.94. 条款73-93中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
109.95. 条款73-94中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
110.96. 条款73-95中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
111.97. 条款73-96中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
112.98. 条款73-97中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
113.99. 条款73-98中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
114.100. 条款73-99中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
115.101. 条款73-100中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
116.102. 条款73-101中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
117.103. 条款73-102中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
118.104. 条款73-103中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
119.105. 条款73-104中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
120.106. 条款73-105中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
121.107. 条款73-106中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
122.108. 条款73-107中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液中。
123.109. 条款73-108中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
124.110. 条款73-109中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
125.111. 条款73-110中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照进行灭菌。
126.112. 条款73-111中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
127.113. 条款73-112中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
128.114. 条款73-113中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
129.115. 条款73-114中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
130.116. 条款73-115中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
131.117. 条款73-116中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
132.118. 用于制备组织缺损或空隙部位中的基质的方法，所述方法包括通过混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液来使胶原蛋白聚合，和聚合胶原蛋白溶液中的胶原蛋白以形成基质，其中缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
133.119. 条款118的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
134.120. 条款118或条款119的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
135.121. 条款118-120中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
136.122. 条款118-121中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
137.123. 条款118-122中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
138.124. 条款118-123中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
139.125. 条款118-124中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
140.126. 条款118-125中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白。
141.127. 条款118-126中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白。
142.128. 条款118-127中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
143.129. 条款118-128中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
144.130. 条款118-129中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
145.131. 条款118-130中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
146.132. 条款118-131中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
147.133. 条款118-132中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
148.134. 条款118-133中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
149.135. 条款118-134中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
150.136. 条款118-135中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
151.137. 条款118-136中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
152.138. 条款118-137中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
153.139. 条款118-138中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶
原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
154.140. 条款118-139中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
155.141. 条款118-140中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
156.142. 141的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
157.143. 条款118-142中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
158.144. 条款118-143中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
159.145. 条款118-144中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
160.146. 条款118-145中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
161.147. 条款118-146中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
162.148. 条款118-147中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
163.149. 条款118-148中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
164.150. 条款118-149中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
165.151. 条款118-150中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
166.152. 条款118-151中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
167.153. 条款118-152中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液中。
168.154. 条款118-153中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
169.155. 条款118-154中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
170.156. 条款118-155中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
171.157. 条款118-156中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
172.158. 条款118-157中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
173.159. 条款118-158中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
174.160. 条款118-159中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
175.161. 条款118-160中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
176.162. 条款118-161中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
177.163. 按照条款1-162中任何一项的方法制备的胶原蛋白基质。
178.164. 条款163的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
179.165. 条款163或条款164的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
180.166. 条款163-165中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
181.167. 条款163-166中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
182.168. 条款163-167中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
183.169. 条款163-168中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
184.170. 条款163-169中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
185.171. 条款163-170中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
186.172. 条款163-171中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
187.173. 条款163-172中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
188.174. 条款163-173中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
189.175. 条款163-174中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
190.176. 通过将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中，并使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质而制备的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph在约5.5-约8.5的范围内，其中自组装生物聚合物的自组装时间在约0.2分钟-约1.5分钟的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)在约2.0 kpa-约4.0 kpa的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g
’’
)在约0.1 kpa-约0.7 kpa的范围内，和其中胶原蛋白基质的压缩模量在约5.0 kpa-约10.0 kpa的范围内。
191.177. 条款176的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph为约7.25
±
约0.25，其中自组装生物聚合物的自组装时间为约0.8分钟
±
约0.3分钟，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)为约3.1 kpa
±
约0.4 kpa，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g”)为约0.4 kpa
±
约0.1 kpa，和其中胶原蛋白基质的压缩模量为约7.7 kpa
±
约1.9 kpa。
192.178. 条款176或条款177的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
193.179. 条款176-178中任何一项的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
194.180. 条款176-179中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
195.181. 条款176-180中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
196.182. 条款176-181中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
197.183. 条款176-182中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
198.184. 条款176-183中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
199.185. 条款176-184中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
200.186. 条款176-185中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
201.187. 条款176-186中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
202.188. 条款176-187中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
203.189. 条款176-188中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
204.190. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的组织的试剂盒，该试剂盒包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液。
205.191. 条款190的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含液体i型胶原蛋白。
206.192. 条款190或条款191的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
207.193. 条款190-192中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
208.194. 条款190-193中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
209.195. 条款190-194中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
210.196. 条款190-195中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液的比率为约9:1。
211.197. 条款190-196中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
212.198. 条款190-197中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清。
213.199. 条款190-198中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
214.200. 条款190-199中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含
有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
215.201. 条款190-200中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
216.202. 条款190-201中任何一项的试剂盒，其进一步包含被配置用于将可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的混合物递送至组织空隙或缺损的注射器。
217.203. 条款190-202中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
218.204. 条款190-203中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.002 mm-约.02 mm mgcl2。
219.205. 条款190-204中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含少于约.02 mm mgcl2。
220.206. 条款190-205中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
221.207. 条款190-206中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.003 m-约.03 m kh2po4。
222.208. 条款190-207中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.01 m-约0.1 m na2hpo4。
223.209. 条款190-208中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.001 m-约.04 m kcl。
224.210. 条款190-209中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2 m-约3.0 m nacl。
225.211. 条款190-210中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.02 n-约0.2 n naoh。
226.212. 条款190-211中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
227.213. 条款190-212中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
228.214. 条款190-213中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
229.215. 条款190-214中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
230.216. 条款190-215中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
231.217. 条款190-216中任何一项的试剂盒，其中中和的胶原蛋白填充物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml，所述中和的胶原蛋白填充物为包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的中和的胶原蛋白填充物。
232.218. 条款190-217中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白溶液包含约.005 n盐酸-约0.1 n盐酸。
233.219. 条款190-218中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液被配置为在单一混合步骤中使可原位聚合胶原蛋白组合物聚合，所述单一混合步骤包括混合可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液。
234.220. 条款190-219中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液处于单独容器中。
235.221. 条款190-220中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含灭菌小瓶。
236.222. 条款190-221中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含双管注射器的单独隔室。
237.223. 条款190-222中任何一项的试剂盒，其中双管注射器包含混合元件。
238.224. 条款190-223中任何一项的试剂盒，其中双管注射器被灭菌。
239.225. 条款190-224中任何一项的试剂盒，其进一步包含用于使用试剂盒的组件的说明。
240.226. 条款190-225中任何一项的试剂盒，其进一步包含至少一种被配置用于局部递送至组织空隙或缺损的治疗剂。
241.227. 条款190-226中任何一项的试剂盒，其中至少一种治疗剂包括化学治疗剂、抗炎剂、抗生素剂、镇痛剂或其组合。
242.228. 条款190-227中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含伤口。
243.229. 条款190-228中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
244.230. 条款190-229中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
245.231. 条款190-230中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
246.232. 条款190-231中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于保乳手术后再生组织。
247.233. 条款190-232中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于制备组织空隙或缺损中的基质。
248.234. 条款190-233中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用紫外辐射进行灭菌。
249.235. 条款190-234中任何一项的试剂盒，其中由可原位聚合胶原蛋白组合物聚合产生的胶原蛋白基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
250.236. 条款190-235中任何一项的试剂盒，其中聚合特性为剪切储能模量。
251.237. 条款190-236中任何一项的试剂盒，其中所述辐射的剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
252.238. 条款190-237中任何一项的试剂盒，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
253.239.条款190-238中任何一项的试剂盒，其中灭菌使病毒失活。
254.240. 条款190-239中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照进行灭菌。
255.241. 条款190-240中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
256.附图简述图1显示在原位形成具有软组织样特性的粘弹性基质的液体组织填充物的概况。图1a显示包括了含有无菌i型寡聚胶原蛋白溶液的注射器、适当中和(自组装)缓冲液的注射器、鲁尔锁适配器和施药器尖端的试剂盒。图1b显示混合两种试剂，然后注射到保持在体温(37℃)下的塑料模具中，其中液体转变成稳定的、保形的纤维状胶原蛋白基质。图1c显示记录i型寡聚胶原蛋白的纯度和特征性条带模式的4-20%和6%的sds-page凝胶，其中泳道1对应于分子量标准物和泳道2对应于i型寡聚胶原蛋白。图1d显示概述由组织填充物形成的基质的组织填充物聚合动力学和性能规格(平均值
±
sd；n=4，n=6-8)的表格。
257.图2显示模拟肿块切除程序的概况。图2a显示概述代表大约四分之一总乳房组织体积的手术切除的乳腺组织体积的表格[数据(平均值
±
sd)编汇自纵向和放疗研究两者(1周：胶原蛋白填充物：n=12，无填充=6；4周：胶原蛋白填充物：n=18，无填充：n=9；16周：胶原蛋白填充物：n=18，无填充：n=9)]。图2b显示在应用组织填充物之前的手术空隙。图2c显示在应用组织填充物之后的手术空隙。图2d显示组织填充物的应用。图2e显示切除的猪乳腺组织。图2f显示紧接在包括绷扎在内的手术后的手术部位。图2g显示模拟肿块切除术伴随辐照后16周的手术部位。
[0258]
图3显示组织填充物如何持续存在并诱导支持乳房组织形成而不引起典型炎症反应或异物反应的组织植入反应的概况。图3a显示乳腺外科医生在模拟肿块切除术后的不同时间点为胶原蛋白组织填充物和无填充(阴性对照)处理的空隙分配的乳房均匀性/一致性评分(平均值
±
sd；胶原蛋白组织填充物：n=12；无填充：n=6)的图表。所有未手术的乳房均评分为0。图3b显示与正常乳房组织相比较，在用胶原蛋白组织填充物或无填充处理后的手术空隙的横截面。箭头表示被放置以标记手术空隙边界的手术夹。
[0259]
图4显示组织填充物如何支持乳房组织形成而不引起炎症反应或异物反应的概况。图4a显示在模拟肿块切除术后1周、4周和16周时胶原蛋白填充的空隙的组织学横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙内的组织填充物及其与周围宿主组织的界面(大箭头表示手术夹部位)。高放大率图像以组织填充物的中心区域和组织填充物-宿主组织界面为特征。基质植入物内的细胞浸润、血管化和乳房组织形成随着时间的推移发生，而没有一般见于未处理的组织空隙的愈合的炎症反应(即中性粒细胞和巨噬细胞的浸润)或一般对组织植入反应观察到的异物反应(即巨噬细胞活化、巨细胞形成、吞噬作用和纤维囊形成)的迹象。到16周时，组织填充物完全细胞化和血管化(小箭头表示血管)，伴随乳腺(rg)和脂肪组织(rf)形成的迹象。onc：没有细胞浸润的组织填充物基质；oc：具有细胞浸润的组织填充物基质。图4b显示模拟肿块切除术后1周、4周和16周时未处理(未填充)的手术空隙的横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙和周围宿主组织。高放大率图像以空隙的中心区域和空隙/宿主组织界面为特征。血肿(h)在1周时常见，然后是进行性缺损收缩和导致瘢痕组织形成(s)的愈合反应。
[0260]
图5显示组织填充物如何不干扰放射检查或超声检查程序的概况。图5a显示代表性的超声图像，而图5b显示在1周、4周和16周时间点时与正常乳房组织相比较用胶原蛋白组织填充物或无填充处理的手术空隙的代表性射线照片。射线照片内明显的不透射线标记夹表示手术空隙的边界，并且显示与无填充空隙相比较，用组织填充物处理的空隙有伤口收缩减少的迹象。
[0261]
图6显示放疗如何对组织填充物和相关的组织植入反应几乎没有影响的概况。图6a显示乳腺外科医生在模拟肿块切除术伴随放疗后的不同时间点为胶原蛋白组织填充物和无填充(阴性对照)处理的空隙分配的乳房均匀性/一致性评分(平均值
±
sd；胶原蛋白：n=6；无填充：n=3)的图表。所有未手术的乳房均评分为0。图6b显示与未手术的正常乳房组织相比较，用组织填充物或无填充以及放疗处理后的手术空隙横截面。箭头表示被放置以标记手术空隙边界的手术夹。图6c显示在模拟肿块切除术与辅助放疗后4周和16周时胶原蛋白填充的空隙的组织学横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙内的组织填充物及其与周围宿主组织的界面。高放大率图像以组织填充物的中心区域和组织填充物-宿主组织界面为特征。基质植入物内的细胞浸润、血管化和乳房组织形成随着时间的推移发生，尽管速率比非辐照动物的部位慢。到16周时，组织填充物完全细胞化和血管化(小箭头表示血管)，有脂肪组织(rf)形成的迹象。onc：没有细胞浸润的组织填充物基质；oc：具有细胞浸润的组织填充物基质。图6d显示模拟肿块切除术伴随放疗后4周和16周时未处理(无填充)的手术空隙的横截面(h&e)。低放大率图像显示空隙和周围宿主组织，4周时瘢痕组织(s)和缝合相关肉芽肿(g)明显(大箭头表示手术夹部位)。高放大率图像以炎症反应的中心区域和空隙内形成的瘢痕组织，即瘢痕-宿主组织界面为特征。
[0262]
图7显示组织填充物如何即使在辅助放疗之后也不影响乳房组织诊断图像的解释的概况。图7a显示代表性的超声图像，而图7b显示在4周和16周时间点时与正常乳房相比较用组织填充物或无填充以及辐照处理的手术空隙的代表性射线照片。射线照片内明显的不透射线标记夹表示手术空隙的边界，并且显示与无填充空隙相比较，用组织填充物处理的空隙的伤口收缩减少。
[0263]
图8显示在猪模拟肿块切除模型中观察到的愈合反应的时间线和过程。图8a显示比较和对比与对无填充观察到的典型修复性愈合反应相关的阶段和过程的示意图。图8b显示比较和对比与对胶原蛋白组织填充物观察到的恢复性和再生性愈合反应相关的阶段和过程的示意图。
[0264]
图9显示正常乳房组织和上覆皮肤的多种组织类型组成以及辐照的效果。横截面(h&e)显示来自未接受辐照和肿块切除术后伴随放疗4周和16周的猪的正常乳房组织和相关皮肤。乳腺组织由胶原结缔组织(c)、乳腺小叶(m)、乳腺导管(d)和脂肪(adipose)(脂肪(fatty))组织(f)组成。皮肤含有多细胞表皮层(e)与位于下方的胶原真皮(c)。
[0265]
图10显示用于猪乳房术后评价的半定量评分。基于总体外观评价乳房和手术部位，所述总体外观包括红斑和焦痂以及水肿的迹象。触诊用于评价乳房均匀性和一致性。
[0266]
图11显示在无填充处理的空隙中腺体坏死明显的情况下胶原组织填充物如何支持乳腺形成的概况。相应的h＆e (图11a和11c)和广谱细胞角蛋白染色(图11b和11d)的横截面显示用胶原蛋白组织填充物(图11a和11b)或无填充(图11c和11d)处理后16周的手术空隙，所选区域分别代表胶原蛋白组织填充物的外围和形成的瘢痕组织。广谱细胞角蛋白突出胶原蛋白组织填充物和无填充组内乳腺小叶和导管内衬的上皮细胞。无填充组也显示坏死腺体的迹象(黑色和白色箭头)。免疫荧光图像显示广谱细胞角蛋白(绿色)，和细胞核用dapi (蓝色)复染。
[0267]
图12显示在猪背颈部内创建骨骼肌和脂肪组织缺损的概况。缺损处充满符合空隙几何形状的液体胶原蛋白。应用之后约1分钟内，液体胶原蛋白原位聚合，形成恢复组织形
态和连续性的胶原蛋白基质。
[0268]
图13显示植入后11周胶原蛋白基质内新形成的骨骼肌和脂肪(adipose) (脂肪(fat))组织的概况，其中没有一般见于未处理的组织空隙的愈合的炎症反应(即中性粒细胞和巨噬细胞的浸润)或一般对组织植入反应观察到的异物反应(即巨噬细胞活化、巨细胞形成、吞噬作用和纤维囊形成)的迹象。c：胶原组织填充物基质；f：脂肪；m：骨骼肌；箭头：相关的微脉管系统。
[0269]
图14显示胶原蛋白组织填充物试剂盒的代表性组件的示意图。
[0270]
详述根据本讲授，描述了在转变为具有组织一致性的纤维状胶原蛋白基质之前可作为液体应用于任何类型的组织空隙或缺损的恢复性和再生性组织填充物，所述组织空隙或缺损包括但不限于由手术伤口导致的组织空隙(例如包括但不限于源于bcs的手术伤口)、物理缺损(例如瘢痕、凹陷、先天性缺损等)、损伤、疾病进展和/或类似情况。使用猪模拟bcs模型，根据本讲授的胶原蛋白填充物已经显示诱导再生性愈合反应，其特征为快速细胞化、血管化和进行性乳房组织新生，包括脂肪组织和乳腺和导管。与常规生物材料形成对比，对于根据本讲授的胶原蛋白填充物未观察到异物反应或炎症介导的“活跃”生物降解。此外，根据本讲授的胶原蛋白填充物也不影响模拟手术再切除、放射检查或超声检查程序，其为对于临床转化重要的特征。此外，在应用术后放疗后，对根据本讲授胶原蛋白填充物的组织反应与非辐照条件下的反应非常相似(尽管正如预期的那样愈合稍慢)。根据本讲授的形成原位基质的胶原蛋白易于应用，符合患者特异性的缺损，并且在不存在炎症的情况下生成复杂组织。因此，根据本讲授的胶原蛋白填充物作为用于bcs以及其他软组织恢复和重建需求的第一种再生性组织填充物具有显著的转化潜力。
[0271]
在一些实施方案中，根据本讲授的再生性组织填充物可提供以下优势中的一种或多种：(1) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有瘢痕组织形成；(2) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有缺损收缩；(3) 减少(即相对于常规无填充程序)或没有炎症介质或炎症反应；(4) 与天然组织相似的组织一致性(例如与天然组织相似的压缩模量或压缩模量范围)；(5) 用脂肪组织、乳腺组织等恢复和生成乳房组织；(6) 骨骼肌的恢复和生成；(7) 不干扰包括再切除、超声检查或放射检查在内的常规临床程序的组织植入反应；和/或(8) 较少(即相对于常规程序)或不受辅助放疗负面影响的组织植入反应(例如没有脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域，其中任何一个均可干扰成像)。
[0272]
根据本讲授，本发明人已经寻求这样一种组织填充物，其应当(i) 可预测地恢复和再生损伤的组织和组织空隙，(ii) 易于应用，(iii) 符合在尺寸和几何形状上广泛变化的患者特异性的缺损，以及(iv) 不干扰或影响常规临床过程和程序。在一些实施方案中，将组织填充物在无菌条件下引入到组织空隙或缺损中。在一些实施方案中，可经注射(例如使用一个或多个单管注射器、双管注射器和/或类似物及其组合)将组织填充物引入到组织空隙或缺损中。在其他实施方案中，组织填充物可最初应用于外部模具(例如在手术环境下)以形成模制部件，所述部件然后可从模具中被取出并植入到患者体内。再生医学方法，包括可调谐的原位形成生物材料，具有解决许多的这些设计考虑的潜力。特别是，i型寡聚胶原蛋白(寡聚体)为易溶于稀酸的胶原蛋白的高度纯化的分子形式，其代表具有解决许多的这些设计考虑的潜力的可调式原位形成生物材料。与常规单体胶原蛋白制剂(即端胶原
蛋白和去端胶原蛋白)不同，寡聚体代表全长三螺旋胶原蛋白分子(即原胶原蛋白)的小聚集体，其羧基-和氨基-末端端肽完整，通过天然存在的分子间交联保持在一起。保持这些关键分子特征，包括羧基-和氨基-末端端肽区域和相关的分子间交联，为这种天然聚合物及其形成的胶原蛋白材料提供合乎期望但不常见的特性。更具体地讲，寡聚体保持其纤维状胶原蛋白固有的原纤维形成(自组装)能力。在将寡聚体中和至生理条件(例如ph和离子强度)后，这种液体形式可非常易于注射以完全填充复杂的轮廓和几何形状。在体温下，液体快速转变为纤维状胶原蛋白基质，再创建在组织的胞外基质(ecm)成分中发现的胶原蛋白基质的结构和生物信号传导特征。在体内植入后，这些基质持续存在，显示出缓慢的代谢更新和重塑、对蛋白水解降解的抗性以及没有活跃的生物降解或异物反应。这种天然聚合物支持创建具有广泛可调谐物理特性的材料，所述物理特性包括几何形状、架构(随机或排列的原纤维、连续的原纤维密度梯度)和机械完整性，使其成为个性化再生医学的致能平台。原位形成的胶原蛋白基质显示出作为保乳手术和其他软组织恢复需求的再生性组织填充物的前景。
[0273]
在一些实施方案中，提供在转变为具有组织一致性的纤维状胶原蛋白基质之前可作为液体应用于伤口的再生性组织填充物，所述伤口包括但不限于bcs期间的缺损或轮廓。使用猪模拟bcs模型，如以下进一步描述的那样，胶原蛋白填充物显示出诱导再生性愈合反应，其特征为快速细胞化、血管化和进行性乳房组织新生，包括脂肪组织和乳腺和导管。与常规生物材料不同，未观察到异物反应或炎症介导的“活跃”生物降解。胶原蛋白填充物也不影响模拟的手术再切除、放射检查或超声检查程序，其为对于临床转化重要的特征。当应用bcs后放疗时，胶原蛋白填充及其相关的组织反应与非辐照条件非常相似。然而，正如预期的那样，愈合速率稍慢。这种原位基质形成胶原蛋白易于应用，符合患者特异性缺损/轮廓，并且在不存在炎症的情况下生成复杂组织。其作为用于bcs以及其他软组织和骨骼肌组织恢复和重建需求的第一种再生性组织填充物具有显著的转化潜力。
[0274]
本文所述的胶原蛋白填充物与常规可流动和可注射的胶原蛋白产品根本不同，这些胶原蛋白产品用于或先前已经用于软组织增强(例如美容程序)、皮肤伤口(例如溃疡)的处理和组织膨胀(例如尿失禁)。包括zyderm
®
、zyplast
®
、integra flowable
®
和contigen
®
在内的此类产品由源于牛、猪或人体组织来源的重构的酶处理的胶原蛋白(去端胶原蛋白)或者粒状组织颗粒制成。为使这些材料可注射，使不溶性纤维胶原蛋白或组织颗粒悬浮于生理盐水溶液中以产生分散体或悬浮液。所有的这些可植入的胶原蛋白均为暂时的，并表现出快速生物降解(重吸收；1-6个月)，其中它们经炎症介导的过程活跃降解，所述过程包括巨噬细胞/巨细胞的吞噬作用和分泌的基质金属蛋白酶的蛋白水解降解。为减缓降解和提高持久性，这些产品中的许多均用戊二醛或其他外源性交联工艺处理。
[0275]
相比之下，寡聚胶原蛋白代表在天然组织胶原纤维(例如猪真皮)内发现的分子亚结构域，可对其进行提取和纯化，使得其不含细胞和其他免疫原性组织成分。包含该亚结构域的i型胶原蛋白和交联化学在物种间高度保守，证明体内该主要结构元件的重要性。生理条件诱导原纤维形成，其中寡聚体分子组装成交错阵列，产生相互连接的网络或原纤维基质。公开的研究表明，形成的基质与在胞外基质中天然发现的那些非常相似，包括易于参与生物信号传导的具有规则d-条带模式的原纤维。寡聚体中存在但在可聚合单体胶原蛋白中未发现的天然交联化学为快速基质形成反应以及寡聚体基质表现出的改善机械完整性、缓
慢代谢更新和对蛋白水解降解的抗性的主要贡献者。总的来说，当与常规可生物降解胶原蛋白材料相比较，这些显著特征助于寡聚体基质显示出罕见作用机制和再生性组织反应。
[0276]
恢复和再生患病、损伤或功能失调的组织的能力一直为医学中最大的挑战之一。事实上，研究人员一直在努力鉴定生物材料和/或抗炎剂，以实现更合乎期望的愈合结果(即再生)或生物材料/装置植入物反应。对于乳房来说，这种挑战特别困难，因为其由具有不同功能的多种组织类型组成，包括分泌(即产乳)腺体和导管、支撑性胶原结缔组织和体积填充脂肪组织。目前，用于软组织和乳房重建的组织工程和再生医学策略仍处于其起步阶段，迄今只有少数策略在大型动物模型中进行评估。大多数方法均集中于从生物或合成支架工程化脂肪组织，结合脂肪填充、患者来源的细胞群和生长因子以促进脂肪生成和血管化。常规合成支架方法的一个主要缺点为材料无法向细胞发出信号，从而导致异物反应及缓慢的细胞化和血管化。
[0277]
在一些实施方案中，组织填充物可包含纯化的、形成原纤维的液体i型胶原蛋白，比如源于猪真皮的胶原蛋白。在一些实施方案中，这种原位形成胶原蛋白装置可作为含有以下的一次性使用试剂盒提供：含有在稀(0.01 n)盐酸中的胶原蛋白溶液(10 ml)的无菌玻璃小瓶、含有专有中和(自组装)试剂(2 ml)的无菌玻璃小瓶、两个无菌10-ml注射器、无菌鲁尔锁连接器和无菌施药器尖端。在一个注射器中吸取9 ml液体胶原蛋白和在另一个注射器中吸取1 ml中和缓冲液之后，用户将两个注射器用鲁尔锁连接器连接起来并混合两种试剂。混合之后，可注射中和的胶原蛋白溶液以填充组织空隙或缺损，包括较深且难以接近和形状不规则的那些组织空隙或缺损。应用后，其会经分子自组装经历快速(在体温下~1分钟)的原纤维形成。所得的组织填充物基质随着时间的推移恢复和保持组织形状和软组织一致性，并引发组织植入反应，其特征在于细胞化、血管化和新组织形成而不引起一般对伤口愈合观察到的炎症反应或一般对常规组织植入反应观察到的异物反应。
[0278]
特殊配制的胶原蛋白的液体形式易于填充并符合患者特异性的缺损的几何形状和轮廓，且适用于微创程序。一旦应用于该部位，则胶原蛋白溶液经历聚合(分子自组装反应)以形成物理上稳定的纤维状胶原蛋白基质，该基质会持续存在并保持其体积。该基质在不存在炎症反应或异物反应的情况下提供给细胞关键的生化和生物力学信号传导，支持细胞化、血管化和部位适合的组织形成。这包括具有不同功能的复杂组织组成，比如在乳房中发现的那些。该材料与许多的标准临床程序相容，包括辐照、放射检查、超声检查和手术再切除。
[0279]
贯穿本说明书和所附权利要求，应理解以下定义：短语“寡聚胶原蛋白”是指包含交联胶原蛋白分子的胶原蛋白。胶原蛋白分子由3个单独的多肽链组成，它们共同产生其三螺旋四级结构，其侧翼为非螺旋端肽末端。如本文使用的，短语“寡聚胶原蛋白”应被理解为是指至少一部分通过分子间交联共价保持在一起的胶原蛋白分子。例如，如本文所述，寡聚胶原蛋白可以聚合。可聚合寡聚胶原蛋白为能够聚合的寡聚胶原蛋白。可在寡聚胶原蛋白中发现的交联胶原蛋白分子的一个实例为原胶原蛋白。
[0280]
术语“灭菌”是指去除污染物，包括但不限于传染物。例如，污染物(例如细菌、病毒)可通过灭活、减少数量或量或者通过抑制污染物质(无论是否具有传染性)的活性来去除。
[0281]
术语“纯化的”是指去除污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和内毒素。
[0282]
短语“异物反应”是指由任何通常不会在体内发现的物质引发的局部炎症反应。这种反应的特征可为蛋白吸附和以巨噬细胞活化、巨细胞形成和纤维囊形成和/或外来物质的降解或吞噬作用为标志的炎症过程。
[0283]
短语“组织植入反应”是指“异物反应”的子集，其具体是由将材料植入患者体内而产生的。
[0284]
术语“患者”是指待治疗组织空隙或缺损的任何动物，包括但不限于脊椎动物。如本文使用的，术语“患者”包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物、鸟和鱼。在一些实施方案中，患者是指哺乳动物(例如人类、狗、猫、马、兔、猪等)。在说明性实施方案中，患者为人。
[0285]
术语“空隙”和“缺损”是指所有形式的组织异常，包括但不限于伤口、手术伤口(例如包括但不限于源于bcs的手术伤口)、物理缺损(例如瘢痕、凹陷、先天性缺损等)、损伤、疾病进展(肌肉萎缩等)和/或类似情况及其组合。如本文使用的，术语“组织”包括硬组织(例如骨骼)和软组织两者。因此，短语“组织异常”包括硬和软组织两者中所有形式的异常。
[0286]
如关于组织而使用的，术语“恢复”和“再生”分别是指在先前已表征为组织空隙或缺损的患者区域中组织存在的重建以及在该相同区域中的组织再生长。在一些实施方案中，恢复和/或再生的组织可反映被替换的初始组织的一种或多种外观、结构和功能。
[0287]
如关于组织而使用的，术语“收缩”是指一类以组织面积减少为特征并且一般由身体的愈合反应引起的瘢痕形成。
[0288]
术语“基质”是指胶原蛋白-原纤维支架样结构，该结构被配置为提供组织可以起源、发育和/或生长于其上、周围和内部的平台。
[0289]
在一些实施方案中，用于根据本讲授填充组织空隙或缺损的方法包括(a) 将自组装生物聚合物引入到组织缺损或空隙中，和(b) 使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
[0290]
在一些实施方案中，用于根据本讲授填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到手术伤口部位；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。该寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0291]
在一些实施方案中，用于填充由肿块切除或乳房切除程序生成的组织空隙或缺损的方法包括(a) 将含有寡聚胶原蛋白溶液和中和溶液的混合物引入到手术伤口部位；和(b) 使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液可包括冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。在一些实施方案中，寡聚胶原蛋白溶液与中和溶液的比率为约9:1。
[0292]
在其他实施方案中，提供根据任何上述方法制备的胶原蛋白基质。在另外的实施方案中，提供含有胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒。在进一步的实施方案中，提供含有冻干的i型寡聚胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。
[0293]
通过以下列举的条款描述几个另外的实施方案。还考虑这些实施方案的任何适用
的组合，并且还考虑这些实施方案与本技术的该详述部分中描述的实施方案的任何适用的组合。
[0294]
1. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
[0295]
2. 条款1的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合寡聚胶原蛋白。
[0296]
3. 任何前述条款的方法，其中可原位聚合寡聚胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
[0297]
4. 任何前述条款的方法，其中至少一部分胶原蛋白分子通过一个或多个分子间交联共价键合。
[0298]
5. 任何前述条款的方法，其中患者为哺乳动物。
[0299]
6. 任何前述条款的方法，其中患者为人类。
[0300]
7. 任何前述条款的方法，其中引入为在无菌条件下实现的。
[0301]
8. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含可原位聚合胶原蛋白，和其中保形基质包含胶原蛋白-原纤维基质。
[0302]
9. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含液体i型胶原蛋白。
[0303]
10. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
[0304]
11. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
[0305]
12. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
[0306]
13. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中该溶液进一步包含缓冲溶液。
[0307]
14. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0308]
15. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液，其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0309]
16. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，其中溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
[0310]
17. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清。
[0311]
18. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0312]
19. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0313]
20. 任何前述条款的方法，其中自组装生物聚合物包含含有冻干的i型寡聚胶原
蛋白和盐酸的溶液，其中溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0314]
21. 任何前述条款的方法，其中引入包括经注射器将自组装生物聚合物注射到组织空隙或缺损中。
[0315]
22. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过肿块切除程序生成。
[0316]
23. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损通过乳房切除程序生成。
[0317]
24. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0318]
25. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0319]
26. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0320]
27. 任何前述条款的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
[0321]
28. 任何前述条款的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0322]
29. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0323]
30. 条款29的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0324]
31. 条款29或条款30的方法，其中酸包含0.01 n盐酸，和其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
[0325]
32. 用于填充患者体内的组织空隙或缺损的方法，该组织空隙或缺损由肿块切除或乳房切除程序生成，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸；其中寡聚胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml；和其中寡聚胶原蛋白溶液与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0326]
33. 条款32的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液已经使用超速离心进行澄清，通过无菌膜滤器进行过滤，用紫外辐射进行给予，或其组合。
[0327]
34. 条款32-33中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0328]
35. 条款32-34中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0329]
36. 条款32-35中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0330]
37. 条款32-36中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
[0331]
38. 条款32-37中任何一项的方法，其中自组装生物聚合物包含组织填充物。
[0332]
39. 条款32-38中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0333]
40. 条款32-39中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0334]
41. 条款32-40中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0335]
42. 条款32-41中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
[0336]
43. 条款32-42中任何一项的方法，其中对组织空隙或缺损填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0337]
44. 用于填充伤口的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到伤口中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的寡聚胶原蛋白和酸。
[0338]
45. 条款44的方法，其中冻干型寡聚胶原蛋白包含冻干的i型寡聚胶原蛋白。
[0339]
46. 条款44或条款45的方法，其中伤口包含手术伤口。
[0340]
47. 条款44-46中任何一项的方法，其中手术伤口由肿瘤移除引起。
[0341]
48. 条款44-47中任何一项的方法，其中手术伤口由乳房肿瘤移除引起。
[0342]
49. 条款44-48中任何一项的方法，其中寡聚胶原蛋白溶液包含组织填充物。
[0343]
50. 条款44-49中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致缺损收缩和瘢痕组织形成。
[0344]
51. 条款44-50中任何一项的方法，其中伤口的填充并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0345]
52. 条款44-51中任何一项的方法，其中伤口的填充导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0346]
53. 条款44-52中任何一项的方法，其中伤口的填充导致生成具有脂肪组织、乳腺组织或其组合的乳房组织。
[0347]
54. 条款44-53中任何一项的方法，其中对伤口填充的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0348]
55. 用于恢复和再生患者组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中；和使自组装生物聚合物聚合以形成保形基质。
[0349]
56. 条款55的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0350]
57. 条款55或条款56的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0351]
58. 条款55-57中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0352]
59. 条款55-58中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0353]
60. 条款55-59中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0354]
61. 条款55-60中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和
再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0355]
62. 条款55-61中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
[0356]
63. 条款55-62中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0357]
64. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的骨骼肌组织的方法，该方法包括：将包含寡聚胶原蛋白溶液和缓冲溶液的混合物引入到组织空隙或缺损中；和使寡聚胶原蛋白溶液聚合以形成胶原蛋白-原纤维基质；其中寡聚胶原蛋白溶液包含冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸。
[0358]
65. 条款64的方法，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0359]
66. 条款64或条款65的方法，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0360]
67. 条款64-66中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0361]
68. 条款64-67中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致缺损收缩或瘢痕组织形成。
[0362]
69. 条款64-68中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生并不导致炎症介质、炎症反应或异物反应。
[0363]
70. 条款64-69中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致与天然组织基本上相同的压缩模量或压缩模量范围。
[0364]
71. 条款64-70中任何一项的方法，其中组织空隙或缺损中骨骼肌组织的恢复和再生导致骨骼肌与脂肪组织的生成。
[0365]
72. 条款64-71中任何一项的方法，其中对骨骼肌组织的恢复和再生的组织植入反应不受放疗的负面影响，使得没有观察到脂质囊肿、微钙化、局灶性肿块和/或不透明度增加的区域中的一种或多种。
[0366]
73. 用于制备组织空隙或缺损中的基质的方法，该方法包括使用单一混合步骤使胶原蛋白聚合，该单一混合步骤包括混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合以形成基质。
[0367]
74. 条款73的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0368]
75. 条款73或条款74的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0369]
76. 条款73-75中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
[0370]
77. 条款73-76中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
[0371]
78. 条款73-77中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
[0372]
79. 条款73-78中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0373]
80. 条款73-79中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0374]
81. 条款73-80中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白。
[0375]
82. 条款73-81中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白。
[0376]
83. 条款73-82中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
[0377]
84. 条款73-83中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
[0378]
85. 条款73-84中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
[0379]
86. 条款73-85中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
[0380]
87. 条款73-86中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
[0381]
88. 条款73-87中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
[0382]
89. 条款73-88中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
[0383]
90. 条款73-89中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
[0384]
91. 条款73-90中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
[0385]
92. 条款73-91中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
[0386]
93. 条款73-92中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
[0387]
94. 条款73-93中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
[0388]
95. 条款73-94中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
[0389]
96. 条款73-95中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
[0390]
97. 条款73-96中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
[0391]
98. 条款73-97中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
[0392]
99. 条款73-98中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
[0393]
100. 条款73-99中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
[0394]
101. 条款73-100中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
[0395]
102. 条款73-101中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
[0396]
103. 条款73-102中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
[0397]
104. 条款73-103中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
[0398]
105. 条款73-104中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分
比-约5重量百分比的葡萄糖。
[0399]
106. 条款73-105中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
[0400]
107. 条款73-106中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
[0401]
108. 条款73-107中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液中。
[0402]
109. 条款73-108中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
[0403]
110. 条款73-109中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
[0404]
111. 条款73-110中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照进行灭菌。
[0405]
112. 条款73-111中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0406]
113. 条款73-112中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
[0407]
114. 条款73-113中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0408]
115. 条款73-114中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0409]
116. 条款73-115中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0410]
117. 条款73-116中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
[0411]
118. 用于制备组织缺损或空隙部位中的基质的方法，所述方法包括通过混合胶原蛋白组合物与缓冲溶液以形成胶原蛋白溶液来使胶原蛋白聚合，和聚合胶原蛋白溶液中的胶原蛋白以形成基质，其中缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
[0412]
119. 条款118的方法，其进一步包括在大于约25℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0413]
120. 条款118或条款119的方法，其进一步包括在约37℃的温度下温育胶原蛋白溶液以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。
[0414]
121. 条款118-120中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白寡聚体。
[0415]
122. 条款118-121中任何一项的方法，其中胶原蛋白包含胶原蛋白分子。
[0416]
123. 条款118-122中任何一项的方法，其中胶原蛋白由胶原蛋白寡聚体组成。
[0417]
124. 条款118-123中任何一项的方法，其中胶原蛋白由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0418]
125. 条款118-124中任何一项的方法，其中胶原蛋白基本上由分子间交联的胶原蛋白分子组成。
[0419]
126. 条款118-125中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含端胶原蛋白。
[0420]
127. 条款118-126中任何一项的方法，其中胶原蛋白进一步包含去端胶原蛋白。
[0421]
128. 条款118-127中任何一项的方法，其中包含胶原蛋白寡聚体的胶原蛋白得自含有胶原蛋白寡聚体的组织、得自产生胶原蛋白寡聚体的细胞或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体来获得。
[0422]
129. 条款118-128中任何一项的方法，其中胶原蛋白源于猪皮组织。
[0423]
130. 条款118-129中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物进一步包含酸。
[0424]
131. 条款118-130中任何一项的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸。
[0425]
132. 条款118-131中任何一项的方法，其中酸为盐酸。
[0426]
133. 条款118-132中任何一项的方法，其中盐酸为约.005 n-约0.1 n盐酸。
[0427]
134. 条款118-133中任何一项的方法，其中盐酸为约.01 n盐酸。
[0428]
135. 条款118-134中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
[0429]
136. 条款118-135中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
[0430]
137. 条款118-136中任何一项的方法，其中胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。
[0431]
138. 条款118-137中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物被灭菌。
[0432]
139. 条款118-138中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液或胶原蛋白基质通过选自暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ-辐照、紫外辐射、电子束及其组合的方法进行灭菌。
[0433]
140. 条款118-139中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物通过过滤进行灭菌。
[0434]
141. 条款118-140中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
[0435]
142. 141的方法，其中缓冲溶液包含约0.002 mm-约.02 mm mgcl2。
[0436]
143. 条款118-142中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含少于约0.02 mm mgcl2。
[0437]
144. 条款118-143中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
[0438]
145. 条款118-144中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4。
[0439]
146. 条款118-145中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约1 mm-约10 m na2hpo4。
[0440]
147. 条款118-146中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.1 mm-约4 mm kcl。
[0441]
148. 条款118-147中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.02 m-约0.3 m nacl。
[0442]
149. 条款118-148中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.002 n-约0.02 n naoh。
[0443]
150. 条款118-149中任何一项的方法，其中缓冲溶液进一步包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
[0444]
151. 条款118-150中任何一项的方法，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
[0445]
152. 条款118-151中任何一项的方法，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
[0446]
153. 条款118-152中任何一项的方法，其进一步包括将细胞加入到胶原蛋白溶液
中。
[0447]
154. 条款118-153中任何一项的方法，其中基质包含胶原蛋白原纤维。
[0448]
155. 条款118-154中任何一项的方法，其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白。
[0449]
156. 条款118-155中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
[0450]
157. 条款118-156中任何一项的方法，其中胶原蛋白组合物、胶原蛋白溶液和/或基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0451]
158. 条款118-157中任何一项的方法，其中由胶原蛋白溶液聚合产生的基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
[0452]
159. 条款118-158中任何一项的方法，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0453]
160. 条款118-159中任何一项的方法，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0454]
161. 条款118-160中任何一项的方法，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0455]
162. 条款118-161中任何一项的方法，其中灭菌使病毒失活。
[0456]
163. 按照条款1-162中任何一项的方法制备的胶原蛋白基质。
[0457]
164. 条款163的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
[0458]
165. 条款163或条款164的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
[0459]
166. 条款163-165中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
[0460]
167. 条款163-166中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
[0461]
168. 条款163-167中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
[0462]
169. 条款163-168中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
[0463]
170. 条款163-169中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0464]
171. 条款163-170中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0465]
172. 条款163-171中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0466]
173. 条款163-172中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
[0467]
174. 条款163-173中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
[0468]
175. 条款163-174中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0469]
176. 通过将自组装生物聚合物引入到组织空隙或缺损中，并使自组装生物聚合
物聚合以形成保形基质而制备的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph在约5.5-约8.5的范围内，其中自组装生物聚合物的自组装时间在约0.2分钟-约1.5分钟的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)在约2.0 kpa-约4.0 kpa的范围内，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g
’’
)在约0.1 kpa-约0.7 kpa的范围内，和其中胶原蛋白基质的压缩模量在约5.0 kpa-约10.0 kpa的范围内。
[0470]
177. 条款176的胶原蛋白基质，其中自组装生物聚合物的ph为约7.25
±
约0.25，其中自组装生物聚合物的自组装时间为约0.8分钟
±
约0.3分钟，其中胶原蛋白基质的剪切储能模量(g’)为约3.1 kpa
±
约0.4 kpa，其中胶原蛋白基质的剪切损耗模量(g”)为约0.4 kpa
±
约0.1 kpa，和其中胶原蛋白基质的压缩模量为约7.7 kpa
±
约1.9 kpa。
[0471]
178. 条款176或条款177的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质为医用移植物。
[0472]
179. 条款176-178中任何一项的胶原蛋白基质，其中医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。
[0473]
180. 条款176-179中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于研究目的。
[0474]
181. 条款176-180中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质被用于药物毒性测试或药物开发。
[0475]
182. 条款176-181中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用紫外辐射进行灭菌。
[0476]
183. 条款176-182中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质相对于未辐照的胶原蛋白基质保持聚合特性。
[0477]
184. 条款176-183中任何一项的胶原蛋白基质，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0478]
185. 条款176-184中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0479]
186. 条款176-185中任何一项的胶原蛋白基质，其中辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0480]
187. 条款176-186中任何一项的胶原蛋白基质，其中灭菌使病毒失活。
[0481]
188. 条款176-187中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照进行灭菌。
[0482]
189. 条款176-188中任何一项的胶原蛋白基质，其中胶原蛋白基质使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0483]
190. 用于恢复和再生组织空隙或缺损中的组织的试剂盒，该试剂盒包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液。
[0484]
191. 条款190的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含液体i型胶原蛋白。
[0485]
192. 条款190或条款191的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含源于猪真皮的i型寡聚胶原蛋白。
[0486]
193. 条款190-192中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
[0487]
194. 条款190-193中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含
有冻干的i型寡聚胶原蛋白和酸的溶液。
[0488]
195. 条款190-194中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液。
[0489]
196. 条款190-195中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液的比率为约9:1。
[0490]
197. 条款190-196中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和0.01 n盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的胶原蛋白溶液的浓度基于冻干的i型寡聚胶原蛋白的干重为约8 mg/ml。
[0491]
198. 条款190-197中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清。
[0492]
199. 条款190-198中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0493]
200. 条款190-199中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0494]
201. 条款190-200中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物包含含有冻干的i型寡聚胶原蛋白和盐酸的溶液，和其中可原位聚合胶原蛋白组合物的溶液已经使用超速离心进行澄清，用500 mj/cm2紫外辐射进行给予，并然后通过无菌膜滤器进行过滤。
[0495]
202. 条款190-201中任何一项的试剂盒，其进一步包含被配置用于将可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的混合物递送至组织空隙或缺损的注射器。
[0496]
203. 条款190-202中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.03 mm-约0.2 mm mgcl2。
[0497]
204. 条款190-203中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约.002 mm-约.02 mm mgcl2。
[0498]
205. 条款190-204中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含少于约.02 mm mgcl2。
[0499]
206. 条款190-205中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含mgcl2。
[0500]
207. 条款190-206中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.003 m-约.03 m kh2po4。
[0501]
208. 条款190-207中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.01 m-约0.1 m na2hpo4。
[0502]
209. 条款190-208中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.001 m-约.04 m kcl。
[0503]
210. 条款190-209中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2 m-约3.0 m nacl。
[0504]
211. 条款190-210中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约.02 n-约
0.2 n naoh。
[0505]
212. 条款190-211中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液进一步包含约0.2重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖。
[0506]
213. 条款190-212中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液包含约0.5重量百分比的葡萄糖或更少。
[0507]
214. 条款190-213中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液不包含葡萄糖。
[0508]
215. 条款190-214中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml。
[0509]
216. 条款190-215中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物中的胶原蛋白浓度为约7 mg/ml-约8 mg/ml。
[0510]
217. 条款190-216中任何一项的试剂盒，其中中和的胶原蛋白填充物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml，所述中和的胶原蛋白填充物为包含可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液的中和的胶原蛋白填充物。
[0511]
218. 条款190-217中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白溶液包含约.005 n盐酸-约0.1 n盐酸。
[0512]
219. 条款190-218中任何一项的试剂盒，其中缓冲溶液被配置为在单一混合步骤中使可原位聚合胶原蛋白组合物聚合，所述单一混合步骤包括混合可原位聚合胶原蛋白组合物与缓冲溶液。
[0513]
220. 条款190-219中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物和缓冲溶液处于单独容器中。
[0514]
221. 条款190-220中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含灭菌小瓶。
[0515]
222. 条款190-221中任何一项的试剂盒，其中单独容器包含双管注射器的单独隔室。
[0516]
223. 条款190-222中任何一项的试剂盒，其中双管注射器包含混合元件。
[0517]
224. 条款190-223中任何一项的试剂盒，其中双管注射器被灭菌。
[0518]
225. 条款190-224中任何一项的试剂盒，其进一步包含用于使用试剂盒的组件的说明。
[0519]
226. 条款190-225中任何一项的试剂盒，其进一步包含至少一种被配置用于局部递送至组织空隙或缺损的治疗剂。
[0520]
227. 条款190-226中任何一项的试剂盒，其中至少一种治疗剂包括化学治疗剂、抗炎剂、抗生素剂、镇痛剂或其组合。
[0521]
228. 条款190-227中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含伤口。
[0522]
229. 条款190-228中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损包含手术伤口。
[0523]
230. 条款190-229中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由肿瘤移除引起。
[0524]
231. 条款190-230中任何一项的试剂盒，其中组织空隙或缺损由乳房肿瘤移除引起。
[0525]
232. 条款190-231中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于保乳手术后再生组织。
[0526]
233. 条款190-232中任何一项的试剂盒，其中试剂盒用于制备组织空隙或缺损中的基质。
[0527]
234. 条款190-233中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用紫外辐射进行灭菌。
[0528]
235. 条款190-234中任何一项的试剂盒，其中由可原位聚合胶原蛋白组合物聚合产生的胶原蛋白基质分别相对于未辐照的胶原蛋白组合物或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。
[0529]
236. 条款190-235中任何一项的试剂盒，其中聚合特性为剪切储能模量。
[0530]
237. 条款190-236中任何一项的试剂盒，其中所述辐射的剂量在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2的范围内。
[0531]
238. 条款190-237中任何一项的试剂盒，其中一剂辐射剂量在约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。
[0532]
239.条款190-238中任何一项的试剂盒，其中灭菌使病毒失活。
[0533]
240. 条款190-239中任何一项的试剂盒，其中可原位聚合胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照进行灭菌。
[0534]
241. 条款190-240中任何一项的试剂盒，其中胶原蛋白组合物或冻干的寡聚胶原蛋白使用uvc辐照和无菌过滤进行灭菌。
[0535]
用于根据本讲授使用的源于猪真皮的纯化的形成原纤维的液体i型胶原蛋白描述于申请者的共同未决的于2019年7月31日递交的美国专利申请序列号16/482,465和国际公开号wo 2018/144496 a1中。两份文件的全部内容均通过参考以其全部结合至本文中。
[0536]
为制备用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白，可使用本领域已知用于制备胶原蛋白的任何方法。在说明性的实施方案中，胶原蛋白可通过在bailey jl, critser pj, whittington c, kuske jl, yoder mc, voytik-harbin sl; collagen oligomers modulate physical and biological properties of three-dimensional self-assembled matrices, biopolymers (2011) 95(2):77-93，kreger st, bell bj, bailey j, stites e, kuske j, waisner b, voytik-harbin sl; polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations, biopolymers (2010) 93(8):690-707，美国专利申请公开号20080268052或美国专利申请公开号20120027732中描述的方法制备，所述文件的每一个均通过参考结合至本文中。
[0537]
在各种说明性实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可从本领域已知的任何合适的胶原蛋白来源获得，条件是至少一部分胶原蛋白包括可聚合寡聚胶原蛋白。示例性的胶原蛋白来源包括粘膜下层组织(美国专利号4,902,508、5,281,422和5,275,826)、心包组织、膀胱黏膜下层组织、胃黏膜下层组织、肝基底膜组织、胎盘组织、卵巢组织、动物尾部组织、皮肤组织(例如gallop等人, preparation and properties of soluble collagens, meth. enzymol. 6: 635-641 (1963)，通过参考结合至本文中)以及通常含有胞外基质的组织。在各种实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白类型可为任何合适的胶原蛋白类型，包括但不限于i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白、iii型胶原蛋白或iv型胶原蛋白或其组合。
[0538]
在一些实施方案中，富含胶原蛋白寡聚体的组织(例如猪皮肤组织)也可被用于获得用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白，或者胶原蛋白可得自产生胶原蛋白寡聚体的细
胞(例如通过重组技术进行改变以表达胶原蛋白寡聚体的细胞)或通过化学交联胶原蛋白以获得胶原蛋白寡聚体(例如使用本领域已知的交联剂)来获得。在一些实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可包含寡聚体或者可由寡聚体组成。在一些实施方案中，胶原蛋白可包含寡聚体和其他形式的胶原蛋白，比如单体、端胶原蛋白和/或去端胶原蛋白。
[0539]
在另一个实施方案中，胶原蛋白可为可溶性胶原蛋白或增溶性胶原蛋白。在其中胶原蛋白为可溶性胶原蛋白或增溶性胶原蛋白的实施方案中，胶原蛋白基本上不含不溶性胶原蛋白，但可含有一些不溶性胶原蛋白。在另一个实施方案中，胶原蛋白由可溶性胶原蛋白或增溶性胶原蛋白组成。
[0540]
在各种说明性实施方案中，胶原蛋白、胶原蛋白组合物、胶原蛋白基质、胶原蛋白溶液、冻干的胶原蛋白和/或缓冲溶液(本文中也被称为中和缓冲液或自组装试剂)可使用本领域已知的灭菌技术进行灭菌，所述灭菌技术包括但不限于环氧丙烷或环氧乙烷处理、气体等离子体灭菌、γ-辐射(例如0.1-10 mrad)、紫外辐射(例如uvc辐照)、电子束、病毒过滤、无菌过滤(例如用0.22
ꢀµ
m过滤器)、氯仿暴露和/或过氧乙酸灭菌及其组合。在该实施方案中，灭菌程序不应当不利地影响胶原蛋白的结构、胶原蛋白的聚合特性或灭菌的胶原蛋白的生物学特性。在各种实施方案中，胶原蛋白可在冻干之前或之后进行灭菌(以下描述冻干程序)。
[0541]
在包括紫外辐射(例如uvc辐照)的实施方案中，由胶原蛋白聚合产生的胶原蛋白基质可分别相对于未辐照的胶原蛋白、未辐照的胶原蛋白组合物、未辐照的胶原蛋白基质、未辐照的胶原蛋白溶液或未辐照的冻干胶原蛋白保持聚合特性。在此类实施方案中，聚合特性可选自剪切储能模量、弹性模量(杨氏模量)、拉伸模量、压缩模量、原纤维结构、蛋白水解降解、细胞信号传导及其组合。在各种实施方案中，紫外辐射剂量(例如uvc辐照)可在约5 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约700 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约600 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约500 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约400 mj/cm2、约5 mj/cm
2-约300 mj/cm2、5 mj/cm
2-约200 mj/cm2、5 mj/cm
2-约100 mj/cm2、5 mj/cm
2-约50 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约700 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约600 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约500 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约400 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约300 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约200 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约100 mj/cm2、约30 mj/cm
2-约50 mj/cm2、约200 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约300 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约400 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约500 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约600 mj/cm
2-约800 mj/cm2、约50 mj/cm
2-约300 mj/cm2、约100 mj/cm
2-约300 mj/cm2或约200 mj/cm
2-约300 mj/cm2的范围内。在本文所述的所有紫外辐射实施方案(例如uvc辐照)中，灭菌使病毒失活。在该实施方案中，“使病毒失活”意指使所有病毒失活，无论是否具有感染性，减少感染性病毒的数量，或者抑制病毒的活性，无论是否具有传染性。
[0542]
在一方面，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可通过本领域已知用于纯化胶原蛋白的方法来纯化。如本文使用的“纯化”意指去除污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和内毒素。在各种实施方案中，胶原蛋白可通过去除污染物来纯化，使得其为至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%纯度。在其他实施方案中，胶原蛋白可被分离。如本文使用的“分离的”意指基本上不含污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和
内毒素。
[0543]
在一些实施方案中，用于本文所述方法和组合物的胶原蛋白可被冻干，并且然后重构以形成用于与如本文所述的缓冲溶液混合的胶原蛋白组合物。在此类实施方案中，冻干胶原蛋白的重构不是用于胶原蛋白聚合的混合步骤。如本文使用的术语“冻干的”意指通过例如真空下冷冻干燥从蛋白、化合物或组合物中去除水。可使用技术人员已知的任何冻干方法。在一些实施方案中，胶原蛋白可在酸中冻干，所述酸例如乙酸、盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸。在其他实施方案中，胶原蛋白可在水中冻干。在进一步的实施方案中，可在冻干期间使用低温保护剂或冻干保护剂或其组合。
[0544]
在一些实施方案中，冻干的胶原蛋白可以重构以形成本文所述的用于与缓冲溶液混合以使胶原蛋白聚合的胶原蛋白组合物。在一些实施方案中，胶原蛋白可在酸性溶液或水中重构。在一些实施方案中，酸性溶液可包含乙酸、盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸。在一些实施方案中，用于重构的酸性溶液可具有约.005 n-约0.1 n、约0.005 n-约0.08 n、约0.005 n-约0.06 n、约0.005 n至约0.04 n、约0.005 n-约0.02 n、约0.005 n-约0.01 n或约0.01 n的酸浓度。在一些实施方案中，酸可为盐酸，并且盐酸可为约0.005 n-约0.1 n盐酸。在其他实施方案中，酸可为盐酸，并且盐酸可为约.01 n盐酸。
[0545]
在一些实施方案中，胶原蛋白组合物或胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度可为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml、约0.1 mg/ml-约5 mg/ml或约0.5 mg/ml-约4 mg/ml。在其他实施方案中，胶原蛋白组合物或胶原蛋白溶液中的胶原蛋白浓度可为约0.05-约5.0 mg/ml、约1.0 mg/ml-约3.0 mg/ml、约0.05 mg/ml-约10 mg/ml、约0.05-约20 mg/ml、约0.05-约30 mg/ml、约0.05-约40 mg/ml、约0.05-约50 mg/ml、约0.05-约60 mg/ml、约0.05-约80 mg/ml、约5 mg/ml-10 mg/ml、约5 mg/ml-20 mg/ml、约5 mg/ml-约40 mg/ml、约5 mg/ml-60 mg/ml、约5 mg/ml-约100 mg/ml、约20 mg/ml-约40 mg/ml、约20 mg/ml-60 mg/ml或约20 mg/ml-约100 mg/ml。
[0546]
在一些实施方案中，胶原蛋白组合物与缓冲溶液在单一步骤中混合以使胶原蛋白聚合。在其他实施方案中，使胶原蛋白组合物与缓冲溶液在不存在镁或锰离子的情况下混合以使胶原蛋白聚合。在一些实施方案中，使胶原蛋白组合物与缓冲溶液混合形成胶原蛋白溶液，并将胶原蛋白溶液在大于约25℃的温度下温育以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。在其他实施方案中，胶原蛋白溶液可在约37℃下温育以促进胶原蛋白溶液中胶原蛋白的聚合。在一些实施方案中，胶原蛋白溶液可在约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、39℃或40℃下温育以促进胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合。在其他实施方案中，胶原蛋白溶液可在约25℃-约40℃下温育以促进胶原蛋白溶液中的胶原蛋白聚合。在其他实施方案中，聚合可在高于20℃的温度下，或在选自约20℃-约40℃的范围的温度下进行。在此类实施方案中，胶原蛋白可聚合以形成与体内发现的那些相似的原纤维。
[0547]
在一些实施方案中，待与胶原蛋白组合物混合以形成胶原蛋白溶液的缓冲溶液可包含约.03 mm-约0.2 mm mgcl2、约.002 mm-约.02 mm mgcl2、小于约.02 mm mgcl2或不含mgcl2。在其他实施方案中，待与胶原蛋白组合物混合以形成胶原蛋白溶液的缓冲溶液可包含约0.3 mm-约3 mm kh2po4、约1 mm-约10 m na2hpo4、约0.1 mm-约4 mm kcl、约.02 m-约0.3 m nacl和约.002 n-约.02 n naoh。在其他实施方案中，待与胶原蛋白组合物混合以形
成胶原蛋白溶液的缓冲溶液可包含约0.5重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖、约0.5重量百分比的葡萄糖或更少或者不含葡萄糖。
[0548]
在一些实施方案中，缓冲溶液可稀释自10x、5x、2x或任何合适的起始浓度，以制备具有任何前述段落中的成分浓度的1x缓冲溶液。在一些实施方案中，根据本讲授的试剂盒可含有用于稀释以制备1x缓冲溶液的、浓度为10x、5x或2x或任何合适的起始浓度的缓冲溶液。在一些实施方案中，10x缓冲溶液可包含呈以下浓度的以下成分：1.37 m nacl0.027 m kcl0.081 m na2hpo40.015 m kh2po40.1 n naoh和，任选地，55.5 mm葡萄糖。
[0549]
在其他实施方案中，1x缓冲溶液可包含呈以下浓度的以下成分：0.137 m nacl0.0027 m kcl0.0081 m na2hpo40.0015 m kh2po40.01 n naoh和，任选地，55.5 mm葡萄糖。
[0550]
在这些实施方案中，naoh存在于缓冲溶液中。在先前已知用于使胶原蛋白聚合的常规方法中，作为胶原蛋白聚合方法中的另外混合步骤单独添加naoh。在一些实施方案中，氯化钙可以约0.4 mm-约2.0 mm的浓度存在于缓冲溶液中。
[0551]
在一些实施方案中，缓冲溶液中的缓冲剂可选自磷酸盐缓冲盐水(pbs)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、哌嗪-n,n
’‑
双(2-乙磺酸) (pipes)、[n-(2-乙酰氨基)]-2-氨基乙磺酸(aces)、n-[2-羟乙基]哌嗪-n
’‑
[2-乙磺酸] (hepes)和1,3-双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷(bis-tris丙烷)。在一些实施方案中，缓冲液为pbs。
[0552]
在一些实施方案中，用于胶原蛋白聚合的胶原蛋白溶液的ph选自约5.0-约11、约6.0-约9.0、约6.5-约8.5的范围，并且在一些实施方案中，ph为约7.3-约7.4。
[0553]
在一些实施方案中，可在胶原蛋白聚合完成之前或之后或者在胶原蛋白聚合期间将以下加入到胶原蛋白溶液中：营养素，包括矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白、维生素；或促进细胞增殖的糖蛋白，比如层粘连蛋白和纤连蛋白；透明质酸；或生长因子，比如表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子β或成纤维细胞生长因子；和糖皮质激素，比如地塞米松，。在其他实施方案中，可将细胞在胶原蛋白聚合完成之前或之后或者在胶原蛋白聚合期间加入到胶原蛋白溶液中。在一些实施方案中，细胞可选自上皮细胞、内皮细胞、中胚层衍生细胞、间皮细胞、滑膜细胞、神经细胞、神经胶质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、肌腱细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多潜能祖细胞(例如干细胞，包括骨髓祖细胞、诱导性多能干细胞)、脂肪细胞、骨原细胞和来自多能干细胞的特定细胞衍生物。
[0554]
在一些实施方案中，提供根据本文所述的任何方法制备的胶原蛋白基质。在一些
实施方案中，胶原蛋白基质可为医用移植物。在一些实施方案中，医用移植物具有选自组织移植材料、可注射移植材料、伤口敷料、止血敷料、用于治疗性细胞的递送媒介物和用于治疗剂的递送媒介物的用途。在其他实施方案中，本文所述的方法可被用于制备用于打印组织或器官的生物墨水配方。在其他实施方案中，胶原蛋白基质被用于研究目的，比如药物毒性测试或药物开发。在一些实施方案中，通过本文所述方法制备的基质可充当植入部位处内源性组织再生长(例如重塑)的基质，并且该基质可具有其在植入或注射部位处替换的损伤或患病组织的特征。
[0555]
在一些实施方案中，本文所述的基质可含有原纤维面积分数(被定义为基质横截面中原纤维占据的总面积的面积百分比)或原纤维体积分数(三维中原纤维占据的总面积的面积百分比)为约0.1%-约100%、约0.5%-约100%、约0.5%-约26%、约1%-约100%、约1%-约26%、约1%-约7%、约1%-约15%、约7%-约26%、约20%-约30%、约20%-约50%、约20%-约70%、约20%-约100%、约30%-约50%、约30%-约70%或约30%-约100%的原纤维，和/或约0.5 kpa-约40 kpa、约30 kpa-100 kpa、约30 kpa-约1000 kpa、约30 kpa-约10000 kpa、约30 kpa-约70000 kpa、约100 kpa-约1000 kpa、约100 kpa-约10000 kpa或约100 kpa-70000 kpa的模量(例如由使用常规力学测试方案获得的应力-应变曲线的线性区域斜率所定义的弹性或线性模量；即刚度)、压缩模量或剪切储能模量。
[0556]
在一些实施方案中，提供包含冻干的胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。在其他实施方案中，提供包含胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒。在这些试剂盒的实施方案中，缓冲溶液可包含约0.03 mm-约0.2 mm mgcl2、约0.002 mm-约0.02 mm mgcl2、小于约0.02 mm mgcl2，或者缓冲溶液不包含mgcl2。在各种实施方案中，缓冲溶液进一步包含约0.003 m-约0.03 m kh2po4、约0.01 m-约0.1 m na2hpo4、约0.001 m-约0.04 m kcl、约0.2 m-约3.0 m nacl和约0.02 n-约0.2 n naoh。在其他实施方案中，缓冲溶液可包含约0.2重量百分比-约5重量百分比的葡萄糖、约0.5重量百分比的葡萄糖或更少或者不含葡萄糖。
[0557]
在含有盐酸溶液的试剂盒的一些实施方案中，盐酸溶液可包含约0.005 n盐酸-约0.1 n盐酸。在含有冻干的胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒的实施方案中，冻干的胶原蛋白、盐酸溶液和缓冲溶液可在单独的容器中提供。在含有胶原蛋白组合物和缓冲溶液的试剂盒的实施方案中，胶原蛋白组合物中的胶原蛋白的浓度可为约0.1 mg/ml-约40 mg/ml或约0.1 mg/ml-约10 mg/ml。在一些实施方案中，胶原蛋白组合物的浓度在约7 mg/ml-约8 mg/ml之间。在一些实施方案中，胶原蛋白溶液和缓冲溶液混合物中的胶原蛋白浓度为约6.3-约7.2 mg/ml。在一些实施方案中，中和后，配方产生具有一个或多个以下特征的可聚合胶原蛋白：最终胶原蛋白浓度：6.3-7.2 mg/ml；聚合时间：0.5-1.1分钟；剪切储能模量：2.7-3.5 kpa；剪切损耗模量：0.3-0.5 kpa；和/或压缩模量：5.8-9.6 kpa。在此类实施方案中，胶原蛋白组合物和缓冲溶液可在单独的容器中提供，所述容器比如灭菌小瓶或包含混合元件的双注射器单独隔室。在本文所述的任何试剂盒的实施方案中，试剂盒可进一步包含用于使用试剂盒的组件的说明。在本文所述的任何试剂盒的实施方案中，缓冲溶液可以能够使用单一混合步骤使胶原蛋白聚合，该步骤包括使缓冲溶液与在盐酸溶液中重构的冻干的胶原蛋白或与胶原蛋白组合物混合。
[0558]
在一些实施方案中，提供具有呈冻干形式的胶原蛋白的试剂盒，并且该试剂盒进一步包含如本文所述的缓冲溶液和用于重构冻干的胶原蛋白的酸溶液，所述酸比如乙酸或
另一种稀酸，包括例如盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸。
[0559]
以下实施例更详细地说明具体实施方案。提供这些实施例仅用于说明目的，并且不应解释为以任何方式限制本发明。
实施例
[0560]
实施例1-方法和材料由geniphys制备并评估了两种胶原蛋白组织填充物配方，它们在单一的专有制造步骤中有所不同；然而，由于没有观察到性能差异，因此将结果合并并作为单一配方呈现。对于两种配方，均使冻干的i型寡聚胶原蛋白溶解于0.01 n盐酸中，以获得估计为8 mg/ml的溶液(基于冻干材料的干重)。溶解之后，将溶液使用超速离心(142,400 x g)进行澄清。然后使配方1通过无菌0.2 μm膜滤器(sterlitech, kent, wa)进行过滤，并经受下述质量控制测试。在通过相同类型的膜滤器的过滤和质量控制测试之前，将配方2使用254-nm波长的准直束以500 mj/cm2紫外(uv)辐射进行给予。根据geniphys标准程序制备专有中和溶液并通过0.2
ꢀµ
m过滤器进行无菌过滤。为制备手术中使用的试剂盒，将注射器用配方1、配方2和中和溶液无菌地进行填充。所用寡聚胶原蛋白溶液与中和溶液的体积比为9:1。
[0561]
基于对分子纯度、自组装动力学和粘弹性力学特性的评价，定义胶原蛋白配方的材料特性并控制其质量。对于4个独立的胶原蛋白原型批次(n=4)，以6-8个重复(n=6-8)测量自组装动力学和粘弹性特性。为评估胶原蛋白纯度，根据已建立的方法，使用4-20%和6%凝胶(invitrogen)对胶原蛋白样品和分子量标准品(novex seeblue plus2, invitrogen, carlsbad, ca)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)并用考马斯蓝(sigma-aldrich, st. louis, mo)染色。使用天狼星红(直接红80, sigma-aldrich)测定法确定胶原蛋白浓度。进行时间依赖性振荡剪切流变测定以确定自组装动力学和剪切储能(g’)和损耗(g
’’
)模量。简言之，在具有40-mm平行板几何形状和溶剂捕集器的ar2000流变仪(ta instruments, new castle, de)上测试中和的寡聚胶原蛋白样品。在样品加载之前和测试的前2分钟期间，将珀耳帖板保持在4℃下。在此初始的2分钟以1%应变进行振荡剪切测量，并在温度升至37℃之后继续测量10分钟。在振荡剪切测试后，使样品在20
ꢀµ
m/s的应变速率下经受无侧限压缩测试。为定义基质形成的动力学，创建剪切储能模量随着时间推移的图表，并将胶原蛋白达到其最大刚度(g’)的时间定义为聚合时间。该点也被用于定义基质g’和g
’’
值。为获得压缩模量，从无侧限压缩数据创建应力-应变曲线，并在指定的低应变区域(20-40%应变)计算斜率，对应于文献中报道的关于软组织(例如人类乳房)的低应力/应变模量。测试4批独立的原型胶原蛋白，每批重复6-8次(n=4批；每批n=6-8个重复)。
[0562]
实施例2-猪模拟肿块切除模型小型猪的乳腺通常被用于测试新策略，以改善乳房手术程序(包括肿块切除术和乳房切除术)后的功能和美容结果。使用普渡动物管理和使用委员会(purdue animal care and use committee)批准的方案，对体重在45-65 kg之间的雌性尤卡坦小型猪进行模拟肿块切除术。在两项研究中总共使用8头猪，6头用于纵向研究和2头用于辐射研究。对于两个研究，乳房均被随机分配到实验组和对照组，无填充和无手术分别充当阴性和阳性对照。纵向研究的术后评价在1、4和16周的时间点(每个时间点2只动物)进行，以实现对于胶原蛋白填充物组的12个重复(n=12；对于每种胶原蛋白填充配方n=6)及对于每个无填充和无手术
组的6个重复(n = 6)。对于辐射研究，术后评价在手术后4和16周进行，对于胶原蛋白填充物组重复6次(n = 6)，对于无填充组重复3次(n = 3)，和对于无手术组重复1次(n = 1)。最尾部的一对乳腺充当未辐照的未手术对照。将来自辐照的动物的结果与来自纵向研究的非辐照动物进行比较。每个时间点的术后评价包括：乳房/手术部位的总体外观和均匀性/一致性的半定量评分、超声检查、放射检查、总体外植体评估和组织病理学分析。半定量评分和组织病理学分析两者均以盲法进行。
[0563]
将动物麻醉、插管并置于背卧位。对于每个模拟肿块切除术，使用手术刀造成3-cm的皮肤切口，切口横向取向并置于紧邻每个乳房的乳头-乳晕复合体的外侧。使用电烙术切除大约四分之一的乳腺组织，并使用标准体积移位法测量其体积。切除的正常乳腺组织的子集经受无侧限压缩测试(应变速率：1 mm/min，压缩模量在20-40%应变的线性区域中确定)以表征力学特性。将钛标记夹(ethicon small ligaclips, west cmr, clearwater, fl)置于动物子集中以促进胶原蛋白和无填充处理的手术部位的切缘识别。对于胶原蛋白填充物处理的部位，使用中和的液体胶原蛋白来填充手术空隙。阴性对照部位没有接受填充(未处理)。未经受手术的猪乳房子集充当阳性对照。使用可吸收缝线闭合所有手术部位，并用非粘附垫(mckesson, san francisco, ca)和tegaderm (3m, st. paul, mn)敷料绷扎。每天基于食欲、态度、运动和排泄情况监测动物的健康状况。
[0564]
实施例3-辅助性肿块切除术后辐射为解决放射治疗如何影响对胶原蛋白组织填充物的组织反应的问题，将两只动物在模拟肿块切除术和治疗后用放疗处理。猪乳房被再次随机分配到治疗组，无填充治疗和其上没有进行手术的乳房分别充当阴性和阳性对照。手术后两周，使用基于ct的3d-crt技术，使用具有120叶多叶准直器的6 mv varian ex临床直线加速器(varian, palo alto, california)在连续5天时段中向近颅侧的5对乳腺输送20 gy的总剂量。近尾部的一对乳腺作为非辐照的对照排除在外。
[0565]
实施例4-术后程序和评价在指定时间点，将动物麻醉，并使用半定量评分系统评估每个乳房的总体乳房/手术部位外观，包括红斑/焦痂形成和水肿形成以及乳房均匀性/一致性评分，如图10中所示。另外，用mindray m7超声仪(mindray north america, mahwah, nj)和线性4-7 mhz换能器对每个乳腺进行超声成像。安乐死后，对每个乳房进行乳房切除术，保持所有手术部位、任何植入物和周围组织。进行组织病理学分析前，将每个乳房置于10%缓冲福尔马林中，并使用innovet select radiograph装置(summit, niles, il)进行射线拍照，所述装置具有使用genesis vxvue采集软件(genesis digital imaging, los angeles, ca)的安装的genesis vet dr板。
[0566]
实施例5-组织病理学在石蜡包埋和切片之前，将福尔马林固定的外植组织一分为二并成像。将切片用苏木精-伊红(h&e)染色。为检测上皮细胞，将切片以1:100的稀释度对广谱细胞角蛋白(ab9377, abcam, cambridge, ma)进行染色并然后以6 g/ml用二级dylight 488山羊抗兔(di-1488, vector labs, burlingame, ca)处理。将细胞核用dapi (4’,6-二脒基-2
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苯基吲哚,二盐酸盐; en62248, pierce biotechnology, rockford, il)进行复染。使用aperio versa 8全玻片扫描仪(leica biosystems, buffalo grove, il)获得图像。
[0567]
实施例6-液体胶原蛋白符合几何形状并转变为具有类似于软组织特性的稳定的纤维状基质评估了专门设计以充当用于损伤或缺损性组织(比如通过bcs创建的组织空隙)的恢复性和再生性填充物的胶原蛋白组织填充物配方。胶原蛋白组织填充物配方的定义基于其材料组成上和力学上的特性，包括分子纯度、胶原蛋白含量、聚合(自组装)时间以及在经受振荡剪切和无侧限压缩加载时的粘弹性特性。为评估组织填充物的生物相容性和有效性，由受过专门培训的乳腺外科医生对猪的乳房(乳腺)进行模拟肿块切除术。然后使用原型配方填充一部分乳房空隙，并将手术结果与未处理的缺损(无填充；阴性对照)进行比较，后者代表bcs的护理标准。其上未进行手术的正常乳房充当阳性对照。为定义组织反应时间线并了解组织填充物的作用机制(组织植入反应)，在1、4和16周的时间点进行了纵向研究。在1周的时间点，使用少量部位来确定材料是否影响或干扰手术再切除程序。然后进行第二项研究，以评价组织填充物及其相关组织反应如何受到辐照的影响，辐照通常被用作术后疗法以预防局部癌症复发。结果测量包括对所有乳房和手术部位的目视检查和触诊，以及对红斑、焦痂、水肿和乳房均匀性/一致性的半定量评价。另外，使用超声检查和放射检查对整个乳房进行成像。最后，在安乐死后，收集乳房外植体进行总体和组织学分析。综合起来，这些数据为在保乳手术期间使用组织填充物后改善愈合结果提供支持。
[0568]
自geniphys (zionsville, indiana)作为试剂盒获得胶原组织蛋白填充配方。如图1a所示，该试剂盒包括含有在稀酸(0.01 n盐酸)中的无菌i型寡聚胶原蛋白的注射器、含有无菌中和溶液(缓冲液)的注射器、无菌鲁尔锁适配器和无菌施药器尖端。这些试剂盒的寡聚胶原蛋白成分根据astm f3089-14的可聚合胶原蛋白指南从封闭式猪群的皮制造并进行质量控制。在紧接使用之前，将两个注射器与鲁尔锁适配器(图1b)连接，并且胶原蛋白和中和试剂以 9:1的比率混合，使胶原蛋白溶液达到生理ph和离子强度。混合之后，粘性液体可被注射到各种几何形状中，在所述几何形状中粘性液体在转变成物理稳定的纤维状胶原蛋白基质之前符合该形状(图1b)。为证明胶原蛋白纯度，使用4-20%和6%凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。凝胶揭示了寡聚胶原的蛋白条带模式特征为没有可检测到的污染非胶原性蛋白或其他类型的胶原蛋白(图1c)。测量其他功能性能参数，包括中和胶原蛋白组织填充物溶液的聚合时间和由组织填充物形成的基质的粘弹性特性，概述提供于图1d中。具体地讲，中和之前寡聚胶原蛋白的浓度为约7.7 mg/ml。中和后，基质形成反应平均仅花费不到1分钟，如在37℃下流变测量的。当在振荡剪切和无侧限压缩中分析时，所形成的基质表现出固体样行为，剪切储能(g)和损耗(g”)模量分别为3.16
±
0.16 kpa和0.40
±
0.02 kpa，和压缩模量为7.67
±
0.42 kpa。尽管可使用寡聚胶原蛋白以创建广泛种类的具有组成上和力学上的特性(即弹性模量和强度值)的可调谐组合的聚合物材料，但此处开发和测试的特定组织填充物配方被设计为具有材料特性的特定组合，以表现出类似于软组织的粘弹性力学特性。
[0569]
实施例7-胶原蛋白组织填充物基质保持体积并诱导血管化和乳房组织形成而不引起一般在愈合期间观察到的炎症反应或一般对组织植入反应观察到的异物反应。
[0570]
为评估组织填充物改善软组织缺损的外观、结构和功能恢复的有效性，进行了纵向研究，涉及对正常、健康的尤卡坦小型猪的乳房进行模拟乳房切除程序(图2)。雌性小型猪基于其大小以及与人类的解剖学和生理学相似性而代表用于此类转化研究的优选大型
动物模型。另外，猪通常具有12个乳腺(乳房)，这减少了该研究所需的动物总数，因为每个乳房均可充当实验或对照组。手术之前，猪乳房被随机分配到治疗组，其中无填充和没有接受手术的乳房分别充当阴性和阳性对照。所有手术程序和乳房评估均由受过专门培训的乳腺外科医生进行。切除大约四分之一的乳房组织体积(图2e)，其范围为2-5.5 ml的组织(平均~3 ml)，具体取决于单个乳房大小(图2a)。对于组织填充物处理的乳房，将液体胶原蛋白混合并立即注射到组织空隙中，在所述空隙中液体胶原蛋白符合复杂的几何形状，随后在这些情况下于不到5分钟内转变为纤维状胶原蛋白基质(图2b-d)。乳腺外科医生在填充每个缺损时运用她的判断力，所应用的胶原蛋白体积随着缺损大小和几何形状而变化。手术空隙用至少与移除组织相同体积的胶原蛋白进行填充，其中大多数接受1-2 ml更多的胶原蛋白体积。阴性对照部位未进行处理(无填充)，这与bcs程序的护理标准一致。所有切口均使用可吸收缝线闭合并绷扎(图2f)。在整个研究期间，所有动物均保持体重(
±
5 kg)，手术部位保持闭合，并且未发生有关程序的并发症(图2g)。
[0571]
与在女性和男性中观察到的情况一致，发现在单个动物内和单个动物之间两者中，猪乳房在体积、一致性和组成方面均有所不同。在微观水平上(图9)，乳腺包括多个叶，这些叶由组织为簇的较小的分泌小叶和最终经乳头离开皮肤的导管系统(通道)组成。小叶和导管由主要由纤维i型胶原组成的小叶内基质支撑。另外，在叶之间发现了胶原结缔组织(小叶间基质)，为乳房提供支撑并确定其形状。主要决定乳房大小的脂肪组织填充腺体和纤维结缔组织之间的空间。当在无侧限压缩中进行评估时，位于近颅侧(朝向头部)的乳房相对僵硬，平均压缩模量为19.0
±
12.9 kpa。随着向尾部(朝向尾部)进展，乳房的脂肪组成增加并且更柔软，大多数近尾部乳房的平均压缩模量为6.56
±
2.51 kpa。
[0572]
为评价胶原蛋白填充物的生物相容性和组织反应，在指定的1、4和16周时间点麻醉动物。根据图10中的标准，所有乳房进行目视检查、触诊和半定量评分。胶原蛋白处理的乳房和无填充对照乳房在任何时间点均未显示出红斑(发红)或焦痂(脱落、死亡组织)的迹象。其上进行手术的乳房在1周时有明显的轻度水肿；然而，胶原蛋白和无填充组两者的肿胀程度相似，并且之后不久消退。在所有3个时间点，胶原蛋白处理的乳房的均匀性/一致性评分均与无填充对照相似，从1周时的大约1.2下降至16周时的0.25 (图3a)。此类发现是重要的，因为其表明胶原蛋白填充物不会创建可在临床上被解释为残留疾病或患者不适来源的乳房不一致。所有正常乳房均收到零的评分。另外，当乳腺外科医生对胶原蛋白处理的乳房进行模拟手术再切除时，填充材料不会影响或干扰程序。
[0573]
胶原蛋白填充物的生物相容性和组织反应基于乳房外植体横切面的总体和组织学检查进一步确定，并与无填充和正常乳房对照进行比较。从这些分析中，显然胶原蛋白填充物保持其体积(最小化缺损收缩)，具有高度生物相容性，并且在不存在一般见于未治疗的组织空隙愈合的炎症反应或一般对组织植入反应观察到的异物反应的情况下表现出组织反应。随着细胞浸润组织填充物基质并产生新的乳房组织，其呈现出难以从周围正常组织中大体辨别的组织样外观(图3b)。在这种情况下，手术夹可用作初始缺损切缘的标记(图3b、4)。在第1周的组织学分析时，胶原蛋白填充物在组织空隙内很明显，在所述组织空隙中其呈现为均匀的浅粉色(嗜酸性)染色材料(图4)。填充物周围通常为出血带、纤维蛋白和少量白细胞，这可归因于组织的手术操作(图4a)。在填充物-宿主组织界面处，有局灶性大面积的增殖性成纤维细胞(间充质细胞)，很少有小口径血管浸润基质边缘。周围的乳房组织
看起来基本正常，邻近手术部位具有重塑区域。这些区域含有重塑上皮细胞的聚集体，其中一些似乎为小管，而另一些则形状更不规则，提示有发育不全的小叶(图4a)。值得注意的是，没有作为常规可植入材料的特征的炎症介导的异物反应或活跃生物降解的迹象。在4周时间点时，成纤维细胞与新形成的脉管系统一起延伸到胶原蛋白填充基质的更深部分中，浸润细胞在外围最丰富并向中心进一步减少(图4a)。观察到上皮细胞的多灶性聚集体，这再次与腺体结构的前体一致(图4a)。到16周时，基质完全细胞化，呈现为成熟、重塑的胶原纤维和束，一些部位显示出小的可辨别的无细胞嗜酸性填充材料区域。小口径血管在整个基质中弥散存在且均匀分布(图4a)。在血管化的胶原蛋白基质内，存在对细胞角蛋白染色呈阳性的新形成的小叶和导管，以及脂肪组织，尤其是在外围处(图11a、b、4a)。腺体形态发育良好且成熟，无明显病理学。
[0574]
相比之下，在1周时，血肿形成在无填充乳房外植体的总体和组织学评估两者时均很明显(图3b、4b)。出血、纤维蛋白凝块和白细胞(包括中性粒细胞和巨噬细胞)在肿块切除部位内明显。出血区域内混杂着增殖性成纤维细胞和很少的小口径血管，与修复性伤口愈合相关的维管瘢痕组织一致。在缺损区域周围还有明显的具有活跃炎症的散在坏死区域。到4周时，这些组织缺损收缩，如大体上明显的夹移位和组织学上呈星状的收缩的外观所证明的(图4b)。维管瘢痕组织在缺损区域内显著，在整个缺损边界中和其附近注意到多个小的坏死和炎症区域(图4b)。在缺损周围的组织区域中观察到腺体和脂肪组织的活跃重塑(图4b)。到16周时，纤维瘢痕组织的密度增加，呈现为由肌成纤维细胞密集组成的平行排列的纤维组织的不同取向的漩涡。尽管在缺损周围鉴定了小叶、导管和脂肪组织，但在瘢痕组织周围发现了多个具有发育不良的形态学特征的坏死腺体，如通过炎症介质的存在和残留的低水平弥散性细胞角蛋白染色所证明的(图4b、11c、11d)。
[0575]
实施例8-组织填充物基质不会影响对声谱图和射线照片的解读乳腺摄影检查和超声检查通常被用作bcs的后续诊断程序，以监测癌症复发情况。为确保胶原蛋白填充物不会影响或干扰图像解读，在安乐死之前对所有猪乳房进行超声，并在乳房切除术后对每个个体的整个乳房拍摄射线照片。在16周研究期间获得的声谱图显示，组织填充物基质不会模糊或阻止对乳房组织的询查，也不会产生任何意外的回声区域(图5a)。在1周时，在胶原蛋白处理的乳房内观察到一个大的、形状不规则的低回声区域，含有不同程度的不均匀回声(图5a)。此类信号并不令人意外，因为填充物微观结构代表随机取向的胶原蛋白原纤维网状结构，测量到直径为约400 μm。尽管这些区域似乎随着时间的推移保持其体积，但它们逐渐呈现出正常组织的外观，这确证了在总体外植体内和组织学上观察到的细胞化和血管化(图5a)。无填充处理的空隙在1周时也显示出与血清肿和出血一致的不规则形状的低回声区域(图5a)。到4周和16周时间点，这些区域的大小减小，产生与收缩和瘢痕形成一致的不均匀信号(图5a)。
[0576]
组织填充物基质也不干扰射线照片的解读，而是在整个研究期间显示出与正常组织一致的不透明度(图5b)。另外，射线照片提供胶原蛋白基质随着时间的推移保持空隙体积且夹移位有限的进一步证据(图5b)。大多数未处理(无填充)的手术空隙在1周时也产生似乎与正常组织一致的射线照片，少数部位显示与气囊、血清肿或血肿一致的明显变暗区域(图5b)。在4周和16周时间点观察到的手术夹的进行性移位提供了随着时间推移的缺损收缩和瘢痕形成的进一步证据(图5b)。
[0577]
实施例9-辐照并不对胶原蛋白填充物或组织植入反应产生不利影响为确定胶原蛋白填充物是否与放射治疗相容，一队动物在模拟肿块切除程序后两周经受腹侧辐照。为每只动物产生基于计算机断层扫描(ct)的三维适形治疗(3d-crt)计划，以使用来自varian ex临床直线加速器的6 mv x-射线在连续5天时段中向近颅侧的5对乳腺输送20 gy的总剂量。近尾部的一对乳腺作为非辐照的对照排除在外。经辐照的动物随着时间的推移显示出皮肤色素沉着增加，如通过皮肤颜色变暗所证明的(图2g)，这在经历治疗性辐照的人类也是可预期的。在微观水平上，表皮的中度增生或增厚明显，其中黑色素沉积增加，尤其是在基底表皮内(图9)。在16周时，乳房组织明显更僵硬，这也是对放射治疗观察到的常见变化。另外，脂肪坏死及导管和腺体非典型增生的迹象明显(图9)。
[0578]
除皮肤色素沉着的差异外，所有的乳房和手术部位均愈合良好，看起来与非辐照动物的那些相似。在相应的时间点，相对于非辐照动物，胶原蛋白填充物处理组和无填充组的平均乳房均匀性/一致性评分在辐照动物中稍微更高，唯一的例外为16周胶原蛋白填充物处理组，其中评分相似(图6a、3a)。对总体外植体和组织学横截面的检查显示，辐照对组织填充物基质或其相关组织反应没有明显的不利影响；然而，主观上，辐照部位的总体愈合时间线似乎略有延迟(图6b、6c)。在为期16周的研究期间，胶原蛋白填充物在手术部位内持续存在，支持从填充物-宿主组织界面向内进行的进行性细胞化、血管化和乳房组织生成。如所预期的，无填充组显示出收缩和纤维瘢痕组织的发展(图6b、6d)。辐照和非辐照动物的声谱图(图7a)和射线照片(图7b)非常相似，再次证实胶原蛋白填充物没有受到辐照的负面影响并且没有产生任何可疑的成像异常。
[0579]
实施例10-结果讨论在目前的工作中，猪乳房的大小和组织组成各不相同，从而产生在质量和数量两者上均很明显的一致性差异。所测量的压缩模量范围(约6-19 kpa)包括在女性中观察到的乳房一致性，据报道其范围为0.7-66 kpa，具体取决于乳房组成(例如纤维腺体相对于脂肪)和测试参数(例如应变速率、预处理)。未经处理的乳房缺损的愈合反应与在bcs后的女性中观察到的相似，产生的瘢痕组织在结构和功能上与正常乳房组织不同。16周的纵向研究显示出在整个导致瘢痕形成的修复性伤口愈合的经典重叠阶段中的进展，包括止血和炎症、增殖和重塑，如图8a中所示。，机械强度相较于正常乳房ecm较弱的初始纤维蛋白凝块和临时基质促进缺损的显著收缩，如通过夹移位和星状瘢痕组织形态所证明的。随着时间推移的瘢痕形成和重塑过程可能为bcs最不可预测和令人不安的方面，因为已知其会促进疼痛、乳房轮廓和一致性扭曲以及感觉丧失，所有这些均会对女性在情感和心理上产生负面影响。
[0580]
用长效纤维状胶原蛋白基质填充缺损体积，该基质自然代谢和重塑而不是活跃降解，导致其中免疫介质基本上不存在的愈合反应，并且结果更具再生性而不是修复性(图8b)。基于这些结果，在图8b中描绘所提出的胶原蛋白填充物的再生性愈合反应。由于可注射的原位形成基质填充并符合缺损且与周围宿主组织有效整合，因此其重建跨组织的结构和力学连续体，已知这对于无瘢痕愈合和组织形态发生是重要的。值得注意的是，胶原蛋白填充物的压缩模量(7.67
±
0.42 kpa)落入猪和人类两者的乳房力学特性的范围内。胶原蛋白填充物的致密微观结构和压缩特性有效地抵抗由周围正常组织以及浸润细胞所施加的收缩力。另外，由于基质的力学特性与软组织相似，因此其不会产生任何令人担忧的可触知
的乳房不一致。从转化的角度来看，这对于患者的满意度和舒适度以及对于保持通过触诊检测复发性癌症的能力是重要的。
[0581]
因为由组织填充物形成的胶原蛋白原纤维含有多个功能性细胞和分子结合结构域，所以基质可有效地参与生化和力学化学信号传导两者，正如组织ecm所进行的那样。与常规可植入材料不同，基质最初由成纤维细胞样间充质细胞以及血管形成细胞而不是炎症介质填入。快速和稳健的新血管化反应与其他体内研究一致，其中寡聚体已被植入到其他微环境中并被用于体外研究血管形成的潜在机制。当这些前线细胞随着时间向基质中心更深入地推进，组织新生随之而来，伴随形成脂肪组织和乳腺，包括分泌小叶和导管。有趣的是，新形成的小叶在4和16周的时间点尤为明显，让人想起在未产(孕前)乳房中发现的那些，因为它们非常缺乏巨噬细胞浸润。总的来说，对胶原蛋白填充观察到的再生性组织反应与同组织发育和形态发生(包括乳腺)相关的过程有许多相似性，突出了保持基质胶原蛋白及其相关的力学生物学连续体的重要性。
[0582]
作为该项研究的一部分，还证明了胶原蛋白填充物不会受到放射治疗的负面影响，并且不会影响诊断成像程序的解读。在本研究中，在模拟肿块切除术后2周应用辐照，这处于bcs后的辅助放疗施用范围内。具有快速细胞更新的肿瘤和组织，比如皮肤的表皮层，对辐照效应最敏感，其损伤程度取决于总辐射剂量和输送辐射的时间。辐照导致皮肤色素沉着过度，这是类似于人类显示的晒伤或晒黑反应的预期副作用，以及中等水平的脂肪坏死及腺体和导管增生。对于胶原蛋白填充物组和无填充处理组两者，愈合进展与相应的非辐照组类似；然而，基于乳房一致性评分和组织病理学分析，愈合速率似乎稍慢。此类结果并不令人意外，因为已知辐照会导致伤口愈合延迟。基于联合的组织病理学、x-射线和超声分析，确定胶原蛋白填充物及其相关的信号传导能力基本上不受辐照的影响。射线照片和超声波图还表明，胶原蛋白填充物没有产生可疑的伪影。这已为脂肪移植的主要缺点，其中经这些诊断成像技术已检测到乳房组织的广谱的变化，从看起来良性的脂质囊肿到疑似为恶性的发现，比如微钙化、局灶性肿块和推测不透明度增加的区域。
[0583]
鉴于该项工作代表早期的原理验证评估，这些研究并非没有限制。首先，由于猪和人类之间的乳房大小不同，进行象限切除术，移除大约25%的猪乳房体积。缺损体积范围为2-5.5 ml，平均缺损体积为约3 ml。尽管很少(如果有的话)对女性进行象限切除术，但这些绝对缺损体积落入人类临床程序的范围内。具体地讲，已公开的人类临床报告表明，67%和82%的乳腺肿瘤直径(体积)分别为≤1.9 cm (≤3.6 ml)和2.9 cm (≤12.8 ml)。尽管需要另外的研究来确定缺损大小如何影响材料性能，但基于观察到的材料作用模式和组织植入反应，预计不会产生有害结果。然而，预计完成细胞化和愈合的时间将直接随缺损体积而变化。其次，由于评估的最长时间点为16周，因此需要另外的动物和人类临床研究来确定长期(即6个月或更长时间)的胶原蛋白填充物结果。这些大型动物研究的第三个限制为猪没有癌症。由于该项大型动物研究中使用的猪不患有癌症，因此无法充分评估胶原蛋白填充物对肿瘤促进和复发的影响。由于多种原因，预计胶原蛋白填充物不会对肿瘤学安全性造成风险。首先，由于乳腺外科医生将能够更可预测地保持乳房轮廓和一致性，因此他们将更具有有关于切除更多组织以实现负切缘的信心。另外，本发明人已经显示，胶原蛋白填充物不诱导炎症或异物反应，这尤其重要，因为与炎症相关的巨噬细胞浸润和其他过程(例如细胞因子释放)已牵涉肿瘤促进。另外，当在体外用各种癌细胞类型测试时，发现寡聚胶原蛋白
基质的高原纤维密度/刚度可限制肿瘤细胞的增殖和迁移。最后，为进一步对抗肿瘤复发，可易于将化学治疗或其他抗癌剂添加到基质形成反应中，以实现靶向和局部递送。这将大幅减少施用的药物量并最小化与全身施用相关的副作用。
[0584]
总而言之，描述了原位形成并由胶原蛋白聚合物形成的恢复性和再生性组织填充物，其似乎满足外科医生的需求并克服与常规可植入材料相关的主要限制。这是关于持续存在、保持其体积并诱导进行性乳房组织(包括乳腺、导管和脂肪组织)生成的乳房填充物的第一份报告。另外，研究的发现对再生医学具有重要意义，表明炎症减少以及胶原蛋白结构和力学连续体的维持使愈合平衡从修复(瘢痕形成)转向再生。这项工作为未来的临床前和临床研究奠定基础，在所述研究中可进一步验证这种组织填充物的转化潜力，用于bcs及其他组织恢复和重建需求。
[0585]
实施例11-骨骼肌恢复和再生将尤卡坦小型猪置于全身麻醉下。如图12中所示，在背颈部的骨骼肌和脂肪区域内创建缺损(约2 cm x 2 cm)。组织空隙用符合空隙几何形状的液体胶原蛋白填充物进行填充。在应用之后约1分钟内，液体胶原蛋白原位自组装(聚合)，形成纤维状胶原蛋白基质，其恢复组织连续性和形态。然后缝合闭合该部位。在创建组织缺损后11周，收获缺损部位以及周围正常组织，并将其置于10%缓冲福尔马林中。将福尔马林固定的外植组织一分为二，包埋于石蜡中并切片。将切片用苏木精-伊红(h&e)和马森三色染色法进行染色。图13显示植入后11周胶原蛋白基质内新形成的骨骼肌和脂肪(adipose) (脂肪(fat))组织。在图13中，c表示胶原蛋白基质，f表示脂肪，m表示骨骼肌，和箭头表示相关的微脉管系统。
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实施例12-组织填充物试剂盒和相关的性能特征组织填充物包含源于猪真皮的寡聚胶原蛋白和中和缓冲液。在一些实施方案中，这种原位形成胶原蛋白装置可作为含有以下的一次性使用试剂盒提供，如图14中所示：含有在稀(0.01 n)盐酸中的胶原蛋白溶液(10 ml)的无菌玻璃小瓶、含有中和缓冲液(自组装试剂；2 ml)的无菌玻璃小瓶、两个无菌10-ml注射器、两个无菌无针小瓶适配器、无菌鲁尔锁连接器和无菌施药器尖端。在其他实施方案中，可提供具有静态混合尖端的预填充双管注射器。这种双管产品形式可被用于支持在施用期间混合胶原蛋白溶液和中和缓冲液。
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表1提供中和缓冲液成分及其在使胶原蛋白溶液达到生理ph、离子强度和渗透压以诱导基质形成反应中的作用的概述。
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表1. 中和缓冲液(自组装试剂)成分的概述。
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如表1所示，中和缓冲液代表10x磷酸盐缓冲盐水，当与胶原蛋白溶液混合时，使胶原蛋白溶液达到生理条件，包括ph、渗透压和离子强度。在使用无针小瓶适配器在一个注射器中吸取9 ml胶原蛋白溶液并在另一个注射器中吸取1 ml中和缓冲液之后，用户将两个注射器用鲁尔锁连接器连接起来，并彻底混合两种试剂。混合之后，可注射中和的胶原蛋白溶液以填充和适应组织空隙和缺损，包括难以接近和/或形状不规则的那些。应用后，胶原蛋白经历经分子自组装的原位基质形成反应。组织填充物装置通过提供适合于细胞化和血管化的固体纤维状胶原蛋白基质(图15a)实现其预期用途，保持用于组织恢复的支持性环境。在一些实施方案中，中和缓冲剂成分包括葡萄糖，如表1中所示。在其他实施方案中，中和缓冲液成分不含葡萄糖。
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表2概述根据本讲授的中和缓冲液(自组装试剂)成分的技术和性能特征。
[0591]
上述详述和附图已通过解释和说明的方式提供，并且并不预期限制所附权利要求的范围。本文所示的目前优选的实施方案的许多变化对于本领域的普通技术人员为显而易见的，并且仍处于所附权利要求及其等效物的范围内。
[0592]
应当理解，所附权利要求中叙述的元件和特征可以不同方式组合以产生同样落入
本发明范围内的新权利要求。因此，鉴于以下所附的从属权利要求仅从属于单个独立或从属权利要求，应当理解，可备选地使这些从属权利要求从属于来自任何前述权利要求(无论独立权利要求还是从属权利要求)的备选方案，并且此类新的组合应被理解为形成本说明书的一部分。
再多了解一些
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