槲皮素在制备代谢相关脂肪性肝病预防或治疗药物中的应用

1.本发明涉及代谢相关脂肪性肝病防治领域，具体涉及的是槲皮素在制备代谢相关脂肪性肝病预防或治疗药物中的应用。


背景技术：

2.代谢相关脂肪性肝病在全球所有肝病中发病率中很高，估计全球约有25％的人口患有这种疾病；代谢相关脂肪性肝病可进一步发展为纤维化、肝硬化甚至与代谢相关脂肪性肝病相关的肝细胞癌。预计未来几年代谢相关脂肪性肝病的发病率将增加高达56％。到2030年，代谢相关脂肪性肝病相关hcc的发病率预计将急剧增加，与2016年相比，中国、法国和美国的发病率分别增加82％、117％和122％。然而，目前还没有药物被批准用于治疗代谢相关脂肪性肝病。因此，迫切需要开发治疗药物并探索对抗这一严重人类健康问题的病理机制。
3.植物药是指来自草药的活性成分，已用于治疗各种疾病。黄酮类化合物是植物药的重要成分，槲皮素作为一种常见的天然黄酮类化合物，具有广泛的药理作用，是多种水果、蔬菜和药用植物中含量丰富的天然黄酮类成分。大量研究和临床证据表明，膳食槲皮素对糖尿病、高脂血症和代谢相关脂肪性肝病等代谢疾病具有有益作用。尽管先前的研究表明，槲皮素在高脂饮食诱导的沙鼠代谢相关脂肪性肝病模型或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的小鼠模型中发挥保肝作用，槲皮素治疗代谢相关脂肪性肝病的有益作用的潜在机制还远未探索。
4.自噬又称“自噬”，是指细胞内容物，如脂滴和线粒体，被自噬体包裹，然后与溶酶体融合，降解细胞内内容物的过程。大量研究表明，自噬在减轻胰岛素抵抗、肝脂毒性、氧化应激、内质网应激和炎症方面发挥保护作用。自噬通量受损已被证明是代谢相关脂肪性肝病的一个特征，促进肝脏自噬是对抗这种疾病的一种有前途的策略。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是针对以上问题和要求，提供槲皮素在制备代谢相关脂肪性肝病预防或治疗药物中的应用。
6.为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.槲皮素在制备代谢相关脂肪性肝病预防或治疗药物中的应用。
8.进一步的，所述槲皮素代谢相关脂肪性肝病预防或治疗药物中的质量分数为4-8％。
9.进一步的，槲皮素通过与ampk结合增强自噬并减轻脂肪性肝病炎症。
10.进一步的，槲皮素在制备酰基肉碱代谢失衡治疗药物中的应用。
11.本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：
12.本发明测试了ampk和s i rt1的具体作用，发现前者在槲皮素的促自噬作用中起主要作用。此外，ampk通路的抑制消除了槲皮素对脂质积累、氧化应激和线粒体功能障碍的
有益作用，流式细胞仪的定量检测和荧光显微镜的定性观察证明了这一点。这些结果强烈表明ampk是槲皮素改善代谢相关脂肪性肝病的重要靶点。另一方面，我们通过分子对接和分子动力学测试了槲皮素和ampk蛋白的相互作用，发现它们形成了极其稳定的组合，无论是组合价值还是结构稳定性和柔韧性都表现良好。
13.综上所述，这些结果全面证明了槲皮素对代谢相关脂肪性肝病相关细胞稳态功能障碍的保护作用，这些作用与槲皮素干预诱导的ampk介导的自噬通路的激活直接相关。槲皮素通过ampk介导的自噬预防代谢相关脂肪性肝病。将槲皮素应用于制备代谢相关脂肪性肝病预防或治疗药物，通过上调ampk促进自噬是对抗代谢相关脂肪性肝病的一种有前途的策略。
14.此外，我们首次发现，槲皮素有助于酰基肉碱代谢的调节，如肉碱2-甲基-c4、肉碱c8:1、肉碱等几种酰基肉碱，因此，可以将槲皮素用于制备酰基肉碱代谢失衡治疗药物。
15.下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
16.图1中a图为槲皮素有效改善代谢相关脂肪性肝病的组织学病变，病理切片图oro和h&e染色切片，比例尺为100μm)；b图为槲皮素有效缓解代谢相关脂肪性肝病，如血浆alt&ast含量以及肝脏tg&tc含量所示：***为p《0.001,*为p《0.05；
17.图2中a图为尼罗红和rh123的荧光显微镜观察；b图为尼罗红的流式细胞仪定量；c图为rh123的流式细胞仪定量；
18.图3中a图为ros和dhe的荧光显微镜观察；b图为ros和dhe的流式细胞仪图；c图为mtt测试；d图为ros的流式细胞仪定量；e图为dhe的流式细胞仪定量；
19.图4中a图为溶酶体的荧光显微镜观察；b图为l ysotracker green的流式细胞仪图；c图为mtt测试；d图为l ysotracker green的流式细胞仪定量；
20.图5中a图为ros和dhe的荧光显微镜观察；b图为ros和dhe的流式细胞仪图；c图为ros的流式细胞仪定量；d图为dhe的流式细胞仪定量；
21.图6中槲皮素以ampk依赖性方式减轻炎症并增强自噬，自噬荧光显微镜观察；
22.图7中a图为槲皮素与ampk的二维相互作用示意图；b图为槲皮素与ampk的3d结合模式；c图为配合物的rmsd，ampk和槲皮素显示为黑线；d图为蛋白质的rmsf，ampk显示为黑线。
具体实施方式
23.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
24.研究槲皮素与代谢相关脂肪性肝病的关系
25.1、材料和试剂
26.槲皮素粉末购自阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)。蛋氨酸-胆碱缺乏(mcd)饮食、等热量ain93g饮食和定制的含槲皮素mcd饮食(0.05％,w/w)购自medicence lab animal diets co，ltd.(中国江苏)。天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)的商业试剂盒购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。尼罗红、
rhodamine-123(rh123)、2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)、二氢乙锭(dhe)和3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2h-溴化四唑(mtt)购自sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)。
27.2、动物实验
28.c57bl/6j小鼠(雄性，42日龄，18-22g，spf级)购自湖北省疾病预防控制中心(syxk2021-0025)，饲养于spf级房间(12小时光照和暗循环，25℃)。适应一周后，将它们随机分为三组，包括：(1)正常组：给小鼠喂食等热量ain93g饮食六周；(2)代谢相关脂肪性肝病组：小鼠喂食mcd饮食6周；(3)槲皮素组：给小鼠喂食定制的含槲皮素的mcd饮食(0.05％,w/w)六周。在动物实验结束时从眶窦采集每只小鼠的血液，然后以3000-rpm离心10分钟以分离血清。此后，处死小鼠并收集它们的肝组织。一部分新鲜肝组织用于苏木精伊红(h&e)和油红o(oro)染色，其余部分用于生化或蛋白质印迹测定。
29.3、细胞实验
30.hepg2细胞系购自美国典型培养物保藏中心(atcc)，并在补充有10％胎牛血清(fbs)和1％抗生素的dmem培养基中培养。细胞贴壁(60-70％融合)后，将培养基更换为含oa培养基(600mm)或对照培养基(等量的bsa)，用于随后的24小时培养。将槲皮素或化学抑制剂溶解在dmso中。
31.化合物c、ex-527、cq和3-ma分别作为ampk、sirt1、晚期自噬和早期自噬的化学竞争性抑制剂。为了拮抗ampk或sirt1，oa处理的hepg2细胞与1μm化合物c或10μm ex-527一起孵育24小时。为了抑制自噬，oa处理的hepg2细胞与5mm 3-ma或50μm cq一起孵育24小时。
32.4、荧光染色
33.尼罗红、rh123、dcfh-da和dhe荧光染料分别用于评估脂质含量、线粒体功能、活性氧(ros)和超氧阴离子自由基水平。具体而言，细胞处理后去除培养基，然后用pbs溶液洗涤3次。尼罗红(1μm)、dcfa-da(10μm)、dhe(10μm)分别在37℃下30分钟。荧光染色后，在荧光显微镜下观察或使用流式细胞仪测量hepg2细胞。
34.5、统计分析
35.本研究中的数据以平均值
±
sem表示，并使用graphpad prism 9软件绘制。通过双尾非配对学生t检验进行分析，并通过p值评估统计显着性。
36.6、结果
37.6.1槲皮素减弱代谢相关脂肪性肝病的肝脏组织学改变和脂质积累
38.如图1中a图所示，与正常小鼠相比，代谢相关脂肪性肝病小鼠肝脏中的肝脏oro染色切片清楚地显示出严重的脂质积累，槲皮素治疗可以显着减轻这种情况。与正常组相比，h&e染色的肝切片也表明代谢相关脂肪性肝病组肝细胞的组织学损伤。同样，槲皮素治疗后代谢相关脂肪性肝病小鼠的肝脏组织学变化显着降低。此外，生化检测显示代谢相关脂肪性肝病组血清alt和ast较正常组显着升高，但槲皮素治疗可在一定程度上恢复其异常水平(图1中b图)。与oro染色观察结果一致，代谢相关脂肪性肝病组肝脏tg和tc含量显着高于正常组，槲皮素干预后逆转(图1中b图)。
39.6.2槲皮素改善酰基肉碱代谢失衡
40.改善酰基肉碱代谢被证明是预防代谢相关脂肪性肝病的有效策略(g.e.wang等，2018)。此外，肉碱家族也成为脂质代谢异常和脂肪酸氧化的指标。因此，在本研究中，使用
代谢组学方法测定了不同组的血清酰基肉碱水平。如表1所示，与正常组相比，代谢相关脂肪性肝病组大多数血清酰基肉碱种类的含量降低，但槲皮素治疗可以恢复这些变化，尤其是肉碱2-甲基-c4、肉碱c8:1、肉碱c5:0、肉碱c5:1和肉碱c9:1-oh，表明代谢相关脂肪性肝病组肝脏脂肪分解过程受到抑制，但槲皮素干预后再次增强。
41.表1不同组血清酰基肉碱水平
[0042][0043][0044]
脚注：fc，倍数变化；vip，投影中的可变重要性；mw，分子量；根据标准筛选差异代谢物，**(倍数变化≥2或≤0.5，vip≥1，p值《0.05)，*(vip≥1，p值《0.05)。
[0045]
6.3槲皮素减弱oa刺激的hepg2细胞中的脂质积累和线粒体功能障碍
[0046]
尼罗红和rh123通常用作流式细胞仪的荧光染料，主要用于分别评估活细胞中的脂质含量和线粒体生物能量代谢。如图2中a和b图所示，oa刺激hepg2细胞24小时导致细胞内脂质含量显着增加，比正常对照组高52.8％。有趣的是，槲皮素对脂质积累的消除呈剂量依赖性，其中10μm槲皮素略微降低脂质含量而无统计学差异，而30、60和100μm槲皮素显着逆转异常脂质水平(降低13.0％、22.9％和33.2％，分别与oa组相比)。同时，rh123荧光染色
157和glu-94。此外，ampk与槲皮素的对接得分为-8.9kcal/mol。从组合模式上看，两者形成了极其稳定的组合。两种蛋白质结构之间的rmsd用于描述它们原子位置的差异，可以反映整个系统的稳定性。如图7中c图所示，复合物在100ns模拟中稳定，而ampk和槲皮素最终稳定在0.3nm，模拟过程波动不大。rmsf是指某个框架构象的每个氨基酸相对于平均构象的位移的均方根，用来确定蛋白质某个区域的柔韧性。从图7中d图可以看出，系统在绑定口袋附近的rmsf值较低，这在一定程度上表明该口袋在可接受的范围内。总体而言，ampk和槲皮素在组合价值以及结构稳定性和灵活性方面都表现良好。
[0057]
结论
[0058]
槲皮素已在人体临床试验中用于治疗一些适应症，包括出血、血栓栓塞和肺纤维化。越来越多的临床前研究也证明了槲皮素对代谢相关脂肪性肝病的有效性。然而，不完全了解的机制、低生物利用度和缺乏足够的临床数据限制了其在代谢相关脂肪性肝病患者中的应用。在这项研究中，我们旨在通过采用体内/体外模型和不同靶点的特定化学抑制剂，以及分子对接的计算机模拟来阐明槲皮素的保护机制。
[0059]
在我们最初的动物实验中，槲皮素被证明可有效缓解肝损伤、脂肪肝和代谢相关脂肪性肝病炎症。此外，我们首次发现，槲皮素有助于酰基肉碱代谢的调节，如肉碱2-甲基-c4、肉碱c8:1、肉碱等几种酰基肉碱等。肉碱家族已成为脂质代谢失调的指标，而酰基肉碱谱异常是代谢相关脂肪性肝病的一个特征，改善酰基肉碱代谢是预防代谢相关脂肪性肝病的有效策略。
[0060]
肝蛋白检测提示ampk的激活和自噬可能参与了槲皮素对代谢相关脂肪性肝病的保护机制。因此，我们打算在细胞实验中确认其作用机制，发现槲皮素可以显着减轻oa刺激的hepg2细胞中的脂质沉积、ros积累和线粒体功能障碍。有趣的是，ampk或自噬的阻断显着抵消了槲皮素的有益作用。此外，ampk抑制剂的干预都消除了槲皮素的促自噬和有益作用，表明槲皮素-ampk
‑‑
自噬信号通路有助于保护代谢相关脂肪性肝病相关损伤。同时，值得注意的是，我们的研究结果中sirt1的作用不明确，需要进一步探索和验证。
[0061]
ampk和sirt1在细胞代谢中发挥关键作用：ampk是一种主要的细胞能量传感器，调节细胞生长、增殖和代谢等生理功能，而sirt1是一种蛋白质脱乙酰酶，对脂质代谢、氧化应激和炎症具有重要作用。此外，ampk和sirt1都可以调节细胞自噬过程。在我们的研究中，我们初步证实了槲皮素在体内和体外的自噬促进作用，但其调控蛋白仍然未知。因此，我们测试了ampk和sirt1的具体作用，发现前者在槲皮素的促自噬作用中起主要作用。此外，ampk通路的抑制消除了槲皮素对脂质积累、氧化应激和线粒体功能障碍的有益作用，流式细胞仪的定量检测和荧光显微镜的定性观察证明了这一点。这些结果强烈表明ampk是槲皮素改善代谢相关脂肪性肝病的重要靶点。另一方面，我们通过分子对接和分子动力学测试了槲皮素和ampk蛋白的相互作用，发现它们形成了极其稳定的组合，无论是组合价值还是结构稳定性和柔韧性都表现良好。
[0062]
综上所述，这些结果全面证明了槲皮素对代谢相关脂肪性肝病相关细胞稳态功能障碍的保护作用，这些作用与槲皮素干预诱导的ampk介导的自噬通路的激活直接相关。
[0063]
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。