一种鉴定仔鹅早期磷缺乏性佝偻症的理化方法

1.本发明涉及一种鉴定仔鹅早期磷缺乏性佝偻症的理化方法，属于畜牧兽医学技术领域。


背景技术：

2.虽然饲料加工已经实现自动化生产，但中间很多过程还是人工对机器操作完成的，犯错误是人的天性，饲料加工过程不可避免会发生操作错误。生产中的失误，例如磷酸氢钙误投为石粉，石粉误进磷酸盐的料仓，原料顶仓等问题会导致家禽磷缺乏性佝偻症(简称磷缺乏症)。由于磷缺乏性佝偻症的病程极快，而且和钙缺乏以及维生素d缺乏引起的佝偻病较为相似，往往导致疾病确诊较晚，来不及采取补救措施，造成养殖人员和饲料公司的巨大损失。
3.目前鉴定家禽磷缺乏性佝偻症的方法主要是通过检测饲料磷含量、测定血钙(ca),血磷(p)结合碱性磷酸酶总活性(alp)和做组织切片,再结合行走困难、瘫痪等行为学鉴定。但由于仔鹅特殊的生理特点，与鸡不同，磷缺乏时仔鹅血钙和血磷的变化较慢，不适合作为早期鉴定方法，做组织切片程序较长，操作需要专业人员且较过程较慢。家禽的磷缺乏性佝偻症一般诊断时间在1周以后，目前缺乏仔鹅磷缺乏性佝偻症的早期鉴定技术。
4.本发明首先通过团队前期的工作发现磷缺乏症与维生素d和钙缺乏症在病程上时间更早，能在采食缺磷饲料后4天左右就发病，为早期诊断提供了时间基础。本发明取患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨为检验材料，以骨骼理化指标检测为手段，通过筛选敏感指标，获得了一组快速诊断仔鹅早期磷缺乏性佝偻症的理化检测方法，可实现仔鹅磷缺乏后4～7天内诊断出结果，为养殖人员解决责任纠纷、及时采取补救措施提供技术支持。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术中所存在的问题，提供一种鉴定仔鹅早期磷缺乏性佝偻症的理化方法，在仔鹅采食磷缺乏饲料4～7天即可通过骨骼组织中的敏感理化指标的变化规律鉴定出仔鹅磷缺乏性佝偻症。
6.本发明的目的是这样实现的：一种鉴定仔鹅早期磷缺乏性佝偻症的理化方法，其特征是：在仔鹅采食磷缺乏饲料后4～7天可通过骨骼组织中的敏感理化指标的变化规律鉴定出仔鹅磷缺乏性佝偻症；
7.所述骨骼组织中的敏感理化指标为胫骨中的磷含量、胫骨强度、灰分含量和钙含量；
8.所述骨骼组织中的敏感理化指标变化规律包含显著变化规律和相对变化规律；其中显著变化规律为在仔鹅采食磷缺乏饲料后第4～7天，由spss统计学软件对3组以上仔鹅进行单因素方差分析或2组仔鹅t检验，其中每组仔鹅数目不低于6只，由概率参数p值表示差异的显著性；若p《0.05则表示差异显著；p《0.01表示差异极显著；相对变化规律为所述敏感指标在疑似磷缺乏仔鹅中的检测值除以在正常仔鹅中的检测值的百分比。
9.若饲料中未加入无机磷酸盐或饲料的非植酸磷含量低于0.15％，采食该饲料4～7天时鹅群中出现高比例的活力低下、行动困难的仔鹅，其中行动困难的仔鹅胫骨中的磷含量极显著低于正常仔鹅，且含量分别为采食正常饲料仔鹅的61％～57％；0～3天行动困难的仔鹅胫骨中的参考磷含量为正常鹅的100％～62％；8日龄以后行动困难的仔鹅胫骨中的参考磷含量为正常鹅的57％以下；若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则行动困难的仔鹅的该数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸盐配制饲料则该数值进一步低于以上参考值；满足以上条件，则所述行动困难的患病仔鹅可诊断为磷缺乏性佝偻症或磷缺乏症。
10.若饲料中未加入无机磷酸盐或非植酸磷含量低于0.15％，采食该饲料4～7天时鹅群中出现高比例的活力低下、行动困难的仔鹅，其中行动困难的仔鹅胫骨中的骨骼强度含量极显著低于正常仔鹅，且含量分别为采食正常饲料仔鹅的70％～46％；0～3天行动困难的仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的100％～71％；8日龄以后行动困难的仔鹅胫骨强度为正常鹅的46％以下；若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则行动困难的仔鹅的该数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸盐配制饲料则行动困难的仔鹅的该数值进一步低于以上参考值。满足以上条件，则所述行动困难的患病仔鹅进一步被证明为磷缺乏性佝偻症或磷缺乏症。
11.若饲料中未加入无机磷酸盐或非植酸磷含量低于0.15％，采食该饲料4～7天时鹅群中出现高比例的活力低下、行动困难的仔鹅，其中行动困难的仔鹅胫骨中的灰分含量极显著低于正常仔鹅，且含量分别为采食正常饲料仔鹅的81％～73％；在0～3天行动困难的仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的100％～82％；8日龄以后行动困难的仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的73％以下；若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则行动困难的仔鹅该数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸盐配制饲料则行动困难的仔鹅的该数值进一步低于以上参考值；满足以上条件，则所述行动困难的患病仔鹅进一步被证明为磷缺乏性佝偻症或磷缺乏症。
12.若饲料中未加入无机磷酸盐或非植酸磷含量低于0.15％，采食该饲料4～7天时鹅群中出现高比例的活力低行动困难的仔鹅，其中行动困难的仔鹅胫骨中的钙含量极显著低于正常仔鹅，且含量分别为采食正常饲料仔鹅的69％～66％；0～3天行动困难的仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的100％～70％；8日龄以后行动困难的仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的66％以下；若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则该数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸盐配制饲料则行动困难的仔鹅的该数值进一步低于以上参考值；满足以上条件，则所述行动困难的患病仔鹅进一步被证明为磷缺乏性佝偻症或磷缺乏症。
13.本发明方法先进科学，通过本发明，在操作时，本发明取仔鹅骨骼组织，利用物理化学方法检测组织中的敏感理化指标和分子指标，利用统计学软件进行t检验或单因素方差分析，根据骨骼中指标的显著变化和变化比例综合鉴定仔鹅早期磷缺乏性佝偻症。
14.在实际操作时，仔鹅包括6只以上的疑似患磷缺乏症的仔鹅，和6只以上采食普通饲料的正常仔鹅。也可加入1组以上(每组6只以上)的仔鹅。所述骨骼组织为胫骨。所述敏感理化指标为胫骨磷含量、胫骨强度、灰分含量和钙含量。
15.用spss作采食不同饲料磷含量的各组仔鹅差异性分析(2组采用t检验，3组以上采
用单因素方差分析和邓肯氏多重比较)，并将患磷缺乏性佝偻症的仔鹅的胫骨指标数值与正常鹅相除，获得比例，见表1。
16.表1.饲料中磷缺乏、磷正常和磷高量对仔鹅胫骨敏感指标的影响
[0017][0018][0019]
由表1可知：磷添加高剂量磷(饲料总非植酸磷0.78％)与正常磷含量(饲料总非植酸磷0.38％)在0～7天仔鹅的胫骨灰粉、胫骨磷含量、胫骨钙含量和胫骨强度均不存在显著差异(p》0.05)。但通过spss统计，饲料中磷缺乏(无机磷缺乏)导致仔鹅从4～7均存胫骨灰
粉、胫骨磷含量、胫骨钙含量和胫骨强度极显著低于采食正常磷含量的饲料的仔鹅(全部p《0.01)。将试验时间延长至11天和14天，发现一周后的指标变化规律与4～7天发现的规律保持不变，11～14天的试验结果进一步佐证了早期诊断结果。且经过理论分析、查阅相关资料以及本团队的综合研究表明这些指标在磷缺乏症仔鹅与正常仔鹅的数值比值随着磷缺乏程度增加和时间的延长而进一步降低。故得出，磷缺乏性佝偻症仔鹅的早期骨骼指标相对参数如下：
[0020]
进一步的，采食缺磷饲料4～7天，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的磷含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量分别约为采食正常饲料仔鹅的61％～57％，0～3天磷缺乏症仔鹅胫骨中的参考磷含量为正常鹅的100％～62％。8日龄以后磷缺乏症仔鹅胫骨中的磷含量为正常鹅的57％以下，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅和正常仔鹅的指标差异保持极显著水平。
[0021]
进一步的，采食缺磷饲料4～7天，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的骨骼强度含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量分别约为采食正常饲料仔鹅的70％～46％，0～3天磷缺乏症仔鹅胫骨强度为正常鹅的100％～71％。8日龄以后磷缺乏症仔鹅胫骨强度为正常鹅的46％以下，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅和正常仔鹅的指标差异保持极显著水平。
[0022]
进一步的，采食缺磷饲料4～7天，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的灰分含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量分别约为采食正常饲料仔鹅的81％～73％，0～3天患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的参考灰分含量为正常鹅的100％～82％。8日龄以后患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的灰分含量为正常鹅的73％以下，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅和正常仔鹅的指标差异保持极显著水平。
[0023]
进一步的，采食缺磷饲料4～7天，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的钙含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量分别约为采食正常饲料仔鹅的69％～66％，0～3天钙缺乏症仔鹅胫骨中的参考灰分含量为正常鹅的100％～70％。8日龄以后磷缺乏症仔鹅胫骨中的灰分含量为正常鹅的66％以下，患磷缺乏性佝偻症的仔鹅和正常仔鹅的指标差异保持极显著水平。
[0024]
综上，通过本发明，提供了一种鉴定早期仔鹅磷缺乏性佝偻症的理化方法。本发明选取仔鹅胫骨组织，利用理化检测法检测组织中的敏感指标，利用统计学软件进行单因素方差分析，根据骨骼中指标的显著变化综合鉴定仔鹅早期磷缺乏性佝偻症(又名磷缺乏症)。生产中钙缺乏、维生素d缺乏和磷缺乏均可引发佝偻症，往往导致疾病的鉴别容易混淆。通过本发明，及时准确地鉴定佝偻症病因，为发病早期准确地采取营养干预，减小养殖人员和饲料厂的经济损失，解决责任纠纷和健康养殖具有重要意义。
附图说明
[0025]
图1为仔鹅磷缺乏性佝偻症的胫骨矿化异常的验证。
具体实施方式
[0026]
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0027]
随机选取疑似患磷缺乏症的4～7日龄仔鹅6只以上，随机选取同品种同日龄采食正常饲料的仔鹅6只以上，仔鹅屠宰后剥离一侧胫骨，用于评定胫骨强度、胫骨灰分和钙、磷
含量。
[0028]
胫骨灰分含量测定：胫骨粉碎后取样(精确值0.0001g)，电炉炭化后在马弗炉内以550～580℃灰化骨骼(胫骨、股骨和第三趾骨)12h，测定其灰分含量(gb/t6438～2007)。
[0029]
钙磷试样分解液制备：在盛有灰分的坩埚内加入1:3盐酸溶液10ml、浓硝酸3～4滴。小心煮沸后冷却至60～70℃后转入100ml容量瓶内，并用60～70℃的超纯水洗涤坩埚和滤纸。冷却至室温后，定容并摇匀，即获得钙磷试样分解液。
[0030]
胫骨钙含量测定：取上述钙磷试样分解液，采用edta法测定钙含量。
[0031]
胫骨磷含量测定：取上述钙磷试样分解液，采用钼黄分光光度法测定磷的含量。
[0032]
胫骨强度测定：胫骨的剪切硬度可由instron 3367双柱电子测试仪(广州凌拓仪器技术有限公司，中国广州)等仪器测量。
[0033]
使用spss等统计分析软件对上述指标的数据进行单因素方差分析。通过t检验比较正常仔鹅和磷缺乏仔鹅，如果p《0.05，则差异显著。
[0034]
若饲料中未加入无机磷酸盐(或非植酸磷含量低于0.15％)，采食该饲料4～7天，活力低下、行动困难的疑似患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的磷含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量约为采食正常饲料仔鹅的61％～57％，可判定为仔鹅磷缺乏性佝偻症；0～3天磷缺乏症仔鹅胫骨中的参考磷含量为正常鹅的100％～62％。8日龄以后磷缺乏症仔鹅胫骨中的参考磷含量为正常鹅的57％以下。若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸盐配制饲料则数值进一步低于以上参考值。
[0035]
若饲料中未加入无机磷酸盐(或非植酸磷含量低于0.15％)，采食缺磷饲料4～7天，活力低下、行动困难的疑似患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的骨骼强度含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量约为采食正常饲料仔鹅的70％～46％，进一步佐证判定为仔鹅磷缺乏性佝偻症；0～3天磷缺乏症仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的100％～71％。8日龄以后磷缺乏症仔鹅胫骨强度为正常鹅的46％以下。若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸盐配制饲料则数值进一步低于以上参考值。
[0036]
若饲料中的非植酸磷含量低于0.15％，且采食缺磷饲料4～7天，活力低下、行动困难的疑似患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的灰分含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量约为采食正常饲料仔鹅的81％～73％，进一步佐证判定为仔鹅磷缺乏性佝偻症；0～3天磷缺乏症仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的100％～82％。8日龄以后患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的73％以下。若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸盐配制饲料则数值进一步低于以上参考值。
[0037]
若饲料中未加入无机磷酸盐(或非植酸磷含量低于0.15％)，采食缺磷饲料4～7天，活力低下、行动困难的疑似患磷缺乏性佝偻症的仔鹅胫骨中的钙含量极显著(p《0.01)低于正常仔鹅，且含量约为采食正常饲料仔鹅的69％～66％，进一步佐证判定为仔鹅磷缺乏性佝偻症；0～3天钙缺乏症仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的100％～70％。8日龄以后磷缺乏症仔鹅胫骨中的灰分参考含量为正常鹅的66％以下。若饲料中加入了部分无机磷酸盐，则数值高于以上参考值，但低于正常仔鹅的值；若饲料中将石粉错误当成无机磷酸
盐配制饲料则数值进一步低于以上参考值。
[0038]
见图1，图1为仔鹅磷缺乏性佝偻症的胫骨矿化异常的验证。其中pd、pc和ph分别表示采食磷缺乏、磷正常、磷过高饲料的仔鹅。图中数字4、7、11、14均对应为日龄。组织切片图来源于苏木精-伊红染色。切片于显微镜下放大100倍。白色箭头表示骨基质的钙化(亮红色)。pd组磷缺乏引起胫骨矿化不足的显著变化是一种典型的磷缺乏性佝偻症的症状。且11和14日龄与7日龄的检测结果一致或暗示病情进一步加重，验证了pd组的早期磷缺乏性佝偻症的仔鹅模型建立成功，该结论进一步支持了早期骨骼理化诊断方法和结果的可靠性。