血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的检测方法与流程

技术特征：
1.血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述儿茶酚胺及其代谢产物包括：3-mt、mn、nmn、da、e和ne；所述检测方法包括将经过固相萃取的样本采用lc-ms/ms检测；所述固相萃取中使用如下洗脱液洗脱：所述洗脱液含有体积比为(95～100)：(5～1)的乙腈和水；以体积百分比计，所述洗脱液还含有1～5％甲酸。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将样本、内标工作液和稀释液混合后进行固相萃取；所述样本和稀释液的体积比为500：(100～500)；所述样本包括校准品工作液、质控品工作液、血浆样本或尿液样本；所述稀释液为20～50mm的乙酸铵溶液；或，20～50mm的甲酸铵溶液，所述甲酸铵溶液中还含有甲酸，以体积百分数计，所述甲酸含量为0.05～0.2％；优选地，所述稀释液为50mm的乙酸铵溶液；优选地，所述血浆样本或所述尿液样本经水稀释后再与所述稀释液混合；优选地，所述样本和稀释液的体积比为500：300。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述lc-ms/ms检测以da-d4、e-d6、ne-d6、nmn-d3、mn-d3和3-mt-d4作为内标；优选地，所述内标工作液中da-d4、e-d6、ne-d6、nmn-d3、mn-d3和3-mt-d4的目标浓度为：3-mt-d4：0.2μg/ml；mn-d3：0.3μg/ml；nmn-d3：0.5μg/ml；da-d4：0.1μg/ml；e-d6：0.05μg/ml；和ne-d6：1.5μg/ml。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述校准品工作液中各物质的目标浓度为：校准品s1:3-mt:10pg/ml、mn:20pg/ml、nmn:20pg/ml、da:25pg/ml、e:50pg/ml和ne:125pg/ml；校准品s2:3-mt:25pg/ml、mn:50pg/ml、nmn:50pg/ml、da:62.5pg/ml、e:125pg/ml和ne:312.5pg/ml；校准品s3:3-mt:100pg/ml、mn:200pg/ml、nmn:200pg/ml、da:250pg/ml、e:500pg/ml和ne:1250pg/ml；校准品s4:3-mt:600pg/ml、mn:1200pg/ml、nmn:1200pg/ml、da:1500pg/ml、e:3000pg/ml和ne:7500pg/ml；校准品s5:3-mt:1800pg/ml、mn:3600pg/ml、nmn:3600pg/ml、da:4500pg/ml、e:9000pg/ml和ne:22500pg/ml；校准品s6:3-mt:4000pg/ml、mn:8000pg/ml、nmn:8000pg/ml、da:10000pg/ml、e:20000pg/ml和ne:50000pg/ml。5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述质控品工作液包括血浆质控品工作液和/或尿液质控品工作液；优选地，所述血浆质控品工作液的基质为含有bsa的缓冲液，按照质量体积比计，bsa的浓度为1～5％；所述缓冲液优选为pbs缓冲液；优选地，所述血浆质控品工作液的基质为按照质量体积比计含1％bsa的pbs缓冲液；优选地，所述血浆质控品工作液包括低值血浆质控品工作液和高值血浆质控品工作液；
所述低值血浆质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-mt:40pg/ml、mn:80pg/ml、nmn:80pg/ml、da:100pg/ml、e:200pg/ml和ne:500pg/ml；所述高值血浆质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-mt:200pg/ml、mn:400pg/ml、nmn:400pg/ml、da:500pg/ml、e:1000pg/ml和ne:2500pg/ml；优选地，所述尿液质控品工作液以人工尿液、生理盐水或缓冲液作为基质；优选地，所述尿液质控品工作液以缓冲液作为基质，优选以pbs缓冲液作为基质；优选地，所述尿液质控品工作液包括低值尿液质控品工作液和高值尿液质控品工作液；所述低值尿液质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-mt:400pg/ml、mn:800pg/ml、nmn:800pg/ml、da:1000pg/ml、e:2000pg/ml和ne:5000pg/ml；所述高值尿液质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-mt:3000pg/ml、mn:6000pg/ml、nmn:6000pg/ml、da:7500pg/ml、e:15000pg/ml和ne:37500pg/ml。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述洗脱液还含有抗氧化剂；优选地，所述抗氧化剂包括bht；优选地，以体积百分比计，所述洗脱液中bht的含量不超过0.05％；优选地，所述洗脱液包括体积比为(95～100)：(5～1)的乙腈和水；以体积百分比计，所述洗脱液还含有2～5％甲酸和0～0.01％bht；优选地，洗脱液体积比为98:2的乙腈和水，以体积百分比计，洗脱液还含2％甲酸和0.01％bht。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述固相萃取依次包括活化、上样、淋洗、洗脱、氮吹和复溶；优选地，所述活化包括先使用第一活化液活化，再使用第二活化液活化；所述第一活化液包括甲醇，所述第二活化液包括20～50mm的乙酸铵溶液；优选地，所述第二活化液为20mm乙酸铵溶液；优选地，所述淋洗包括先使用第一淋洗液淋洗，再使用第二淋洗液淋洗；所述第一淋洗液包括20～50mm的乙酸铵溶液，所述第二淋洗液包括甲醇；优选地，所述第一淋洗液为20mm乙酸铵溶液；优选地，用于所述复溶的复溶液为水或含有甲酸的水溶液；以体积百分比计，所述含有甲酸的水溶液中甲酸的浓度为0.1～1％；优选地，所述复溶液还含有抗氧化剂；优选地，所述抗氧化剂包括柠檬酸、绿原酸、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、焦性没食子酸或谷胱甘肽；优选地，以体积百分比计，所述复溶液为含有0.1％甲酸的水溶液。8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，液相色谱采用梯度洗脱程序，所述梯度洗脱程序为：0.00min，流动相a 95％，流动相b 5％；0.80min，流动相a 95％，流动相b 5％；3.00min，流动相a 70％，流动相b 30％；3.60min，流动相a 10％，流动相b 90％；
4.20min，流动相a 10％，流动相b 90％；4.21min，流动相a 95％，流动相b 5％；5.00min，流动相a 95％，流动相b 5％；按照体积百分比计，流动相a为0.05～0.2％甲酸水溶液；流动相b为0.05～0.2％甲酸甲醇溶液；优选地，按照体积百分比计，流动相a为0.1％甲酸水溶液；流动相b为0.1％甲酸甲醇溶液；优选地，流速为0.5～1ml/min；优选地，色谱柱采用c18柱，优选采用c18 3.0*100mm,3.5μm色谱柱；优选地，柱温为35～45℃。9.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，质谱条件如下：离子化模式：电喷雾电离正离子模式；采集模式：多反应监测；气帘气：30psi；离子源气体1：60psi；离子源气体2：40psi；离子源喷雾电压：1500v；离子源温度：500℃；碰撞气：6unit。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，离子信息如下：化合物q1q3dwell timedpepcecxpda-1*154.191164083110da-2154.1137.110408158e-1*16610716808269e-2166135.110808239ne-1*152.110716758249ne-21521351075817.59nmn-1*166134.116738239nmn-2166121.110738239mn-1*180148.1168514249mn-21801651085142393-mt-1*168.191164033493-mt-2168.1119.110403259da-is158141.116508169e-is190.1172.216408159mn-is183.1123.116808259nmn-is169.1137.1168082593-mt-is172.195.116558359ne-is175.9158.216158159化合物通道标*作为定量离子。

技术总结
本发明提供了一种血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的检测方法，涉及儿茶酚胺及其代谢产物检测的技术领域。该检测方法通过经过优化的固相萃取的前处理方法得到上机样本进行检验，采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法将儿茶酚胺3项(DA、E和NE)和代谢物3项(3-MT、MN和NMN)进行快速的分离，能够取得前处理操作简单快速，血浆和尿液样本处理干净，干扰小，快速分离六个化合物的技术效果。缓解现了有技术中缺少一种选择性良好，灵敏度高，能够对儿茶酚胺及其代谢产物快速准确分析方法的问题。及其代谢产物快速准确分析方法的问题。及其代谢产物快速准确分析方法的问题。


技术研发人员：栗琳 张新星 丁沛瑜 周立 丁亮 宋兆晴 苏营雪 赵炽娜 郑佳
受保护的技术使用者：江苏豪思睦可生物科技有限公司 湖南豪思生物科技有限公司
技术研发日：2022.09.13
技术公布日：2022/11/11