深层发酵方法与流程

深层发酵方法
1.序列表的引用
2.本技术含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及生产目的多肽的深层发酵方法。


背景技术：

4.在深层发酵中，发酵粘度是非常重要的。随着粘度增加，对于维持发酵器中发酵液的适当的混合变得越来越有挑战性。不完全混合可能影响细胞生长和导致产物形成速率降低。此外，在需氧发酵中，当粘度增加时，需要更高的搅拌速度和搅拌速率来维持相同的氧传递速率。工业发酵设备的运行通常接近最大搅拌速度/搅拌速率，这意味着增加的粘度可减少氧传递速率，进而对生长和/或生产/生产率造成影响。因此，存在着控制、尤其是减少发酵液(fermentation broth)粘度的需求。


技术实现要素：

5.为了以最佳方式运行发酵方法和获得最大生产率和产量，高粘度发酵液体(fermentation liquid)导致了许多需要本领域普通技术人员解决的挑战。高粘度发酵液体的一个影响是液体混合变得低效，这会导致重要发酵参数(例如ph、温度和底物浓度)的空间变化。这种空间不均匀可能负面影响发酵性能。其次，高的液体粘度会降低传质速率。在需氧发酵方法中，通常通过给发酵器注射或喷射空气、氧气或其混合物的方式提供氧气。高粘度对高氧从气相转移至液相是有害的，并且这可能降低发酵方法的生产率和产量。此外，在高粘度时，发酵器中的微生物产生的二氧化碳从发酵液转移至气相是低效的。在发酵液体中，高浓度的二氧化碳对生产目的多肽的微生物具有毒性作用，并且因此负面影响生产率和产量。
6.令人惊讶的是，本发明人发现和当不添加酶时相比，将至少一种酶添加至深层发酵液中会引起粘度降低，该酶优选地包括胞壁质酶、几丁质酶、葡聚糖酶或磷酸二酯酶，更优选地包括胞壁质酶和磷酸二酯酶。即使受本发明影响的主要参数是发酵液的粘度，使用本发明的本领域普通技术人员可以观察到许多益处，例如改善的液体混合、降低的重要发酵参数的空间变化、改善的摄氧量、改善的二氧化碳去除、提高的生产率以及改善的产量。像这样，本发明可以允许保持恒定的粘度但是降低电源输入和/或氧气供应。
7.关于添加胞壁质酶，本发明人研究了不同类别的胞壁质酶，包括gh22、gh24、gh25、gh64、gh71和gh84。为了进一步研究gh25家族，为了获得最大多样性，建立进化树并用于在整个树中选择酶以实现最大的多样性。以下实例中获得的阳性结果支持在整个gh25家族中，并且也在其他gh家族中发现粘度降低酶有很高的可能性。
8.因此，在第一方面，本发明涉及生产一种或多种目的多肽的深层发酵方法，该方法包括：
9.a)在发酵液中发酵生产该一种多种目的多肽的一种或多种微生物，并且
10.b)将至少一种酶添加至该发酵液中；或与未添加或共表达该至少一种酶时相比，在该一种或多种微生物中共表达该至少一种酶并且将该至少一种酶以足以减少该发酵液的粘度分泌到该发酵液中；以及任选地
11.c)回收该一种或多种目的多肽。
附图说明
12.图1.表达淀粉酶产物的地衣芽孢杆菌菌株在整个分批补料发酵过程中的相对粘度。在发酵40小时后，测量以下批次的相对粘度：未添加溶菌酶的参考批次、通过蔗糖进料连续添加溶菌酶的批次、和直接推注添加溶菌酶至发酵器中的批次。
13.定义
14.胞壁质酶：术语“胞壁质酶”活性在本文中定义为催化两种或更多种碳水化合物之间、或碳水化合物和非碳水化物部分之间的糖苷键的水解的o-糖基水解酶。胞壁质酶切割细菌细胞壁的粘多糖和粘肽中的某些残基之间的糖苷键，例如在肽聚糖中的n-乙酰胞壁酸与n-乙酰-d-葡糖胺残基之间以及在壳糊精中的n-乙酰-d-葡糖胺残基之间的1,4-β-键，这导致溶菌作用。胞壁质酶属于ec 3.2.1.17酶类。这包括在材料与方法中描述的胞壁质酶测定中有活性的酶类。
15.几丁质酶：术语“几丁质酶”活性在本文中定义为催化两种或更多种碳水化合物之间、或碳水化合物和非碳水化物部分之间糖苷键水解的o-糖基水解酶。几丁质酶切割真菌细胞壁中发现的几丁质中的某些残基之间的糖苷键，例如几丁质和壳聚糖中的n-乙酰葡糖胺残基之间的1,4β-键。内切几丁质酶(ec 3.2.1.14)在壳多糖链内部位点随机分裂几丁质。外切几丁质酶也分为两种类别：壳体生物酶(chitobiosidases)(ec 3.2.1.29)和β-1,4-n-乙酰葡糖胺酶(ec 3.2.1.30)。一种优选的几丁质酶的氨基酸序列示于seq id no:416中。
16.葡聚糖酶：术语“葡聚糖酶”活性在本文中定义为催化两种或更多种碳水化合物之间、或碳水化合物和非碳水化物部分之间糖苷键水解的o-糖基水解酶。葡聚糖酶切割真菌细胞壁中发现的聚糖中的某些残基之间的糖苷键，例如在1,3葡聚糖、1,4-葡聚糖、1,6-葡聚糖、或包括1,3-、1,4-和/或1,6键的混合的葡聚糖中的葡萄糖残基之间的1,3β-键、1,4β-键或1,6β-键。
17.磷酸二酯酶：术语“磷酸二酯酶”或“pde”在本文中定义为断裂磷酸二酯键(典型地，在dna和/或rna中)的酶。
18.共培养：术语“共培养”在本文中定义为发酵方法，其中将两种或更多种微生物接种在相同的发酵器中，并且培养二者来提供发酵液的不同组分。在一种优选的共培养中，一种微生物生产目的多肽，并且第二微生物以足够降低发酵液粘度的量表达和分泌酶。
19.表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
20.序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。
21.出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch algorithm)
(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如emboss软件包(emboss：the european molecular biology open software suite[欧洲分子生物学开放软件套件],rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或其后的版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
[0022]
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
具体实施方式
[0023]
本发明涉及生产一种或多种目的多肽的深层发酵方法，该方法包括：
[0024]
a)在发酵液中发酵生产该一种多种目的多肽的一种或多种微生物，并且
[0025]
b)将至少一种酶添加至该发酵液中；或与未添加或共表达该至少一种酶时相比，在该一种或多种微生物中共表达该至少一种酶并且将该至少一种酶以足以减少该发酵液的粘度分泌到该发酵液中；以及任选地
[0026]
c)回收该一种或多种目的多肽。
[0027]
在本说明书和权利要求书中，深层发酵方法旨在意指一种发酵方法，其中一种或多种微生物在液体底物中生长，该液体底物包括必需营养物、矿物质、维生素和对于该一种或多种微生物的生长所必需的其他组分。深层发酵方法可以是需氧的，其中将空气、氧气或混合物添加至发酵器中，或其可以是厌氧的，其中不添加氧气。典型地，深层发酵方法提供了用于搅动或搅拌发酵液的形式，以确保发酵器所有部分的条件一致和发酵液中所有成分的均匀分布。在需氧发酵方法中经常需要搅动或搅拌以确保发酵液中(小)气泡的良好分布，这是在气相至液相之间良好氧转移所必需的。
[0028]
发酵方法可以是分批方法，其中将所有成分添加至接种了一种或多种微生物的发酵罐中，并且进行发酵直到完成。在需氧发酵方法的情况下，在整个发酵过程中递送氧气。发酵方法可以是分批补料方法，从分批发酵开始，但是给定时间，典型地当细胞密度达到了某种预定水平时，将营养液(补料)供应(进料)至发酵器直到发酵过程结束。发酵方法可以是连续补料发酵，其中将营养素连续供应至发酵器中，以及将产物从发酵器中连续移除。这些发酵方法是本领域熟知的，并且本发明不限于任何特定发酵方法。
[0029]
发酵方法可以是单种微生物在发酵器中生长的方法或可以是共培养方法，其中在发酵方法期间将两种或更多种微生物同时接种和生长。
[0030]
在优选的实施例中，目的多肽是单个多肽或是两种或更多种多肽的混合物。
[0031]
在另一个优选的实施例中，该多肽或两种或更多种多肽的混合物是一种或多种酶，优选地是一种或多种分泌的酶；甚至更优选地，该多肽或该两种或更多种多肽的混合物选自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、和转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、磷酸二酯酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶。
[0032]
目的多肽可以在发酵结束时由完整的发酵液形成，或可以是在发酵方法结束时从发酵液回收的一种组分或多种组分的混合物，其使用任何数量的本领域熟知的回收和分离方法，例如过滤、离心、沉淀、蒸发、蒸馏等。
[0033]
根据本发明，发酵底物旨在意指营养组合物，其中在发酵方法程中，一种或多种微生物生长其中。发酵底物通常是水溶液，其包括营养素、维生素、矿物质和其他组分的混合物，这些其他组分对于特定发酵方法中特定的选择的微生物的生长是必需的。适合的营养素实例可以是碳水化合物，例如单糖、二糖、寡糖或多糖，例如，葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、糊精类、麦芽糖糊精和淀粉；氨基酸、二肽、寡肽和多肽；脂，例如甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、奶、汁液及其级分。适合的底物的其他实例包括天然存在的材料中的碳水化合物，例如水解淀粉、纤维素或木质纤维素材料。适合的营养素的另外的实例包括来自工业方法的流，例如糖浆、甜菜浆、谷物级分、玉米浆等。适合的矿物质的实例可以是提及的钠、钾、钙、镁、铁和具有适合的阴离子的铵盐，例如氯化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、和硝酸盐，和另外的微量营养素，即生长需要的少量组分(例如铜、铁、钼、钴、锌和碘)。
[0034]
发酵底物可以是限定的底物，例如，由清楚限定组分的底物组成，或可以是包含一种或多种不能清楚限定的复杂营养素的复杂底物，例如(水解)材料(例如水解淀粉、水解木质纤维素材料、水解蛋白；玉米浆或糖浆。)
[0035]
当将该一种或多种微生物接种至发酵底物时，微生物生长并且将营养素转化为细胞材料、产物、代谢物和废弃材料形成发酵液。因此，术语发酵液旨在意指水性组合物，其包括营养素、矿物质、细胞、细胞材料、产物、代谢物、废弃产物等；通过一种或多种微生物在发酵底物中生长提供。
[0036]
该一种或多种微生物原则上可以从任何原核生物或真核生物中选择，该生物可以在深层发酵器中生长。
[0037]
在优选的实施例中，该一种或多种微生物是细菌；优选地是原核生物；更优选地是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌；甚至更优选地该一种或多种微生物选自革兰氏阳性细菌，其包括芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属；或者选自革兰氏阴性细菌，其包括弯曲杆菌、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、和脲原体属；最优选地，该一种或多种微生物包含芽孢杆菌属物种，优选地选自嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
[0038]
在另一个优选的实施例中，该一种或多种微生物是乳杆菌属物种，优选自罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌副干酪亚种、副干酪乳杆菌坚韧亚种、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、卷曲乳杆菌和德氏乳杆菌。
[0039]
细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由hawksworth等人在以下文献中所定义：ainsworth and bisby’sdictionary of the fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,
1995,cab international[国际应用生物科学中心],university press[大学出版社],cambridge，uk[英国剑桥])。
[0040]
该真菌细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌纲(fungi imperfecti)(芽孢纲(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如biology and activities of yeast[酵母的生物学与活性](skinner,passmore和davenport编辑，soc.app.bacteriol.symposium series no.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
[0041]
该真菌细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门(oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
[0042]
在又一个优选的实施例中，该一种或多种微生物是真核生物，更优选地该一种或多种微生物是真菌，甚至更优选地是丝状真菌，其包括枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属或酵母，包括假丝酵母、汉逊酶母、克鲁维酵母、毕赤酵母、酵母菌、裂殖酵母、耶罗维亚酵母、乳酸克鲁维斯酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酶母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母；最优选地，该一种或多种微生物是黑曲霉、青霉或木霉物种，优选自泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、产紫青霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉和绿色木霉。
[0043]
在优选的实施例中，该至少一种酶以推注或连续添加的方式添加。可替代地，该方法是分批补料或连续补料的发酵方法，并且将该至少一种酶添加至补料中。
[0044]
优选地，该至少一种酶选自胞壁质酶、几丁质酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、核酸酶和/或磷酸二酯酶；更优选地，该至少一种酶是胞壁质酶，甚至更优选地是gh22、gh24、gh25、gh64、gh71和gh84糖基水解酶；仍更优选地该至少一种酶包含胞壁质酶，其具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列和seq id no:1至seq id no:453中任一个中显示的氨基酸序列至少60％序列同一性；例如，至少65％序列同一性；例如，至少70％序列同一性；例如，至少75％序列同一性；例如，至少80％序列同一性；例如，至少85％序列同一性；例如，至少90％序列同一性；例如，至少95％序列同一性；例如，至少96％序列同一性；例如，至少97％序列同一性；例如，至少98％序列同一性；例如，至少99％序列同一性；或甚至100％同一性。
[0045]
关于该至少一种酶的剂量，优选的实施例包含每kg发酵液中添加高达20,000mg的该至少一种酶；优选地高达15,000mg/kg；甚至更优选地高达10,000mg/kg；仍更优选地高达5,000mg/kg；甚至更优选地高达1,000mg/kg和最优选地高达500mg/kg。
[0046]
可替代地在另一个优选的实施例中，当稀释4,000倍时，添加该至少一种酶，其活
性范围是低于本文中描述的胞壁质酶测定的检测限，和高达本文中描述的胞壁质酶测定的0,200限；优选地当稀释3,000倍时；更优选地当稀释2,000倍时高达0,200；甚至更优选地当稀释1,000倍时高达0,200；仍更优选地当稀释500倍时高达0,200；最优选地当稀释100倍时高达0,200，如wo 2018/113743的实例1和16中描述的-按照wo 2018/113743实例16，在本测定下，鸡卵清蛋白胞壁质酶在5mg/l时的od450应该下降0.18；如果没有，这些值相应地应该被归一化。
[0047]
在优选的实施例中，该至少一种酶是几丁质酶，将其按以下范围添加至发酵液：0.1ppm至500ppm，特别地0.1ppm至100ppm，更特别地0.1ppm至50ppm，例如0.5ppm至10ppm，该量以酶蛋白的量比发酵液的量计算。
[0048]
在优选的实施例中，该至少一种酶是葡聚糖酶，将其按以下范围添加至发酵液：0.1ppm至500ppm，特别地0.1ppm至100ppm，更特别地0.1ppm至50ppm，例如0.5ppm至10ppm，该量以酶蛋白的量比发酵液的量计算。
[0049]
包含几丁质酶和葡聚糖酶的组合物可以是例如在能诱导这写酶生产的条件下，通过发酵丝状真菌哈茨木霉提供，例如以商购形式的酶产物glucanex
tm
，由诺维信公司(novozymes a/s)制造。优选地，将glucanex
tm
按以下量范围添加：0.1ppm至500ppm，特别地0.1ppm至400ppm，更特别地0.1ppm至300ppm，甚至特别地0.1ppm至200ppm或是0.1ppm至100ppm，例如是0.5ppm至10ppm。
[0050]
用于克隆编码该至少一种酶的基因的技术在本领域中是已知的，并且本领域普通技术人员将能够选择合适的方法和技术来表达用于根据本发明使用的相关基因。
[0051]
在一个实施例中，通过在还生产目的多肽的一种或多种微生物中共表达和分泌至少一种酶来添加至少一种酶。
[0052]
在另一个实施例中，将该至少一种酶添加至该发酵液中，通过在发酵液中共培养第二微生物，其中该第二微生物生产该至少一种酶并将其分泌至该发酵液中。
[0053]
在优选的实施例中，通过增加发酵期间发酵液的搅拌、搅动速度、混合或加氧来增加发酵液中的氧传递速率。
[0054]
根据本发明，与用相同底物和相同微生物但未添加该一种或多种酶进行的类似发酵方法相比，在至少部分发酵方法中，实现了发酵液的粘度降低。
[0055]
实例
[0056]
材料与方法
[0057]
胞壁质酶：
[0058]
具有seq id no:1的序列的胞壁质酶在以下实例中被使用。这种胞壁质酶和wo 2013/076253中披露的seq id no:4的胞壁质酶相同，并且在该公开中可以发现披露如何获得该酶的更多细节。
[0059]
根据本发明，本发明人完全预期其他酶(例如gh18、gh22、gh24、gh25、gh64、gh71、gh84糖苷水解酶和以下举例说明的其他酶以及还在所附的序列表中提供的)是有功能的；在seq id no:2至seq id no:453中也提供了其实例，当然其目的在于所列的氨基酸序列的成熟版本是要添加到发酵液中的物质。
[0060]
胞壁质酶测定：
[0061]
如wo 2018/113743中实例1和16中所描述的确定胞壁质酶活性；按照wo 2018/
113743实例16，在本测定下，鸡卵清蛋白胞壁质酶在5mg/l时的od450应该下降0.18；如果没有，这些值相应地应该被归一化。
[0062]
微生物：
[0063]
在实例1、2和3中用于实验的地衣芽孢杆菌菌株如以下表1所示。
[0064]
表1.
[0065][0066][0067]
实例1.通过在发酵中添加胞壁质酶来降低培养发酵液粘度，以用重组地衣芽孢杆菌生产淀粉酶
[0068]
生产淀粉酶产物的地衣芽孢杆菌菌株在三个相同发酵器中生长，这些发酵器含有限定的矿物质培养基。用蔗糖溶液进料发酵。通过溶解氧水平控制进料速率。一个发酵器(称为参考)作为实验对照并且不添加胞壁质酶至发酵液。在发酵40小时后，向第二个发酵器提供1.6mg胞壁质酶/kg起始发酵液的推注。通过单独的蔗糖进料管线持续向第三个发酵器提供胞壁质酶。对于单独的蔗糖进料，添加3.2mg胞壁质酶/kg蔗糖进料。80小时后停止发酵。
[0069]
根据制造商的说明，在海默生在线粘度计xl7(hydramotion inline viscosimeter xl7)上测量粘度。粘度测量显示，在参考发酵中，粘度随着和生物质和/或其他发酵产物相关的发酵进行而增加。和参考相比，或者以推注或者以持续的方式添加胞壁质酶，能减少牛顿发酵液(newtonian fermentation broth)的粘度(图1)。和参考相比，持续提供胞壁质酶引起更平缓的粘度降低，而推注添加显示出更瞬时的粘度降低。和参考相比，两种添加方法都有效降低培养发酵液的粘度。
[0070]
实例2.将胞壁质酶添加至发酵中，用重组地衣芽孢杆菌生产淀粉酶或甘露聚糖酶引起更高的发酵产量
[0071]
实例1显示通过将胞壁质酶添加至发酵液中来降低粘度，并且这种降低允许其他方法修改引起产量提高。
[0072]
多个生产淀粉酶或甘露聚糖酶产物的地衣芽孢杆菌菌株在发酵罐中生长(表1)；所有菌株在分批补料过程中生长，该过程进料蔗糖溶液，并且进料速率由溶解氧水平控制。
[0073]
在发酵40小时后，以1.6mg胞壁质酶/kg起始发酵液提供菌株1(推注添加)。在发酵25小时后，以18mg胞壁质酶/kg起始发酵液提供菌株2、3和4(推注添加)。菌株1的发酵在80
castle)，de)上，使用对于悬浮流变理想的“叶片-和-杯子”几何(“vane-and-cup”geometry)、通过稳态流测量进行发酵液的离线流变学表征。叶片由四个以直角安装的刀片(14mm w 42mm h)组成，杯子半径为15mm并且包含28.72ml发酵液。叶片和杯子之间的间隙是4,000mm。对于每个样品，在10s-1
至150s-1
剪切速率间隔中做九个稳态流测量(每个剪切率30s，其中报告的值是每个间隔内最后15s测量值的平均值)。
[0085]
在发酵结束时，在46/s和100/s的剪切速率时的离线粘度测量值的比较显示，和参考相比富氧发酵的粘度增加(表4)。由于蔗糖剂量增加，在富氧时粘度增加可能和额外的生物质形成和/或其他发酵产物有关。在将胞壁质酶添加至富氧发酵中时观察到粘度降低。与参考发酵相比，将胞壁质酶添加至无富氧发酵中显示粘度降低。与添加胞壁质酶的发酵和未添加胞壁质酶的参考发酵之间的相对粘度降低相比，观察到在添加胞壁质酶的富氧发酵和未添加胞壁质酶的富氧发酵之间的相对粘度降低更多。
[0086]
表4.与不富氧和没有胞壁质酶的参考发酵相比，添加胞壁质酶的发酵(100mg胞壁质酶/kg起始发酵液)、富氧，以及富氧并且100mg胞壁质酶/kg起始发酵液的相对粘度。
[0087][0088][0089]
实例5.添加胞壁质酶和组合添加胞壁质酶和磷酸二酯酶，用重组地衣芽孢杆菌生产的蛋白酶增加，发酵产量提高
[0090]
生产蛋白酶产物的地衣芽孢杆菌菌株(菌株5)在发酵器中生长。用蔗糖溶液进料发酵。通过溶解氧水平控制进料速率。
[0091]
实验概述：
[0092]
对于只有胞壁质酶的实验，在发酵0小时和48小时后以推注添加不同浓度的胞壁质酶(范围是30mg至75mg胞壁质酶/kg起始发酵液)。
[0093]
对于胞壁质酶组合磷酸二酯酶的实验，在发酵0小时和48小时后以推注添加不同浓度的胞壁质酶(范围是30mg至75mg胞壁质酶/kg起始发酵液)。在发酵0小时和48小时后以推注添加25mg磷酸二酯酶/kg起始发酵液。
[0094]
在发酵结束后，计算每个发酵的产量并且和未添加酶的参考比较。结果显示，与参考相比，随着胞壁质酶浓度增加产量提高(表5)。
[0095]
表5.不添加酶、只添加胞壁质酶、和胞壁质酶组合磷酸二酯酶的情况下产量提高。
[0096]
实验产量粘度降低参考00添加胞壁质酶
添加胞壁质酶和磷酸二酯酶
[0097]
当与磷酸二酯酶组合时，需要较少的胞壁质酶达到和当只添加胞壁质酶时相同的产量。胞壁质酶与磷酸二酯酶的组合引起总体上需要更少的酶来实现相同的产量增加的情况。
[0098]
实例6.添加变聚糖酶的重组米曲霉生产磷酸二酯酶的发酵中粘度降低
[0099]
生产磷酸二酯酶产物的米曲霉菌株(菌株6)在发酵器中生长。用葡萄糖溶液进料发酵。用固定斜率添加进料速率。应用相同方法参数和使用以下原理研究对氧转移的影响。
[0100]
从系统上的质量平衡确定系统中总的氧转移。氧的质量转移速率(otr)可以描述为：
[0101]
otr＝kla(do*-do)(nielsen等人2003)
[0102]
其中kla是体积质量转移效率，do*是液相与气相平衡时的氧浓度，并且do是液相中实际的氧浓度。
[0103]
kla受混合电源输入、表面气流速度、和发酵液粘度的影响：
[0104]
kla＝c(p/v)^a*v_g^b*my^c(garcia-ochoa和gomez 2009)
[0105]
其中p是功率输入，v是发酵液体积，v_g是表面气流速度并且my是粘度。
[0106]
通过保持电源和表面气流速度恒定，因此我们可以通过计算kla间接观察粘度的发展：
[0107]
kla＝otr/(do*-do)
[0108]
除了如表6所示的粘度降低之外，将变聚糖酶添加至发酵中也增加了发酵产量。
[0109]
表6.将变聚糖酶(seq id no:433)添加至米曲霉发酵中，产量提高并且粘度降低
[0110][0111]
实例7.添加几丁质酶的重组米曲霉生产植酸酶的发酵所需的搅拌减少和粘度降低
[0112]
生产植酸酶产物的米曲霉菌株(菌株7)在发酵器中生长。用麦芽糖溶液进料发酵。用固定斜率添加进料速率。
[0113]
发酵液中溶解氧的水平通过操纵搅拌器的每分钟转数(rpm)测量的搅拌速度来控制。添加几丁质酶导致维持发酵液中溶解氧水平所需的rpm降低。由于总的氧转移相等并且所有其他参数不变，rpm的降低相当于粘度降低。
[0114]
表7.向米曲霉发酵中添加几丁质酶(seq id no:416)来维持溶解氧水平和粘度降低所需的rpm
[0115][0116]
实例8.使用不同的糖基水解酶和胞壁质酶样的酶，提高用重组地衣芽孢杆菌生产的淀粉酶的发酵产量。
[0117]
生产淀粉酶产物的地衣芽孢杆菌菌株(菌株1)在限定的矿物质培养基中生长。用蔗糖溶液进料发酵。通过溶解氧水平控制进料速率。八个发酵器(称为参考)作为实验对照并且不添加胞壁质酶至发酵液。在发酵22小时至72小时后，向其他发酵器提供一次至两次的18mg至50mg胞壁质酶/kg起始发酵液的推注。在五天至六天后发酵结束。
[0118]
在发酵结束后，计算每个发酵的产量并且和未添加酶的参考比较。产量等于在发酵结束时测量的活性乘以在发酵结束时发酵液重量。
[0119]
结果显示与参考相比，产量提高(表8)。
[0120]
表8.与添加胞壁质酶相比，不添加酶(参考)的产量提高
[0121]
[0122][0123]
实例9.地衣芽孢杆菌共表达菌株的构建
[0124]
菌株：
[0125]
mata338：生产具有卡那霉素标记的淀粉酶的地衣芽孢杆菌菌株。菌株1是去除卡那霉素标记后的mata338的后代。
[0126]
质粒：
[0127]
phyge867：具有温度敏感来源和编码红霉素抗性的erm基因的质粒。该质粒含有驱动胞壁质酶的磷酸耗减诱导型启动子。
[0128]
菌株构建：
[0129]
以如wo 2020229191中所描述的相似的方式进行共表达胞壁质酶的地衣芽孢杆菌菌株的构建。
[0130]
使用mata338菌株作为用于用phyge867转化的宿主菌株。胞壁质酶基因的正确整合导致卡那霉素表达盒的去除。一个克隆被分离为对红霉素、卡那霉素敏感并保存为hyge877n7。胞壁质酶基因的正确插入通过测序验证。
[0131]
实例10.共表达胞壁质酶降低发酵粘度
[0132]
将菌株1和hyge877n7在不添加外源酶的矿物质培养基中并排发酵。用蔗糖溶液进料发酵。通过溶解氧水平控制进料速率。五天后结束发酵。在发酵结束后，计算每个发酵的产量并且和未添加酶的参考比较。产量等于在发酵结束时测量的活性乘以在发酵结束时发
酵液重量。
[0133]
结果显示当共表达胞壁质酶时，粘度降低和产量提高(表9)。
[0134]
表9.当共表达胞壁质酶时产量提高
[0135]
酶生产产量粘度降低菌株1-参考1.000hyge877n7-共表达1.43
[0136]
实例11.添加β1-3葡聚糖酶的里氏木霉生产纤维素酶的发酵中粘度降低
[0137]
将生产野生型纤维素酶的里氏木霉菌株在28℃时在pda板上放置5至9天。将各自含有100ml针对每种菌株的摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自pda板的两个塞子接种。在26℃，将摇瓶在定轨摇床上在250rpm下孵育48小时。将这些培养物用作种子，以用于更大规模发酵。
[0138]
使用共160ml的各种子培养物接种含有1.8升发酵分批培养基的欧谱生物技术公司(applikon biotechnology)3升玻璃夹套发酵器。这些发酵器的温度维持在28℃，并且使用欧谱控制系统将ph控制在4.75 /-0.25的设定点。将空气以2.0l/min的速率添加到容器中，并用以1100rpm旋转的rushton叶轮搅拌培养液。将由右旋糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至15g/小时的速率，基于溶解氧控制的斜升，给予167小时。将每种酶以一次或两次推注添加，并以最大0.2g/l发酵液的浓度作为最终浓度。从发酵第2天至第6天进行添加。每天从每个发酵器中采集样品、离心、并储存在-20℃。
[0139]
在发酵结束后，进行总的蛋白测定。计算每个发酵的产量并且和未添加酶的参考比较。产量等于在发酵结束时，总的蛋白测定结果乘以发酵液重量。
[0140]
总蛋白测定。将第7天的发酵样品脱盐并且将缓冲液交换到50mm乙酸钠-100mm nacl ph 5.0中。脱盐后，使用gallery分析仪(赛默科技公司)对酶组合物的蛋白浓度进行确定。将培养物在水中适当稀释。将白蛋白标准品(牛血清白蛋白；bsa)在水中连续稀释至0.66mg/ml至0.087mg/ml的浓度范围。将总共20μl的每种稀释液(包括标准品在内)转移到含有200μl二辛可宁酸(bca)底物溶液(pierce bca蛋白测定试剂盒；赛默科技公司)的比色皿中，然后在37℃下孵育30分钟。孵育完成后，测量每个样品在540nm处的光密度。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。
[0141]
表10.和未添加酶相比(参考)，当将粘度降低酶添加至里氏木霉的发酵液中时，产量提高
[0142][0143]
实例12.酶诱导培养发酵液粘度降低。(黑曲霉发酵)
[0144]
根据制造商的说明，用带有thermocline的rapid visco
tm
分析仪(rva 4500，澳大
利亚的佩尔滕仪器有限公司(perten instruments of australia pty limited))离线测量发酵液粘度。典型测量在34℃、30s-1
和330s-1
之间的剪切速率的范围内进行。通过记录在160s-1
的剪切速率下的粘度值确定表观粘度。使用软件tcw3(波通仪器公司(perten instruments))进行数据分析。在测量粘度前，将处理和未处理(参考)样品的等分试样在34℃孵育3小时。
[0145]
使用黑曲霉发酵方法研究将酶添加至培养发酵液中的作用。典型的分批补料发酵涉及将葡萄糖溶液作为碳源，并且通过溶解氧水平控制进料速率。在一个或多个指定时间点收集生产amg-naroduct的菌株的发酵液。在一系列离线测量中检查特定酶的粘度降低潜力(表11)。将等摩尔量的酶添加至相应样品中。
[0146]
表11.当与参考(不添加酶)相比时，发酵液粘度降低对酶添加的影响。
[0147][0148][0149]
实例13.酶诱导米曲霉培养发酵液粘度降低
[0150]
采用基于溶解氧水平在线反馈的进料策略，分批进料葡萄糖进行发酵。用相应的酶处理用于离线粘度测量值的样品(表12)，然后在34℃下孵育3小时。将粘度降低作用归一化为蛋白浓度。
[0151]
表12.当与参考(不添加酶)相比时，发酵液粘度降低对酶添加的影响。
[0152][0153]
实例13.芽孢杆菌属发酵液粘度降低，使用不同的胞壁质酶和离线粘度测量值使用不同胞壁质酶和离线粘度测量降低芽孢杆菌发酵液粘度
[0154]
使用生产淀粉酶产物的地衣芽孢杆菌菌株研究将酶添加至培养发酵液中的作用。在添加单个酶后，离线测量培养发酵液的粘度(图13)。
[0155]
表13.与添加了不同糖基水解酶相比，不添加酶(参考)的发酵液粘度降低。
[0156]
[0157]