一种抗病毒活性灵芝多糖制剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及灵芝多糖制剂技术领域，尤其涉及一种抗病毒活性灵芝多糖制剂及其制备方法。


背景技术：

2.近几年来，大量药理及临床试验研究表明，多糖类化合物可作为一种有效的免疫反应调节剂，可促进免疫器官的发育，提高t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、巨噬细胞的免疫活性，激活补体系统，促进免疫相关细胞因子的产生等。
3.灵芝多糖是灵芝的主要有效成分，研究表明灵芝多糖具有免疫调节、抗衰老、抗肿瘤、保护肝脏、强心、活血化瘀、保护血管等作用。但是灵芝多糖在临床上存在用药量大、代谢快、生物利用度低等不足。因此，研究和开发灵芝多糖新制剂，有利于提高其生物利用度。
4.脂质体作为新型递送系统中的一员，由单层或多层脂质双分子层形成的、类似于细胞膜的微球体，粒径大小从20-2000nm不等。脂质体通过双层磷脂膜与细胞发生吸附、融合、脂交换和内吞等相互作用，促进包封或者表面的药物作用于目的细胞。
5.脂质体具有其自身特殊的性能，穿透生理组织屏障能力很强，渗透力增强，可有效携带活性物质进入靶组织发挥功效作用；而且脂质体粒子表面原子数量成千上万倍增多，其遮盖力、附着性很强，也极大增加了活性物质与细胞的接触面积，使更多的处于表面的活性物质原子能够参与功效反应，因此成为近年来载体研究的热点。
6.有研究报道，灵芝多糖在体外可以一定程度地提髙抵抗病毒感染的能力，并且增强机体免疫能力。因此如将灵芝多糖包封于脂质体中，以控制灵芝多糖的释放、延长作用时间，提高灵芝多糖的生物利用度，具有极好的研究前景。但是目前制备灵芝多糖脂质体制剂，存在包封率低的问题，导致药效低，难以满足市场需求。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种抗病毒活性灵芝多糖制剂及其制备方法。
8.一种抗病毒活性灵芝多糖制剂的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)将大豆磷脂、胆固醇、玉米醇溶蛋白、灵芝孢子油、非离子型表面活性剂加入体积分数为80-90％乙醇溶液中搅拌10-30min，得到有机相；
10.(2)将灵芝多糖、壳聚糖加入ph为6.1-6.7的pbs缓冲液中搅拌均匀得到灵芝多糖溶液；
11.(3)将有机相加入搅拌状态的灵芝多糖溶液中，超声处理10-30min，超声功率为300-400w，超声频率为15-20khz，超声温度为10-20℃，减压蒸馏去除乙醇得到预制料；
12.(4)对预制料进行超声粉碎处理，然后经微孔滤膜整粒到抗病毒活性灵芝多糖制剂。
13.优选地，步骤(1)中，大豆磷脂、胆固醇、玉米醇溶蛋白、灵芝孢子油、非离子型表面
活性剂的质量比为5-15：1-2：1-2：1-2：0.1-1。
14.优选地，步骤(1)中，非离子型表面活性剂为吐温20、吐温60、吐温80、司盘20、司盘60、司盘80中至少一种。
15.优选地，步骤(2)中，灵芝多糖、壳聚糖的质量比为1-4：1-2。
16.优选地，步骤(3)中，减压蒸馏温度为50-60℃。
17.优选地，步骤(3)的减压蒸馏过程中，体系形成胶态后继续加入ph为6.1-6.7的pbs缓冲液搅拌均匀，然后继续减压蒸馏直至完全除去乙醇。
18.优选地，步骤(4)中，微孔滤膜孔径分别为0.45pm和0.22pm。
19.优选地，步骤(4)中，超声粉碎处理的时间为5-8min，超声功率为550-650w，超声频率为21-24khz。
20.一种抗病毒活性灵芝多糖制剂，采用上述抗病毒活性灵芝多糖制剂的制备方法制得。
21.优选地，抗病毒活性灵芝多糖制剂的包封率≥70％。
22.本发明的技术效果如下所示：
23.本发明将大豆磷脂与胆固醇复配，对灵芝多糖进行包封制备脂质体，通过控制大豆磷脂与胆固醇的质量比，配合超声处理过程，灵芝多糖的包封率可达68.2％，既能既能保证药效又便于存储运输，产品具有良好的分散性能，保护原料药受热分解，可有效的延缓药物分解，避免其氧化变质。而本技术人通过试验发现，所得灵芝多糖脂质体虽然包封率较高，但是其抵抗病毒感染的能力还无法满足需求，本技术人通过将灵芝多糖与灵芝孢子油复配，可以达到极好的抗病毒感染效果，但是灵芝多糖与灵芝孢子油为非互溶组分，而且两者均极易氧化变质。
24.本发明通过采用具有两亲性的玉米醇溶蛋白促使大豆磷脂、胆固醇、灵芝孢子油均匀分散在乙醇溶液中制备有机相；然后在酸性体系中，将灵芝多糖、壳聚糖溶解于pbs缓冲液中，再向其中加入有机相的过程中，玉米醇溶蛋白通过反溶剂形成疏水内核将灵芝孢子油包裹其中，而具有自组装能力的玉米醇溶蛋白与亲水性壳聚糖复配，亲水性壳聚糖包覆在形成的玉米醇溶蛋白颗粒表面，灵芝多糖与壳聚糖静电结合，通过减压蒸馏去除乙醇，进而在表面形成脂质体结构。
25.本发明将灵芝多糖与灵芝孢子油两种不互溶的组分封装在同一个脂质体中，互不干扰的释放活性成分，而层次结构的脂质体不仅可有效延缓两者的释放速率，而且可有效提高载荷能力，灵芝多糖的包封率可达70％以上，同时与灵芝孢子油复配表现出良好的储存稳定性。
26.本发明所得抗病毒活性灵芝多糖制剂，不仅可保护原料药受热分解，有效的延缓药物分解，避免其氧化变质，而且有效地提高了其制剂的药效的发挥，市场前景广阔。
附图说明
27.图1为实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂的包封率和载药量对比图。
28.图2为实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂对鸡外周血淋巴细胞和鸡脾脏淋巴细胞的增殖影响对比图。
具体实施方式
29.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
30.实施例1
31.一种抗病毒活性灵芝多糖制剂的制备方法，包括如下步骤：
32.(1)将5kg大豆磷脂、1kg胆固醇、1kg玉米醇溶蛋白、1kg灵芝孢子油、0.1kg非离子型表面活性剂加入50kg体积分数为80％乙醇溶液中，以1000r/min的速度搅拌10min，得到有机相；
33.(2)将1kg灵芝多糖、1kg壳聚糖加入10kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液中搅拌均匀得到灵芝多糖溶液；
34.(3)将有机相加入搅拌状态的灵芝多糖溶液中，超声处理10min，超声功率为300w，超声频率为15khz，超声温度为10℃，50℃减压蒸馏去除乙醇，体系形成胶态，加入5kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液搅拌均匀，继续减压蒸馏去除剩余乙醇，得到预制料；
35.(4)将预制料采用超声细胞粉碎仪超声处理5min，超声功率为550w，超声频率为21khz，然后依次经0.45pm和0.22pm的微孔滤膜整粒，得到抗病毒活性灵芝多糖制剂。
36.实施例2
37.一种抗病毒活性灵芝多糖制剂的制备方法，包括如下步骤：
38.(1)将15kg大豆磷脂、2kg胆固醇、2kg玉米醇溶蛋白、2kg灵芝孢子油、1kg非离子型表面活性剂加入100kg体积分数为80-90％乙醇溶液中，以5000r/min的速度搅拌30min，得到有机相；
39.(2)将4kg灵芝多糖、2kg壳聚糖加入20kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液中搅拌均匀得到灵芝多糖溶液；
40.(3)将有机相加入搅拌状态的灵芝多糖溶液中，超声处理30min，超声功率为400w，超声频率为20khz，超声温度为20℃，60℃减压蒸馏去除乙醇，体系形成胶态，加入15kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液搅拌均匀，继续减压蒸馏去除剩余乙醇，得到预制料；
41.(4)将预制料采用超声细胞粉碎仪超声处理8min，超声功率为650w，超声频率为24khz，然后依次经0.45pm和0.22pm的微孔滤膜整粒，得到抗病毒活性灵芝多糖制剂。
42.实施例3
43.一种抗病毒活性灵芝多糖制剂的制备方法，包括如下步骤：
44.(1)将8kg大豆磷脂、1.7kg胆固醇、1.2kg玉米醇溶蛋白、1.7kg灵芝孢子油、0.2kg非离子型表面活性剂加入90kg体积分数为82％乙醇溶液中，以4000r/min的速度搅拌15min，得到有机相；
45.(2)将3kg灵芝多糖、1.2kg壳聚糖加入17kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液中搅拌均匀得到灵芝多糖溶液；
46.(3)将有机相加入搅拌状态的灵芝多糖溶液中，超声处理15min，超声功率为370w，超声频率为17khz，超声温度为17℃，52℃减压蒸馏去除乙醇，体系形成胶态，加入12kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液搅拌均匀，继续减压蒸馏去除剩余乙醇，得到预制料；
47.(4)将预制料采用超声细胞粉碎仪超声处理6min，超声功率为620w，超声频率为22khz，然后依次经0.45pm和0.22pm的微孔滤膜整粒，得到抗病毒活性灵芝多糖制剂。
48.实施例4
49.一种抗病毒活性灵芝多糖制剂的制备方法，包括如下步骤：
50.(1)将12kg大豆磷脂、1.3kg胆固醇、1.8kg玉米醇溶蛋白、1.3kg灵芝孢子油、0.8kg非离子型表面活性剂加入70kg体积分数为88％乙醇溶液中，以2000r/min的速度搅拌25min，得到有机相；
51.(2)将2kg灵芝多糖、1.8kg壳聚糖加入13kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液中搅拌均匀得到灵芝多糖溶液；
52.(3)将有机相加入搅拌状态的灵芝多糖溶液中，超声处理25min，超声功率为330w，超声频率为19khz，超声温度为13℃，58℃减压蒸馏去除乙醇，体系形成胶态，加入8kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液搅拌均匀，继续减压蒸馏去除剩余乙醇，得到预制料；
53.(4)将预制料采用超声细胞粉碎仪超声处理7min，超声功率为580w，超声频率为23khz，然后依次经0.45pm和0.22pm的微孔滤膜整粒，得到抗病毒活性灵芝多糖制剂。
54.实施例5
55.一种抗病毒活性灵芝多糖制剂的制备方法，包括如下步骤：
56.(1)将10kg大豆磷脂、1.5kg胆固醇、1.5kg玉米醇溶蛋白、1.5kg灵芝孢子油、0.5kg非离子型表面活性剂加入80kg体积分数为85％乙醇溶液中，以3000r/min的速度搅拌20min，得到有机相；
57.(2)将2.5kg灵芝多糖、1.5kg壳聚糖加入15kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液中搅拌均匀得到灵芝多糖溶液；
58.(3)将有机相加入搅拌状态的灵芝多糖溶液中，超声处理20min，超声功率为350w，超声频率为18khz，超声温度为15℃，55℃减压蒸馏去除乙醇，体系形成胶态，加入10kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液搅拌均匀，继续减压蒸馏去除剩余乙醇，得到预制料；
59.(4)将预制料采用超声细胞粉碎仪超声处理6-7min，超声功率为600w，超声频率为22.5khz，然后依次经0.45pm和0.22pm的微孔滤膜整粒，得到抗病毒活性灵芝多糖制剂。
60.对比例
61.一种灵芝多糖制剂的制备方法，包括如下步骤：
62.(1)将11.5kg大豆磷脂、3kg胆固醇、1.5kg灵芝孢子油、0.5kg非离子型表面活性剂加入80kg体积分数为85％乙醇溶液中，以3000r/min的速度搅拌20min，得到有机相；
63.(2)将2.5kg灵芝多糖加入15kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液中搅拌均匀得到灵芝多糖溶液；
64.(3)将有机相加入搅拌状态的灵芝多糖溶液中，超声处理20min，超声功率为350w，超声频率为18khz，超声温度为15℃，55℃减压蒸馏去除乙醇，体系形成胶态，加入10kg ph为6.1-6.7的pbs缓冲液搅拌均匀，继续减压蒸馏去除剩余乙醇，得到预制料；
65.(4)将预制料采用超声细胞粉碎仪超声处理6-7min，超声功率为600w，超声频率为22.5khz，然后依次经0.45pm和0.22pm的微孔滤膜整粒，得到灵芝多糖制剂。
66.采用鱼精蛋白法测定实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂的包封情况，具体如下：
67.将100μl鱼精蛋白溶液(10mg/ml)分别加入到100μl实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂以及100μl空白脂质体中，混匀后静置，加入3ml生理盐水，离心30min(4000rpm)。收集上清，取1ml上清加入1ml生理盐水，以苯酚-浓硫酸法测定其中多糖含量，即为游离的灵芝多糖含量。
68.再分别吸取100μl实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂，加入10％triton-100破乳，混匀后静置3min，加入3ml生理盐水，收集上清，取1ml上清加入1ml生理盐水，以苯酚-浓硫酸法测定其中多糖含量，即为总的灵芝多糖含量。
69.包封率＝(1-游离的灵芝多糖含量/总的灵芝多糖含量)
×
100％
70.载药量＝(总的灵芝多糖含量-游离的灵芝多糖含量)/卵磷脂和胆固醇的质量之和
×
100％
71.如图1所示，实施例5所得灵芝多糖制剂的包封率和载药量最高，而在高温状态下，实施例5所得灵芝多糖制剂表现出优秀的耐热性能，保护原料药受热分解，可有效的延缓药物分解，避免其氧化变质。
72.采用实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂对鸡外周血淋巴细胞增殖测定。选择2月龄蛋公鸡，无菌心脏采血10ml，枸橼酸钠抗凝，将抗凝血与d-hank’s液稀释等量混合，然后慢慢加在鸡淋巴细胞分离液上层，4℃500g离心20min，吸取中间层细胞，用d-hank’s液混匀，重新洗涤2遍，收集沉淀细胞，并活细胞计数，用rpmi1640液调整约为5
×
106个/ml。然后将上述细胞分为两部分，一部分单独加入96孔培养板，100μl/孔，另一部分加入96孔培养板，80μl/孔，每孔再加cona20μl，同时加入实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂，并设空白对照孔(只加细胞培养液)、cona对照孔(细胞培养液加cona)。37.5℃5％co2条件下培养，44h后每孔加入20μl的mtt液，继续培养4h，取出，并1000g离心，弃上清，每孔加100μl dmso，震荡5min，待沉淀完全溶解，用酶联免疫仪检测570nm处的吸光度。
73.采用实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂对鸡脾脏淋巴细胞增殖测定。无菌取60日龄蛋公鸡脾脏，剔除包膜和脂肪组织，小心研磨过200目筛，用d-hank’s液稀释，小心加在淋巴细胞分离液上层，500g离心15min，吸取中间层细胞。用d-hank’s液重新混匀，500g离心20min，重复3遍，活细胞计数，用细胞培养液调整约为5
×
106个/ml。然后将上述细胞分为两部分，一部分单独加入96孔培养板，100μl/孔，另一部分加入96孔培养板，80μl/孔，每孔再加cona20μl，同时加入实施例5和对比例所得灵芝多糖制剂，并设空白对照孔(只加细胞培养液)、cona对照孔(细胞培养液加cona)。37.5℃5％co2条件下培养，44h后每孔加入20μl的mtt液，继续培养4h，取出，并1000g离心，弃上清，每孔加100μl dmso，震荡5min，待沉淀完全溶解，用酶联免疫仪检测570nm处的吸光度。
74.如图2所示，实施例5和对比例的a570值显著大于对照组时，表明灵芝多糖制剂能显著促进鸡外周血和脾脏的淋巴细胞增殖，能促进机体的细胞免疫和体液免疫，从而提高机体的抗病毒感染能力；而实施例5的a570值又优于对比例，从侧面证实实施例5所得载药量更佳。
75.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。