一种生物技术炮制何首乌的组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及经生物技术处理中药及中药加工炮制技术，特别是涉及中药何首乌经酶解、微生物发酵，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.何首乌是传统中医补益药，属于廖科植物（polygonum multiflorum thunb）的干燥块根。味苦、甘、涩，性温，归肝肾经，功效补益精血、解毒、截疟、润肠通便。现代药理研究显示其有抗衰老、抗炎、保肝等作用。临床上，生何首乌主要用于治疗疮痈、瘰疠、风疹、肠燥便秘等病症；制何首乌用于治疗血虚，眩晕耳鸣，须发早白等虚症；何首乌作为中药饮片及中成药的组成成分在临床与民间都被广泛应用。近年来，由何首乌及含何首乌的制剂引起的不良反应也日益增多，引起广泛关注，主要表现为药物性肝损伤（dili）。传统应用中，何首乌药材从未因为毒性而引起关注，但近年来，有关何首乌对肝脏毒性作用的临床案例报道日益增多，作为以“天然和安全”著称的中药，其潜在的毒性也成为国内外研究的热点。何首乌在世界各地广泛分布，并在中国已有几个世纪的使用历史，它的乌发、补益肝肾、抗衰老等作用和低毒性被普遍报道并受到重视。但是，在一项统计中发现，何首乌对大部分过量和长期服用何首乌等相关药物的病人有肝毒性，可以引起不同程度的肝损伤甚至死亡。
3.现代研究发现何首乌含有蒽醌类、二苯乙烯苷类、黄酮、鞣质、微量元素等多种成分，中药经加工炮制后，改变了药性以及内在成分的质和量，可更好地发挥中药的优势。
4.现在基本明确何首乌特异质肝损伤的易感物质及条件致毒机制。研究发现何首乌中顺式二苯乙烯苷(cis-sg)是何首乌诱导肝损伤的主要易感成分，主要通过调控ppar-γ等通路活性诱发肝损伤，反式二苯乙烯苷(trans-sg)则通过增强免疫活性加重cis-sg诱发的肝损伤，从而证实了何首乌肝损伤是机体免疫炎症、何首乌中免疫促进物质和肝损伤易感成分三者协同所导致的。


技术实现要素：

5.为克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物技术处理生何首乌的组合物及其应用，将优选的几种菌种，加入经预处理的何首乌中，利用生物酶、微生物生长活动产生活性物质，实现对何首乌成分的结构性修饰，以达到提高药效和降低毒性的目的。
6.生物酶专一性强，可以有目的的分解目标性成分，微生物在生长代谢过程中产生各种酶，尤其是有益菌群可以对中药成分进行代谢、转化，可以比一般的物理或化学的中药炮制手段更大地增强或调整药性，从而提高中药疗效，降低毒副作用，扩大中药适应症。
7.根据何首乌的成分特点、选择淀粉酶、酵母菌以及人体肠道有益菌群对中药何首乌进行生物转化处理，作用温和，安全性高。
8.本发明所述的生物技术处理生何首乌的组合物，将生何首乌粉碎、浸泡、提取、酶解，酵母菌发酵、复合益生菌发酵、提取浓缩后制得，具体步骤如下：1）粉碎：取干燥的生何首乌粉碎至90-110目；
2）浸泡：加入生何首乌质量的10-20倍水浸泡0.5-2.0小时，得到生何首乌水浸混悬液；3）提取：将生何首乌水浸混悬液在115℃-121℃条件下，加热提取30-50分钟，得到水提液；4）调节ph值：将步骤3）得到的生何首乌水提液，用氢氧化钠或氢氧化钙调节ph值至6.0-7.0；5）酶解：将步骤4）得到的料液，在温度为85-90℃时，按生何首乌的干重每克生何首乌加入100个标准单位的耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀，并维持温度85-90℃，取样检测，使碘试液不再变蓝，得到酶解的何首乌混合液；国际生化协会酶委员规定，1分钟内将1微摩尔的底物转化为产物的酶量定为1个单位，称为标准单位。
9.6）活性干酵母发酵：将步骤5）得到的酶解的何首乌混合液在温度降至25-35℃时，加入活性干酵母，加入量为生何首乌干重的0.5-1.0%，并保持温度25-35℃发酵2-6小时；7）灭菌：将步骤6）得到的发酵后的生何首乌混合液， 加入葡萄糖、蛋白胨、酵母粉，混合均匀，用氢氧化钠调整ph值为7.0，115℃灭菌40分钟；所述的葡萄糖加入量与生何首乌混合液的比例为1.0-1.5g/100ml；蛋白胨加入量与生何首乌混合液的比例为0.3-0.7g/100ml，酵母粉加入量与生何首乌混合液的比例为0.1-0.3g/100ml；8）接种：将步骤7）得到的灭菌生何首乌混合液，在温度降至37℃时，分级接种两种或两种以上预培养好的菌种；所述的菌种选自乳杆菌和双歧杆菌，接种量分别为体积百分比0.5%-2.0%；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌（as1.1854）、德氏乳杆菌(as1.1480)、植物乳杆菌（as1.19）、唾液乳杆菌（cicc 23175）、副干酪乳杆菌（cgmcc 1.2468）、干酪乳杆菌（cgmcc 1.3113）和鼠李糖乳杆菌（cgmcc 1.104）中的至少一种；所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌（cgmcc 1.5090）、短双歧杆菌（as 1.2213）、长双歧杆菌（cicc6195）、动物双歧杆菌（cgmcc 1.3003）、青春双歧杆菌（cgmcc1.2190）和婴儿双歧杆菌（cicc 6069）中的至少一种。
10.上述菌种为公开的已知常规菌种，可在中国典型培养物保藏中心（cctcc）（中国，武汉）或中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc）（中国，北京）或者中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)（中国，北京）获得；9）发酵：将步骤8）得到的已接种的生何首乌混合液，在36-39℃环境下，按常规发酵条件培养5-10天，ph值达到3.34时结束发酵；10）提取、浓缩：将步骤9）得到的发酵完成的生何首乌混合液加热至沸10分钟，冷却后离心，转速4500rpm，离心5-8分钟，上清备用；再取发酵体积二分之一的水，加入到沉淀中，提取，加热至沸1.0小时，冷却后离心，转速4500rpm，离心5-8分钟，合并两次离心液，减压浓缩至每毫升含0.25克生何首乌；115℃，20分钟灭菌，即得。
11.本发明的另一个目的在于提供本发明生物技术处理炮制的生何首乌的组合物在制备含有何首乌成分的药物中的应用，根据用途不同，涉及制备生物技术炮制生何首乌的中药配方颗粒，或提取分离生物技术处理炮制生何首乌的有效成分。
12.所述的制备生物技术炮制生何首乌的中药配方颗粒，是将已经发酵好的生物技术处理炮制的生何首乌的组合物进行浓缩、干燥、检测、分装，即得生物技术处理炮制型何首
乌中药配方颗粒。
13.具体包括以下步骤： a、浓缩：将得到的生物技术处理炮制的生何首乌的组合物减压浓缩至固形物含量20g/100ml；b、干燥：将步骤a得到的浓缩液，喷雾干燥；c、检测、分装：将步骤b得到的干燥粉末，检测成分，并按要求规格分装。
14.有益效果：本发明是将中药与现代生物技术、生物工程技术和酶工程技术相结合的一种新的中药炮制方法，是将中药炮制与制备中药配方颗粒有机结合在一起。本发明利用生物技术炮制何首乌的组合物能降低生何首导致肝毒的易感成分二苯乙烯苷含量；利用斑马鱼模型研究生何首乌经过生物技术炮制处理的提取液的肝毒性的变化，探讨生物技术炮制转化发酵对何首乌肝毒性的作用。方法：选用发育3 dpf斑马鱼幼鱼，加入不同剂量何首乌未发酵液和何首乌发酵液样品处理72 h，根据各组幼鱼死亡数计算样品72 h 半数致死浓度（lc50）、最小致死浓度（mlc）；在低于致死浓度范围内选取低、中、高三个受试物浓度组，处理发育3 dpf 肝脏荧光转基因斑马鱼，处理72 h，在荧光显微镜下观察肝脏形态，并采集明场和荧光肝脏图片；利用图像处理软件image-pro plus6.0 测量肝脏面积和荧光强度，进行统计分析。结果：10 μl何首乌未发酵处理提取液组斑马鱼肝脏面积、荧光强度均高于对照组，并有显著性差异（p《0.05），10μl何首乌经生物技术发酵炮制液组肝脏荧光面积与对照组相比无显著性差异，实验结果显示生物技术发酵炮制可以降低生何首乌的肝毒性作用。
15.本发明通过现代的生物技术，对传统的中药何首乌进行生物转化，减轻了其肝脏毒性，减轻了药物毒性、避免流失浪费，有效地利用了中药资源。
附图说明
16.图1为本发明利用image-pro plus测量不同处理组斑马鱼肝脏荧光面积与对照组对比图，p《0.05；图2 为本发明利用image-pro plus测量不同处理组斑马鱼肝脏荧光强度与对照组对比图，p《0.05。
具体实施方式
17.以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
18.实施例1：生物技术发酵炮制型何首乌组合物a的制备取中药生何首乌粉(100目）5.0kg，加水50l浸泡1.0 小时，115℃加热提取50分钟，用氢氧化钠调整ph为7.0，温度为90℃时，加入耐高温α-淀粉酶（活力为50000μg）10g，并保持温度85-95℃，期间不断搅拌，取样检测，碘试液不再变蓝。将生何首乌料液温度降至30℃，加入25克活性干酵母，并保持30℃发酵6小时后，加入生何首乌混合液体积的1.0g/100ml的葡萄糖、0.3g/100ml的蛋白胨、0.1g/100ml的酵母粉，用氢氧化钠调整ph为7.0，然后于115℃下灭菌40分钟，温度降至37℃时，接种预培养的体积百分比为2.0%的短双歧杆菌
的菌液，培养5小时后，再接种预培养的体积百分比为2.0%的嗜酸乳杆菌菌液，37℃继续发酵5-10天，发酵转化液ph值降至3.34时结束发酵。将发酵液加热煮沸10分钟，冷却后，4500rpm/min，离心5分钟，分离发酵液，中药残渣再加水25l，加热煮沸提取1.0小时，冷却后，4500rpm/min，离心5分钟，合并离心上清液，减压浓缩至20000毫升，即得生物技术发酵炮制型何首乌组合物a。
19.实施例2：生物技术发酵炮制型何首乌组合物b的制备取中药生何首乌粉(100目）5.0kg，加水100l浸泡，2.0 小时，121℃加热提取30分钟，用氢氧化钠调整ph为7.0，温度为90℃时，加入耐高温α-淀粉酶（活力为50000μg）10g，并保持温度85-95℃，期间不断搅拌，取样检测，碘试液不再变蓝。将何首乌料液温度降至30℃，加入50克活性干酵母，并保持30℃发酵4小时后，加入生何首乌混合液体积的1.5g/100ml的葡萄糖、0.7g/100ml的蛋白胨、0.3g/100ml的酵母粉，用氢氧化钠调整ph为7.0，然后于115℃下灭菌40分钟，温度降至37℃时，接种预培养的体积百分比为2.0%的婴儿杆菌菌液，培养5小时后，再接种预培养的体积百分比为2.0%的鼠李糖乳杆菌杆菌菌液，37℃继续发酵5-10天，发酵转化液ph值降至3.34结束发酵。将发酵液加热煮沸10分钟，冷却后，4500rpm/min离心5分钟，分离发酵液，中药残渣再加水50l，加热煮沸提取1.0小时，冷却后，4500rpm/min离心5分钟，分离发酵液，合并离心上清液，减压浓缩至20000毫升，即得生物技术发酵炮制型何首乌组合物b。
20.实施例3：生物技术发酵炮制型何首乌组合物中药配方颗粒c的制备将实施例2制备的生物技术发酵炮制型组合物b继续减压浓缩至固形物含量20g/100ml，喷雾干燥，检测、包装，即得生物技术发酵炮制型何首乌组合物中药配方颗粒。
21.实验例1：生物技术发酵炮制型何首乌组合物中二苯乙烯苷含量测定实验目的是利用高效液相色谱法观察生物技术发酵炮制生何首乌后，其导致肝毒作用的二苯乙烯苷含量的变化。实验样品为生物技术发酵炮制型何首乌组合物a、b、c，同时以同样浓度提取的生何首乌未经生物技术发酵炮制的只是水提的生何首乌提取液为对照。
22.供试品溶液的制备：分别精密取组合物a和b和同样浓度未经生物技术发酵的同样方法提取的生何首乌a’和b’样品1.0ml，至具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml,称定重量，加热回流30分钟，放冷再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，即得。
23.精密称取组合物c样品0.12g，同时以未经发酵的同样浓度提取的经喷雾干燥制备的样品c’为对照，精密加入稀乙醇25ml,称定重量，加热回流30分钟，放冷再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，即得。
24.对照标准品：二苯乙烯苷用稀乙醇制成0.2080mg/ml溶液，避光操作。
25.色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（25:75）为流动相；检测波长为320nm。
26.精密取对照标准品和供试品各10ul，测定。
27.实验结果见下表：何首乌发酵与未发酵提取液二苯乙烯苷的含量 含量未发酵何首乌a’1.50mg/ml
发酵何首乌a0.892mg/ml未发酵何首乌b’1.54mg/ml发酵何首乌b0.897mg/ml未发酵何首乌c’13.0mg/g发酵何首乌c6.66mg/g从实验结果中可以看出，经过生物技术益生菌发酵炮制后，何首乌中的导致肝脏毒性的易感成分二苯乙烯苷含量明显降低。
28.实验例2：基于斑马鱼模型对生物技术发酵炮制型何首乌组合物肝毒作用的影响目的：利用斑马鱼模型研究何首乌未经生物技术发酵转化液与何首乌经生物技术发酵转化液的肝毒性差异，探讨生物技术发酵转化对何首乌肝毒性的作用。方法：选用发育3 dpf斑马鱼幼鱼，加入不同剂量何首乌未发酵液b’和何首乌发酵液样品b处理，处理72 h，根据各组幼鱼死亡数计算样品72 h 半数致死浓度（lc50）、最小致死浓度（mlc）；在低于致死浓度范围内选取低、中、高三个受试物浓度组，处理发育3 dpf 肝脏荧光转基因斑马鱼，处理72 h，在荧光显微镜下观察肝脏形态，并采集明场和荧光肝脏图片；利用图像处理软件image-pro plus6.0 测量肝脏面积和荧光强度，进行统计分析。
29.材料与仪器材料：野生型ab斑马鱼和肝脏绿色荧光转基因斑马鱼为山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台提供；受试样品置于4℃，实验时用培养水稀释。phenylthiourea ( ptu)购自sigma公司。 仪器：szx16 型荧光显微镜及dp2-bsw图像采集系统(日本olympus公司)；斑马鱼养殖饲养设备(北京爱生科技公司)；恒温光照培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）。
30.根据mlc ~lc50附近范围内等距设定三个样品浓度进行肝脏毒性实验。在受精卵发育3dpf（days post fertilization）时，在体视显微镜下挑选正常的肝脏荧光斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔8枚，加入各浓度组样品溶液，加入0.003%(w/v)ptu，用培养水加至终体积为2ml。对照组加入培养水和0.003%(w/v)ptu。每组两个重复孔，然后加盖，置于光照培养箱(28℃)进行孵育，每24 h换一次液。处理72 h后，将鱼吸出用浓度为0.3%(w/v)三卡因麻醉1min，调整为侧位，在荧光显微镜下拍照。利用image-pro plus6.0 测量肝脏面积和荧光强度，进行统计比较。
31.统计分析采用spss13.0对实验数据进行统计分析，用独立样本t-test比较各组间均值的差异，p＜0.05为有显著性差异，p＜0.01为有极显著性差异。
32.实验结果设定两样品原液的加入量为6、8、10μl，终体积2ml。处理3 dpf肝脏荧光斑马鱼72 h，拍照，并利用image-pro plus软件测量肝脏荧光面积和荧光强度，结果如图1和图2所示。
33.结果：10μl何首乌未发酵液组斑马鱼肝脏面积、荧光强度均高与对照组，并有显著性差异（p《0.05），10μl何首乌发酵液组肝脏荧光面积与对照组相比无显著性差异。实验结果表明，生物技术发酵炮制转化能降低何首乌的肝毒性作用。